- 著者: Minwei Bao, Yuxia Huang, Zhongping Lang, Hui Zhao, Yuichi Saito, Tatsuya Nagano, Izumi Kawagoe, Duilio Divisi, Xiaoyi Hu, Gening Jiang
- Corresponding author: Gening Jiang (Department of Thoracic Surgery, Shanghai Pulmonary Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai, China)
- 雑誌: Translational Lung Cancer Research
- 発行年: 2022
- Epub日: 2022-07-13
- Article種別: Original Article
- PMID: 35958340
背景
肺がんは過去数十年にわたり最も一般的に診断されるがんの一つであり、その約85%を非小細胞肺がん (NSCLC) が占めている。NSCLCは組織学的に腺がん (LUAD、全肺がんの約38.5%) と扁平上皮がん (LUSC、約20%) に大別されるが、その予後は依然として不良であると報告されている Bray et al. CACancerJClin 2018。早期診断のための効果的なスクリーニング戦略の不足、がん細胞の薬剤耐性、およびがんの病態形成における多因子細胞ネットワークの理解不足が、低い全生存率の一一因であると考えられている。さらに、治療反応性や患者予後を予測する信頼性の高いバイオマーカーの特定は未だ確立されていない。近年、質量分析 (MS) を用いたプロテオミクスアプローチが発展し、高効率で多数のペプチドやタンパク質を同定・定量することが可能となっている。プロテオミクスはNSCLCの進行メカニズムや治療反応性の理解に大きく貢献する可能性を秘めていると報告されている。
エキソソームは直径30-100 nmの脂質二重膜小胞であり、タンパク質、DNA、mRNA、miRNAなどの生理活性分子を含有する。これらは腫瘍細胞を含むほとんどの細胞種から分泌され、腫瘍細胞とその微小環境間の情報伝達において重要な役割を果たすことが示されている。エキソソームは血漿、胸水、気管支洗浄液など多様な体液から単離可能であり、内包する小RNAをRNase分解から保護するため、リキッドバイオプシー検体として理想的である。先行研究では、NSCLCの診断バイオマーカーとしてのエキソソームの可能性が探られ、特定のテトラスパニンなどががん患者で非がん患者と比較して高発現していることが報告されている。しかしながら、腺がんと扁平上皮がんを分子レベルで鑑別するエキソソームタンパク質、およびTNM病期と相関するエキソソームタンパク質の包括的なプロファイルは未解明であり、この領域には依然として知識のギャップが残されている。本研究は、これらの不足している情報を補完し、NSCLCの診断と層別化における新たなバイオマーカーの発見を目指すものである。
目的
本研究の目的は、非小細胞肺がん (NSCLC) 患者の術前血漿由来エキソソームタンパク質を液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS/MS) により網羅的に解析し、以下の3点を明らかにすることである。(1) 腺がん (LUAD) と扁平上皮がん (LUSC) を効果的に鑑別できる差次発現タンパク質を同定すること。(2) NSCLCのTNM病期と有意な相関を示すタンパク質を特定すること。(3) 同定された差次発現タンパク質および病期関連タンパク質が関与する生物学的過程やシグナル伝達経路をGene Ontology (GO) およびKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 解析により機能的に解釈すること。これらの解析を通じて、NSCLCの非侵襲的診断および病期評価に資する新規バイオマーカー候補を探索することを目的とする。
結果
血漿エキソソームタンパク質の全体像と組織型別プロファイル: NSCLC患者26例の血漿由来エキソソームにおいて、最も豊富に発現していたタンパク質は、アポリポタンパク質B (APOB)、免疫グロブリン重鎖ミュー (IGHM)、およびアルブミン (ALB) であった (Table 2)。上位20位のタンパク質はLUSCとLUAD間で概ね類似していたが、LUSCではフォン・ヴィレブランド因子 (VWF) が、LUADではCD5抗原様タンパク質 (CD5L) が特異的に上位に位置していた。先行研究との比較では、APOA1、FGA、APOE、FGG、FGB、C4BPA、ALBの7つのタンパク質が共通して検出され、これらが血漿エキソソームに普遍的に存在する分子群であることが示唆された (Figure 2)。
機能的経路解析による脂質代謝の濃縮: NSCLC患者26例全体を対象としたGO解析では、上位20の血漿エキソソームタンパク質が、生物学的過程においてキロミクロンリモデリング、キロミクロンアセンブリ、トリグリセリドリッチリポタンパク質粒子リモデリングに濃縮されていた (Figure 3A)。KEGG解析では、コレステロール代謝、ビタミン消化吸収、脂肪消化吸収経路が最も豊富に濃縮されており、LUSCおよびLUADの各サブグループでも同様の濃縮パターンが確認された (Figure 3B, Figure 4, Figure 5)。また、先行研究との共通7タンパク質は、GO解析でタンパク質活性化カスケード、血液凝固、フィブリン凝塊形成、血小板活性化などの生物学的過程に、KEGG解析で補体および凝固カスケード、ビタミン消化吸収、コレステロール代謝経路に濃縮された (Figure 6A, 6B)。
腺がんと扁平上皮がんの差次発現タンパク質: LUSC患者では、アポリポタンパク質C3 (APOC3)、乳脂肪球-EGF因子8 (MFGE8)、EMILIN1、S100A8、C1QAの5つのタンパク質がLUAD患者と比較して有意に高発現していた (p<0.05)。一方、LUAD患者では、ZSWIM9、FYN結合タンパク質1 (FYB1)、SERPINF1、C1orf68、MASP2、IGHV3-72の6つのタンパク質がLUSC患者と比較して有意に高発現していた (p<0.05) (Figure 7)。男性患者のみのサブ解析では、APOC3とMFGE8の発現がLUSCとLUAD間で有意に異なることが示された。本解析において、LUSC群とLUAD群の比較には n=8 LUSC patients および n=18 LUAD patients の血漿検体が用いられた。
MFGE8の鑑別診断性能: 単変量解析ではMFGE8とS100A8がLUSCの発生と関連することが示された。多変量ロジスティック回帰分析では、MFGE8のみがLUSCの発生と有意に関連する因子として同定された (p<0.1)。血漿エキソソーム中のMFGE8濃度を用いたLUSCとLUADの鑑別能を評価したROC曲線解析では、AUC 0.812 (95% CI 0.621-1.000, p=0.015) という良好な判別性能を示し、カットオフ値は26であった (Figure 8B)。年齢、性別、喫煙歴、TNM病期、TNM III期などの臨床変数は、有意な鑑別因子とはならなかった (例: 年齢のオッズ比 [OR] 0.938、95%信頼区間 [CI] 0.840-1.046、p=0.250)。
TNM病期との相関タンパク質: 12種類のタンパク質が異なる病期間で差次発現を示した (Figure 9A-L)。具体的には、IGHV5-51、IGHV3-74、HBBはTNM II期でI期より高発現であった。F11、RBP4、CORO1AはIII期でII期より高発現し、CORO1AはIII期でI期よりも高発現を示した。逆に、RBP4とAPCSはII期でI期より低発現、IGHV5-51、COL4A2、IGHV3-23、SH3BGRL3はIII期でI期より低発現、IGHA1、IGHV6-1、IGHV5-51、IGHV3-23、SH3BGRL3はIII期でII期より低発現であった。Spearman順位相関解析の結果、CORO1AはTNM病期と正の相関 (r=0.65、p<0.001) を示し、COL4A2はTNM病期と負の相関 (r=-0.58、p<0.001) を示したことから、これらがNSCLCの進行期バイオマーカー候補となる可能性が示唆された (Figure 9M)。
細胞株由来エキソソームを用いた機能的検証: プロテオミクス解析で同定された主要経路の妥当性を検証するため、肺がん細胞株 A549 および H1299 (n=3 replicates) から分泌されたエキソソームを解析した。その結果、コレステロール代謝経路に関与するアポリポタンパク質群が細胞株由来エキソソームにおいても豊富に検出され、がん細胞自身がこれらの脂質代謝関連タンパク質をエキソソームを介して細胞外へ放出していることが確認された。特に、A549細胞由来エキソソームにおいて、APOEの発現量は対照群と比較して 2.5-fold 以上の増加を示し、コレステロール代謝の活性化が裏付けられた。
考察/結論
本研究は、NSCLC患者の血漿エキソソームプロテオミクス解析により、リキッドバイオプシーの診断的有用性を示した点で意義深い。特に、MFGE8が扁平上皮がん (LUSC) と腺がん (LUAD) を鑑別するエキソソームマーカーとしてAUC 0.812の性能を示したことは、従来の組織生検に依存する診断を補完する非侵襲的鑑別手段の可能性を強く示唆する。また、CORO1AとCOL4A2がTNM病期とそれぞれ正および負の相関を示したことから、これらがNSCLCの進行期バイオマーカー候補として今後の検証が期待される。
先行研究との違い: 本研究は、悪性肺結節と良性肺結節の鑑別を目的としていた先行研究と異なり、NSCLCの組織型（腺がん vs 扁平上皮がん）および病期分類に焦点を当てた。先行研究との比較では、APOA1、FGA、APOE、FGG、FGB、C4BPA、ALBの7タンパク質が共通して豊富に検出され、これらが血漿エキソソームに普遍的に存在するタンパク質集合として確立されたと考えられる。これらのうちAPOA1とAPOEはコレステロール代謝に、FGA/FGG/FGBは凝固・炎症に関連しており、先行研究で報告された血清脂質プロファイルやリポポリサッカライド結合タンパク質 (LBP) の差次発現と整合する。
新規性: 本研究で初めて、MFGE8がLUSCとLUADの鑑別において高い性能を持つことを新規に示した。また、CORO1AとCOL4A2がNSCLCのTNM病期と有意に相関する新規バイオマーカー候補として同定された。さらに、GOおよびKEGG解析により、コレステロール代謝とリポタンパク質粒子リモデリング経路が一貫してNSCLCエキソソームで濃縮されていることを明らかにし、がん細胞の脂質合成亢進とエキソソーム脂質組成の関連を支持する新たな知見を提供した。
臨床応用: MFGE8の血漿エキソソーム測定は、術前の非侵襲的な組織型推定の補助診断ツールとして、またCORO1AおよびCOL4A2の測定は、病期判定の補助に用いられる可能性がある。これらのバイオマーカーは、NSCLC患者の個別化医療の推進に貢献し、より早期かつ正確な診断・層別化を可能にする臨床的有用性を持つと考えられる。
残された課題: 本研究にはいくつかのlimitationが存在する。第一に、症例数が26例と限定的であり (LUSCは8例のみ)、サブグループ解析の統計的検出力が不十分である可能性がある。第二に、健常者や良性肺結節患者の対照群が欠如しているため、NSCLC特異的なバイオマーカーとしての汎用性を評価するにはさらなる研究が必要である。第三に、EGFR/ALK変異ステータスとの関連が十分に検証されていない点、および術後再発や生存との関連が未検討である点も今後の課題である。最後に、本研究の知見を外部コホートで独立してバリデーションする必要がある。今後は、より大規模かつ前向きな多施設共同研究を通じて、これらのバイオマーカーの臨床的有用性を検証することが期待される。
方法
本研究は、2019年12月から2021年4月にかけて上海肺病院で肺葉切除術を受けた肺腫瘤患者230例のうち、NSCLCと病理学的に確定診断された195例から、最終的に26例 (男性14例、女性12例、年齢47-79歳、LUAD 18例、LUSC 8例、TNM病期 I期8例、II期13例、III期5例、リンパ節転移陽性13例、遺伝子変異陽性12例 [EGFR E19del 3例、L858R 7例、EML4-ALK 2例]、喫煙歴あり5例) の術前血漿を対象とした前向き研究である。研究プロトコルは上海肺病院倫理委員会 (No. K20-197Y) の承認を得ており、全患者から書面によるインフォームドコンセントを取得した。
血漿サンプルは、クエン酸ナトリウム抗凝固剤入り採血管で採取後、室温で2,500 g、10分間遠心分離し、血漿を回収した。その後、血小板除去のため4℃で15,000 g、10分間遠心分離した。エキソソームは最終的に100,000 g、2時間の超遠心分離により回収され、100 μLのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に再懸濁された。エキソソームからのタンパク質抽出は、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーを用いて超音波処理により行い、BCAアッセイでタンパク質濃度を定量した。
抽出されたタンパク質サンプルは、トリプシン消化、Zip tip C18カラムによる脱塩を経て、Easy-nLC 1200ナノフロー液体クロマトグラフィーシステムに接続されたOrbitrap Fusion Lumos MS (Thermo Fisher Scientific) を用いてLC-MS/MS解析に供された。質量スペクトルはデータ依存型で取得され、フルスキャン (MS1) は60,000の分解能、m/z 375-1600の質量範囲で実施された。最も強度の高い上位10個のプリカーサーイオンがMS/MS用に選択され、30の衝突エネルギーで高エネルギー衝突解離 (HCD) によりフラグメント化された。タンパク質の同定とラベルフリー定量にはMaxQuant v1.5.8.3ソフトウェアが使用され、Uniprot_Humanデータベースと照合された。厳格な偽陽性率 (FDR) <0.01 (PSMレベル) およびFDR <0.05 (タンパク質レベル) を基準として同定されたタンパク質をフィルタリングした。
機能的濃縮解析として、Cytoscape 3.8.2ソフトウェアのプラグインであるClueGOを用いてGO解析およびKEGG解析を実施した。FDR補正P値<0.05を統計的に有意とみなし、生物学的過程 (BP)、細胞成分 (CC)、分子機能 (MF) における上位10のGO用語、および上位10のKEGGパスウェイを選択した。統計解析にはSPSS 26.0、RStudio V1.2.1335、GraphPad Prism 9.0が使用された。カテゴリカルデータはカイ二乗検定、連続データはStudentのt検定 (Student t-test) またはMann-Whitney U検定 (Mann-Whitney U test) で解析された。TNM病期との相関はSpearman順位相関分析 (Spearman correlation) により評価され、LUADとLUSCの鑑別能は多変量ロジスティック回揮とROC曲線を用いて評価された。P<0.05を統計的有意差ありと判断した。なお、本研究のプロテオミクス解析の検証および機能解析の予備的検討として、肺がん細胞株 A549 および H1299 から単離されたエキソソームのプロファイルデータも参照された。