- 著者: Hanbyoul Cho, Joon-Yong Chung, Sunghoon Kim, Till Braunschweig, Tae Heung Kang, Jennie Kim, Eun Joo Chung, Stephen M. Hewitt, Jae-Hoon Kim
- Corresponding author: Stephen M. Hewitt (NCI/NIH); Jae-Hoon Kim (Yonsei University)
- 雑誌: BMC Cancer
- 発行年: 2014
- Epub日: 2014-12-15
- Article種別: Original Article
- PMID: 25510288
背景
子宮頸癌は世界中で女性に2番目に多く発生する悪性腫瘍であり、年間約273,200人の死亡を引き起こしている。特に開発途上国において最も一般的な腫瘍である Sankaranarayanan et al. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2006。高リスク型ヒトパピローマウイルス (HPV) (タイプ16および18) の持続感染が、HPV関連前癌病変および子宮頸癌の主要な病因であることが示されている Clifford et al. Br J Cancer 2003。子宮頸癌の大部分は子宮頸部上皮内腫瘍 (CIN) に由来するが、性器HPV感染の大部分は臨床的に検出されず、10〜16ヶ月で自然に消失する。ごく一部のみが浸潤性子宮頸癌へと進行する。持続的なHPV感染が、低悪性度CINから高悪性度CIN、そして最終的に悪性子宮頸癌へと多段階的に進行することがよく知られている Dalstein et al. Int J Cancer 2003。これらの病変の進行は、粘膜免疫応答が悪性細胞を完全に除去できない不利な腫瘍微小環境に起因する可能性がある。
宿主のHPVに対する免疫応答は、感染の転帰を決定する上で極めて重要である。例えば、免疫不全の女性では、HPV感染がより頻繁に検出され、CINの発生率が高く、治療後のCIN再発リスクも高いことが報告されている Ahdieh et al. Am J Epidemiol 2000。自然免疫応答は、粘膜表面における防御の第一線であると考えられている。ナチュラルキラー (NK) 細胞は、自然免疫系の重要な細胞傷害性およびサイトカイン産生エフェクター細胞である Trinchieri Adv Immunol 1989。これらの細胞は、腫瘍特異的抗原の提示なしに、腫瘍細胞やウイルスおよび一部の細菌に感染した細胞を攻撃する能力を持つ。さらに、腫瘍内NK細胞の蓄積は、様々な固形腫瘍患者において生存率の改善と相関することが報告されている Ishigami et al. Cancer 2000。子宮頸癌の場合、Garzetti et al. (1995) はNK細胞活性が予後因子および臨床転帰と関連していることを報告している。
NKG2D (natural killer group 2, member D) は、NK細胞およびCD8+細胞傷害性T細胞を含む様々なT細胞サブセットの表面に発現するC型レクチン様活性化受容体である Raulet et al. NatRevImmunol 2003。ヒトNKG2Dリガンド (NKG2DL) は、MHCクラスI関連鎖 (MIC) ファミリーの2メンバー (MICAおよびMICB) と、UL16結合タンパク質またはレチノイン酸早期転写産物 (ULBP/RAET) ファミリーの6メンバー (ULBP1, ULBP2, ULBP3, RAET1E, RAET1G, RAET1L) から構成される Groh et al. ProcNatlAcadSciUSA 1996。NKG2DLの発現は健常組織では厳しく制限されているが、感染、熱ショック、細胞形質転換など複数の刺激によって誘導され、様々な腫瘍（血液悪性腫瘍、上皮性悪性腫瘍、子宮頸癌、癌細胞株など）で広く発現する。癌化におけるNKG2DL発現を制御するメカニズムは未解明な点が多いが、DNA損傷応答経路の活性化やBCR/ABL癌遺伝子の発現が関与していることが示唆されている Gasser et al. Nature 2005。本研究以前には、子宮頸癌におけるNKG2DL発現の臨床的意義に関する包括的な報告が不足していた。
目的
本研究の目的は、子宮頸癌、前癌病変、および対応する正常子宮頸部上皮の大規模コホートにおいて、6種類のNKG2DL (MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3、RAET1E、RAET1G) の発現を系統的に評価することである。具体的には、これらのNKG2DLの発現パターンが子宮頸癌の進行とどのように相関するかを調査し、病理学的変数および患者の生存転帰との関連を明らかにすることを目的とした。特に、各NKG2DLが子宮頸癌患者の無病生存期間 (DFS) および全生存期間 (OS) に対する独立した予後予測因子となり得るかを、多変量解析を用いて検証することを主目的とした。さらに、HPV感染状態とNKG2DL発現の関連性についても検討した。
結果
患者の臨床病理学的特徴: 患者の臨床病理学的特徴をTable 1にまとめる。低悪性度CIN患者の平均年齢は40.6 ± 9.8歳、高悪性度CIN患者は38.9 ± 11.2歳、子宮頸癌患者は49.4 ± 11.7歳であった。子宮頸癌200例のFIGO病期分布は、I期138例 (69%)、II期53例 (26.5%)、IV期9例 (4.5%) であった。細胞型はWHO基準に従い、扁平上皮癌164例 (82%)、腺癌/腺扁平上皮癌30例 (15%)、その他6例 (3%) であった。HC2で確認されたHPV感染率は、低悪性度CINで78.7% (n=74/94)、高悪性度CINで92.2% (n=226/245)、子宮頸癌で93.9% (n=92/98) であった。
子宮頸癌細胞株におけるNKG2DLの発現確認: IHC解析に先立ち、6種類のヒト子宮頸癌細胞株 (C-33A, CaSki, HeLa, ME-180, SiHa, SUN-17) におけるNKG2DLの発現を、組換えヒトNKG2D-Fcキメラタンパク質を用いたフローサイトメトリーアッセイにより確認した (Figure 1)。NKG2D-Fcキメラタンパク質は細胞表面のリガンド-受容体相互作用を介してNKG2Dに結合し、蛍光標識抗Fc抗体によって検出される。その結果、C-33Aを除く5つの癌細胞株 (n=5 cells) でNKG2DLが発現し、NKG2Dに結合する能力があることが確認され、子宮頸癌がin vivoでNKG2DLを発現するという仮説が支持された。
子宮頸部腫瘍における個々のNKG2DLの発現: 200例の子宮頸癌検体、327例の高悪性度CIN、99例の低悪性度CIN、および541例の対応する非隣接正常子宮頸部上皮組織サンプルにおいて、MICA/MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、RAET1E、RAET1GのIHC解析を実施した (Figure 2)。ULBP3は腫瘍細胞と正常上皮細胞の両方で核に排他的に発現したが、他のマーカーは主に細胞質に発現し、一部の症例では弱い核染色も示された。IHC解析の結果はTable 2に要約されている。TMAには200例の子宮頸癌が含まれていたが、切片作成と染色の複雑さのため、個々のマーカーについては180〜195例のサンプルが解釈可能であった。浸潤性子宮頸癌組織は、CINまたは正常子宮頸部上皮組織と比較して、MICA/B、ULBP1、およびRAET1Eの発現が有意に高かった (すべて p < 0.001)。MICA/B、ULBP1、およびRAET1Eの発現が、正常子宮頸部組織から低悪性度CIN、高悪性度CIN、最終的に浸潤癌へと段階的に増加する傾向は、子宮頸癌の進行段階に対応しており、Spearmanの順位相関 (MICA/B ρ = 0.313, p < 0.001; ULBP1 ρ = 0.285, p < 0.001; RAET1E ρ = 0.136, p < 0.001) において有意であった。一方、ULBP2およびULBP3の発現は、低悪性度CINで正常上皮よりも高かったが、高悪性度CINおよび子宮頸癌では徐々に低下した (それぞれ p = 0.001, p = 0.017)。
NKG2DL間の関連性: MICA/MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、RAET1E、およびRAET1Gの発現間の関連性を決定するため、Spearmanの順位相関解析を実施した (Table 3)。子宮頸癌病変において個々のNKG2DL間の共発現が評価された。MICA/B発現はULBP1 (Spearman’s rho = 0.677, p < 0.001) またはULBP2 (Spearman’s rho = 0.257, p < 0.001) の発現と有意に相関したが、ULBP3 (Spearman’s rho = 0.119, p = 0.112)、RAET1E (Spearman’s rho = 0.044, p = 0.555)、またはRAET1G (Spearman’s rho = -0.042, p = 0.574) とは有意な相関は認められなかった。
NKG2DL発現の予後意義: 最後に、子宮頸癌における個々のNKG2DL発現の予後意義を調査するため、NKG2DL発現と全生存期間 (OS) および無病生存期間 (DFS) との相関を検討した。臨床病理学的および転帰情報は、生存と再発がモニターされた全200例の子宮頸癌患者 (n=200 patients) について利用可能であった。Kaplan-Meierプロットは、MICA/B高発現群 (ログランク p = 0.027) またはULBP1高発現群 (ログランク p = 0.009) の患者は、低発現群と比較して有意に長いDFSを有することを示した (Table 4, Figure 3AおよびB)。一方、RAET1E高発現群 (ログランク p = 0.018) またはRAET1G高発現群 (ログランク p = 0.029) は、DFSが有意に短かった。OSへの影響を個別に解析したところ、ULBP1高発現群は低発現群と比較して有意に長いOSを予測した (ログランク p = 0.007) (Table 4, Figure 3DおよびE)。特に、MICA/B高発現/ULBP1高発現の複合群の患者の生存を他の患者と比較した場合、Kaplan-Meier解析はDFS (p < 0.001, Figure 3C) およびOS (p = 0.001, Figure 3F) の両方で有意な差を示した。
多変量解析による予後因子の同定: Cox多変量比例ハザード解析の結果、進行FIGO病期 (ハザード比 [HR] = 3.60 [95% CI 1.36-9.55], p = 0.010) およびリンパ節転移 (HR = 2.71 [95% CI 1.08-6.79], p = 0.032) がDFSの予後不良独立因子として同定された (Table 5)。一方、ULBP1高発現 (HR = 0.31 [95% CI 0.11-0.86], p = 0.024) およびMICA/B高発現/ULBP1高発現の複合群 (HR = 0.16 [95% CI 0.03-0.70], p = 0.015) は、DFSの予後良好独立因子として確認された。OSへの影響を解析した場合、進行FIGO病期 (HR = 2.77 [95% CI 1.13-7.76], p = 0.025) およびULBP1高発現 (HR = 0.27 [95% CI 0.07-0.97], p = 0.044) が多変量解析において有意な独立予後因子であった。
考察/結論
本研究は、子宮頸癌、前癌病変、および正常組織を含む1,167例の大規模組織マイクロアレイ (TMA) を用いて、6種類のNKG2DL発現を包括的に解析した初めての研究である。特に、ULBP1およびMICA/BとULBP1の複合高発現が、子宮頸癌患者の無病生存期間および全生存期間の独立した予後良好因子であることを多変量解析で明確に示した点に新規性がある。
先行研究との違い: 先行研究では、Textor et al. (2008) が少数の子宮頸癌検体 (n=15) でMICA発現の上昇を示していたが、ULBP2は正常外子宮頸部組織で強く発現していたと報告しており、本研究のULBP2の発現パターンとは対照的であった。また、Li et al. (2009) は卵巣癌においてMICA/BおよびULBP2の高発現が予後不良と関連すると報告しており、同一のNKG2DLが癌種や組織微小環境によって相反する予後影響を示す可能性を示している。本研究の結果は、NKG2DL発現の予後意義が癌種によって異なることを示唆するものであり、これはNKG2DLが組織特異的なシグナルやサイトカイン微小環境との相互作用を介して異なるNKG2D応答を誘起することで説明される。
新規性: 本研究で初めて、MICA/B、ULBP1、およびRAET1Eの発現が、正常子宮頸部組織から低悪性度CIN、高悪性度CIN、最終的に浸潤癌へと進行するにつれて段階的に増加することを示した。この知見は、MICA/BおよびULBP1のアップレギュレーションが子宮頸癌の悪性形質転換に伴って生じることを示唆する。さらに、NKG2DLの発現は腫瘍間で不均一であり、すべてのリガンドが同じ腫瘍で高発現するわけではないことも明らかになった。この不均一性は、NKG2DLが異なるプロモーターを持ち、多様なストレス応答経路に応じて独立して発現する能力、およびマイクロRNA (miR-20a, miR-93, miR-106bなど) による転写後制御が関与している可能性が考えられる。
臨床応用: 本研究の知見は、子宮頸癌の臨床評価における予後診断ツールとしてのNKG2DLの潜在的な有用性を示唆する。特に、ULBP1またはMICA/BとULBP1の複合発現を免疫組織化学で評価することは、既存の病期やリンパ節転移情報と独立した予後情報を提供し得る。これらのNKG2DLは、子宮頸癌の治療およびサーベイランスにおける潜在的なマーカーとして、また、浸潤性子宮頸癌を発症するリスクが高い前癌病変 (CIN) を特定するためのスクリーニングにも活用できる可能性がある。FIGO病期やリンパ節転移情報と組み合わせた複合スコアリングシステムへの応用が期待される。
残された課題: 本研究の限界として、NKG2DL発現の癌化における経時的変動を前向きに検討していない点が挙げられる。また、可溶性NKG2DLの循環レベルと予後との関連性、NK細胞浸潤との相関解析、および他の婦人科癌への応用可能性の検証が今後の検討課題として残されている。RAET1EやRAET1Gの高発現が単変量解析で無病生存期間の不良と関連した機序については、RAET1Eが膜貫通領域を欠く可溶性アイソフォーム (RAET1E2) を産生し、NKG2Dを介したNK細胞傷害活性を抑制するという報告 (Cao et al., 2007) が有力な説明となる。これは、腫瘍細胞が免疫選択圧下でRAET1E/Gを高発現する一方で、NKG2Dシグナルを回避する可溶性型を大量産生することで免疫逃避するという二重メカニズムを示唆する。
方法
患者と腫瘍サンプル: 本研究の対象は、1996年3月から2010年3月にかけて延世大学校江南セブランス病院で外科的切除を受けた子宮頸癌患者200例および子宮頸部上皮内腫瘍 (CIN) 患者426例である。追加のパラフィンブロックは、韓国教育科学技術省のバイオ・医療技術開発プログラムを通じてKorea Gynecologic Cancer Bankから提供された。全患者は子宮頸癌またはCINの組織学的診断を受けており、子宮頸癌患者は国際産婦人科連合 (FIGO) 病期分類システムに従って臨床的に病期分類された。子宮頸癌患者はタイプ3根治的子宮全摘術と骨盤リンパ節郭清術を受け、再発リスクが高い場合 (リンパ節転移、傍子宮浸潤、切除断端陽性など) にはプラチナ製剤ベースの同時化学放射線療法が追加された。年齢、Hybrid Capture® 2結果、手術手技、生存期間、生存状態などのデータは医療記録から収集された。治療奏効は、RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, version 1.0) に従って、CTまたはMRIによって評価された。腫瘍サイズ、細胞型、腫瘍グレード、リンパ節転移に関するデータは病理報告書から得られた。患者からインフォームドコンセントを得て組織サンプルが収集され、本研究は江南セブランス病院の倫理委員会および米国国立衛生研究所のヒト被験者研究室によって承認された。
組織マイクロアレイ (TMA) の構築: ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックから、原発性浸潤性子宮頸癌またはCIN患者626例および対応する非隣接正常子宮頸部上皮541例の組織コアが、手動組織アレイヤーMTA-1 (Beecher Instruments Inc.) を用いてレシピエントパラフィンブロックにアレイされた。正常子宮頸部組織コアは、癌細胞から離れた同じブロックの部位、または十分な正常上皮細胞を含む別のブロックから採取された。各症例について、ドナーブロックのヘマトキシリン・エオシン (H&E) 染色切片から代表的な腫瘍領域が慎重に選択された。患者のドナーブロックの選択された領域から、マッチした腫瘍検体と正常上皮サンプルからなる直径1.0 mmのコアが4つ採取された。TMA上の腫瘍組織の存在はH&E染色で確認された。50番目の切片ごとに、5μm厚の切片が複数枚ミクロトームで切断され、TMAスライドのH&E染色が腫瘍細胞の存在について検査された。
細胞培養: ヒト子宮頸癌細胞株は2つの供給源から入手された。C-33A、CaSki、HeLa、ME-180、SiHaはAmerican Type Culture Collection (ATCC) から、SUN-17はKorean Cell Line Bank (KCLB) から入手された。CaSki、HeLa、ME-180、SUN-17細胞はRPMI 1640で、C-33AおよびSiHa細胞はDMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) でin vitro培養された。両培地には10%ウシ胎児血清、50 units/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM非必須アミノ酸が補充され、細胞は37°C、5% CO2下で培養された。
フローサイトメトリー解析: in vitroフローサイトメトリー解析のため、2 × 10^5個の腫瘍細胞を0.5 μgの組換えヒトNKG2D Fcキメラ (R&D systems) とともにインキュベートし、その後PE標識抗ヒトFc二次抗体 (BD Bioscience) を検出抗体として使用した。FACScan解析にはCELLQuestソフトウェア (Becton Dickinson Immunocytometry System) が使用された。
免疫組織化学 (IHC): MICA/MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、RAET1E、RAET1Gの免疫組織化学染色は、ストレプトアビジン-ビオチンペルオキシダーゼ法を用いて実施された。TMA切片へのIHC適用に先立ち、全切片で免疫組織化学染色条件が試験された。簡単に述べると、TMA切片はキシレンで脱パラフィン化され、下降アルコール勾配を通して再水和された。内因性ペルオキシダーゼ活性は、3% H2O2中で10分間インキュベートすることによりブロックされた。抗原性を回復させるため、切片はpH 9の抗原賦活化バッファー (Dako) に浸漬され、スチーム圧力調理器 (Pascal, Dako) で20分間加熱された。ただし、ULBP1およびULBP2のスライドは、高圧で20分ではなく10分間加熱された。非特異的染色をブロックするため、切片はProtein Block (Dako) で20分間処理された。切片は抗MICA/MICB抗体 (Novus Biologicals; マウスモノクローナル抗体, クローン6D4, 1:50で120分)、抗ULBP1抗体 (Sigma-Aldrich; ウサギポリクローナル抗体, Cat.# HPA007547, 1:50で120分)、抗ULBP2抗体 (R&D systems; ヤギポリクローナル抗体, Cat.# AF1298, 1:50で30分)、抗ULBP3抗体 (Abcam; マウスモノクローナル抗体, クローンMM0594-6E12, 1:500で120分)、抗RAET1E抗体 (Novus Biologicals; マウスポリクローナル抗体, Cat.# H00135250-B01, 1:2000で4°Cで一晩)、および抗RAET1G抗体 (Novus Biologicals; マウスポリクローナル抗体, Cat.# H00353091B01, 1:1000で4°Cで一晩) とともにDako autostainer plus (Dako) でインキュベートされた。一次抗体の検出には異なるシステムが使用された。MICA/MICBおよびULBP3にはDako EnVision + Dual Link System-HRP (Dako)、ULBP1、RAET1E、RAET1GにはDako EnVision FLEX+ (Dako)、ULBP2にはDako LSAB®2 System-HRP (Dako) が使用された。染色はDAB +キット (3,3’-ジアミノベンジジン; Dako) を用いて可視化され、その後ヘマトキシリンで軽く対比染色された。スライドはカバーされ、光学顕微鏡 (Axioplot, Carl Zeiss) で観察された。一次抗体を省略することにより陰性対照が処理され、TMAには大腸癌陽性対照組織が含まれた。
IHC染色の評価: NKG2DL染色の評価には、各コアに2つのスコアが割り当てられた。(a) 染色強度 (染色なし、0; 弱い染色、1+; 中程度の染色、2+; ほとんどの細胞で強い陽性染色、3+) および (b) 陽性染色された上皮細胞の割合 (染色陽性細胞なし、0; 25%未満の細胞が陽性染色、1+; 25-50%の細胞が陽性染色、2+; 50-75%の細胞が陽性染色、3+; 75%を超える細胞が陽性染色、4+)。全体的なタンパク質発現スコアは、強度と陽性率のスコアを乗算して算出された (全体スコア範囲、0-12)。IHC染色スコアは、その後、低発現 (癌検体の平均スコア以下) と高発現 (癌検体の平均スコア超) に二分された。スライドは臨床情報なしでスコアリングされ、報告された最終的な免疫染色スコアは、組織マイクロアレイの解析経験を持つ2人の独立した病理医の平均値であった。
統計解析: 統計解析はSPSSバージョン18.0 (SPSS Inc.) を用いて実施された。異なるグループにおけるNKG2DLの染色スコアの差の統計的有意性は、Mann-Whitney検定およびKruskal-Wallis検定によって算出された。全生存曲線および無病生存曲線はKaplan-Meier法によって作成され、生存曲線間の差はログランク検定によって算出された。関連する臨床共変量の独立した有意性を決定するために、Cox比例ハザードモデルが多変量解析に用いられた。すべての場合において、p値 < 0.05が統計的に有意であると見なされた。