- 著者: Ioannis Mitroulis, Klara Ruppova, Baomei Wang, Lan-Sun Chen, Michal Grzybek, Tatyana Grinenko, Anne Eugster, Maria Troullinaki, Alessandra Palladini, Ioannis Kourtzelis, Antonios Chatzigeorgiou, Andreas Schlitzer, Marc Beyer, Leo A.B. Joosten, Berend Isermann, Mathias Lesche, Andreas Petzold, Kai Simons, Ian Henry, Andreas Dahl, Joachim L. Schultze, Ben Wielockx, Nicola Zamboni, Peter Mirtschink, Unal Coskun, George Hajishengallis, Mihai G. Netea, Triantafyllos Chavakis
- Corresponding author: Ioannis Mitroulis; Triantafyllos Chavakis (Technische Universität Dresden, Dresden, Germany)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2018
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 29328910
背景
Trained innate immunity (TI) は特定の微生物刺激 (β-glucan, Candida albicans, BCG vaccine 等) やワクチンが末梢 myeloid 細胞に sustained な functional change (cytokine 産生亢進・metabolic reprogramming) を誘導し、同一・異種病原体への二次刺激に対する response を heighten する現象として確立された ([Netea et al. Science 2016]; [Quintin et al. CellHostMicrobe 2012])。Pathogen-associated molecular pattern (PAMP) や cytokine が monocyte / macrophage 上で aerobic glycolysis を駆動する metabolic adaptation の機序は Cheng et al. CellMetab 2014 の mTOR-HIF-1α 軸研究で部分的に解明されてきた。
しかし、循環単球の生存期間がわずか 数日 (約 1-7 日) に過ぎないにも関わらず、TI の効果は 数週間から数ヶ月 持続する点は長らくパラドックスであった (= 「短寿命 myeloid 細胞のみでは TI の長期効果を説明できない」 という未解明の課題)。骨髄 hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) が炎症・感染・iatrogenic myeloablation 等の stress に応答して proliferation / myelopoiesis を増大させ ([Trumpp et al. 2010])、IL-1β や GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) が myeloid lineage commitment を駆動する ([Pietras et al. 2016]) ことは知られていたが、TI が HSPC レベルで sustained adaptation を引き起こす機序的証拠は手薄 であった。さらに、HSPC 内部での aerobic glycolysis が LT-HSC の quiescence 維持に必要であり ([Simsek et al. 2010]; [Takubo et al. 2013])、cholesterol accumulation が myeloid lineage skewing を促進する ([Murphy et al. NatImmunol 2011]; [Yvan-Charvet et al. 2010]) という HSC 代謝制御の知見が controversial に蓄積していたが、これらが TI と統合的に作用する経路は不足していた。本論文以前は、TI を「成熟末梢 myeloid 細胞の機能的記憶」 として狭く定義する枠組みが主流で、骨髄 progenitor 階層を含めた拡張モデルは未提示であった。
目的
β-glucan (prototypical trained-immunity-inducing agonist) 投与モデルを用いて、骨髄 HSPC レベルでの adaptation が trained immunity の integral component かを検証し、(1) 関与する signaling pathway (特に IL-1β, GM-CSF)、(2) HSPC 内の代謝適応 (glucose・cholesterol)、(3) 二次刺激 (LPS) への beneficial response、(4) chemotherapy (5-FU・cyclophosphamide) 誘発 myelosuppression への防御効果、を機序的に解明する。
結果
β-Glucan 24 時間で HSPC 拡張と myeloid-biased subset 増加 (n=11-12 mice / group)：β-glucan 単回 i.p. 投与の 24 時間後 に、LSK と MPP の cell number / frequency が PBS 対照と比較して有意に増加した (p<0.01-0.0001, Fig 1A-C, n=11 (PBS) vs n=12 (β-glucan) mice)。LT-HSC の総数は不変だが cell-cycle 解析で S/G2/M phase 進入が増加し、myeloid-biased CD41⁺ LT-HSC frequency が約 2-3 倍に増加 (Fig 1F-G, n=5 mice/group, p<0.05)。MPP subpopulation の frequency 解析で myeloid-biased MPP3 (Flt3⁻CD48⁺CD150⁻LSK) が PBS 対照に対し有意増加した一方、lymphoid-biased MPP4 (Flt3⁺) は不変であった (Fig 1D-E)。一方 ST-HSC は cell number / frequency 共に減少し、HSC pool が静止状態 (quiescence) から増殖・分化フェーズへ shift していることが示唆された。
7-28 日にわたる sustained 効果と transplantation での lineage bias 検証 (n=10 recipient mice/group)：β-glucan 7 日後 には LSK, MPP, LT-HSC cell number 増加・MPP3 frequency 増加・MPP4 frequency 減少・CD41⁺ LT-HSC frequency 増加・GMP cell number と GMP/MyP 比率の増加 (CMP は相対的減少) が認められ (Fig 2A-F, n=6 mice/group, p<0.001)、β-glucan 28 日後 にも GMP cell number 増加と MPP4 frequency 減少が persistent に維持された (Fig 2G-I, n=5 mice/group, p<0.05)。CD45.1/CD45.2 BMT 実験 (Fig 2J-K) では β-glucan 28 日後の LT-HSC を移植した recipient (CD45.1⁺) の末梢血 で 12 週後に Gr1⁺CD11b⁺ myeloid 細胞の proportion が PBS 群比で有意増加、CD19⁺ B 細胞 proportion が対応して減少 (n=10/group, p<0.01)。Peripheral chimerism は両群間で差なく、reconstitution potential 差ではなく真の lineage bias であることが確認された。
Single-cell qPCR による myeloid-biased LT-HSC subpopulation の同定 (n=42 cells per condition)：β-glucan 24 時間後の LT-HSC の single-cell qPCR (n=42 cells/condition) を hierarchical clustering で解析した結果、3 cluster に分かれ、β-glucan 処理群は cluster #2 (activated cell-cycle program) への association が増加した。Cluster #2 は Mki67 / Ccna2 / Ccnb2 / Cdc20 / Cdk2 / Cdk6 (S/G2/M cyclins と CDK) + 分化マーカー Itga2b (CD41) / Cd34 / Cd48 の発現上昇、T 細胞分化 TF Gata3 の発現低下を示した (Fig 3A-C)。CD41⁻ vs CD41⁺ LT-HSC を分けた解析では Cdc20・Ccnb2・Cdkn2d (cell-cycle)、Meis1・Gata1・Gfi1b・Gata2 (myeloid TF)、Itga2b・Cd34・Cd48 の発現上昇が CD41⁺ LT-HSC でのみ 観察され、β-glucan が myeloid-biased CD41⁺ LT-HSC を予測的に標的にすることが定量的に示された (Fig 3D-E)。
Bulk RNA-seq + GSEA で代謝経路 reprogramming を同定 (n=3-4 mice / group, FDR=0.05)：β-glucan 7 日後 LT-HSC の RNA-seq で 1,683 個の differentially expressed genes (DEG, FDR=0.05) を同定 (n=4 PBS, n=3 β-glucan, Fig 5A)。IPA で upregulated 経路として glycolysis, cholesterol biosynthesis, mevalonate pathway および innate immune signaling が overrepresented、downregulated 経路として lymphocyte development が overrepresented (Fig 5B)。Myeloid lineage markers (Csf2rb, Elane, Mpo) と myelopoiesis TF (Cebpe, Id1, Id2) が upregulated、lymphoid markers (Ms4a1, Il7r, Il2ra, Vpreb1, Rag1) と lymphopoiesis TF (Pax5, Ebf1, Irf4, Spib, Lef1) が downregulated (Fig 5C-D)。GSEA で glycolysis と cholesterol homeostasis gene sets が β-glucan 群で有意に正の相関 を示し (Fig 5E)、glycolytic enzymes Hk3 / Pfkp / Pkm, pentose phosphate pathway (PPP) rate-limiting enzyme G6pdx, cholesterol pathway rate-limiting enzyme HMG-CoA reductase (Hmgcr), LDL receptor (Ldlr) が upregulated、cholesterol efflux transporter Abca1 が downregulated (Fig 5F)。Seahorse 解析で β-glucan 24h 群の Lin⁻cKit⁺ cells で basal ECAR と maximal ECAR (oligomycin 後) が約 1.5-2 倍に増加、glycolytic reserve も拡大 (Fig 5G, n=5 mice/group, p<0.01)、この代謝活性化は 7 日後にも persistent (Fig 5I)。
Lipidomics による cholesterol ester 蓄積と CD131-IL-3Rβ 軸 (n=4 mice/group)：Shotgun lipidomic analysis (Lin⁻cKit⁺ cells, 24h, n=4/group) で β-glucan 群は cholesterol esters (CEs) と shorter (34-36 carbon)・低不飽和 acyl chain (0-2 double bond) 脂質が増加、長鎖 (38-42 carbon)・多価不飽和脂肪酸 (arachidonic acid 20:4 含む) PCO/PEO plasmalogens が減少した (Fig 6D-H, PCA で β-glucan vs PBS 有意分離 p=0.028)。Metabolomics で arachidonic acid・linoleic acid 代謝産物 (leukotriene B4, 9,10-epoxyoctadecenoic acid 等) が減少。Cholesterol efflux 抑制と biosynthesis 亢進により CD131 (IL-3/GM-CSF receptor common β subunit, IL-3Rβ) 発現が CD131⁺ LSK / MPP / LT-HSC で有意増加 (Fig 7J-K, p<0.01)、下流の pSTAT5 (phospho-STAT5) 増加 が LSK で確認 (Fig 7L)、myeloid-skewing シグナルの分子的基盤が定量的に示された。
IL-1β-glycolysis-cholesterol-GM-CSF 統合経路の pharmacological dissection：BM extracellular fluid の cytokine 解析で IL-1β と G-CSF が β-glucan で有意上昇、IFN-γ・IL-6・IL-10・IL-12p70 は不変 (Fig 7A, n=10/group, p<0.01)。IL1RA (anakinra) 投与で β-glucan 誘発の (1) LT-HSC cell-cycle 進行、(2) MPP3 frequency 増加、(3) ECAR 増加、(4) day 7 の HSPC / GMP 拡張がすべて阻害された (Fig 7B-D, F-I, n=5/group, p<0.01)。Ex vivo IL-1β 直接処置 (LSK 24 hr) で ECAR と glycolytic reserve が有意増加 (Fig 7E, p<0.01, n=5 cultures/group)、IL-1β → glycolysis の direct causal link が確立された。2-DG (2-deoxyglucose, hexokinase 阻害) 併用で β-glucan 効果が部分阻害 (Fig 7G-I, n=5/group, p<0.05)、atorvastatin (HMG-CoA reductase 阻害) で LSK / MPP 数と GMP frequency 減少 (Fig 7M-P, p<0.05)、anti-GM-CSF 中和抗体 で β-glucan 依存的な HSPC 拡張が同様に減弱 (Fig 7Q, p<0.05)。
生理的利益: LPS 二次チャレンジ応答改善と chemotherapy 防御 (n=10-16 mice/group)：β-glucan 28 日後の LPS 単回投与 (Fig 4A-D, n=10/group) で LSK・MPP の pool 拡張が PBS 群より顕著に増強され、γ-H2AX⁺ LT-HSC (DNA damage marker) の frequency が β-glucan trained 群で有意減少 (p<0.01)、replication stress からの protection が示された。Cyclophosphamide 反復投与 (Fig 4E-G, n=10/group) で末梢血 white blood cell (WBC) と Gr1⁺CD11b⁺ granulocyte 数が β-glucan 群で各 round の day 4 時点で有意増加 (p<0.05)。5-fluorouracil (5-FU) suicide assay (Fig 4H-I, n=16 mice/group) では β-glucan 群の生存率が PBS 群比で有意改善 (log-rank Mantel-Cox p<0.05)、5-FU 投与 14 日後の γ-H2AX⁺ LT-HSC frequency も β-glucan 群で減少 (Fig 4K, p<0.05)、neutrophil recovery が加速した (Fig 4J, n=5/group)。
考察/結論
① 先行研究との違い：これまでの trained immunity 研究 (Quintin et al. CellHostMicrobe 2012, Cheng et al. CellMetab 2014, Netea et al. Science 2016) は末梢 monocyte / macrophage の epigenetic + metabolic reprogramming に集中し、TI の長期効果を末梢成熟細胞の機能変化のみで説明していた。本研究はそれと異なり、β-glucan 効果が 骨髄 HSPC 階層 で sustained adaptation を起こすことを示し、TI を細胞階層 (mature → progenitor) 全体に拡張した点が対照的に重要である。これまでの HSC 代謝研究 (Simsek 2010; Murphy 2011; Yvan-Charvet 2010) は HSC quiescence 維持・cholesterol efflux 不全による myeloid 偏移を独立に報告していたが、本研究は対照的にそれらを TI の枠組みで統合し、IL-1β-glycolysis-cholesterol-GM-CSF/CD131 という一連の causal chain を pharmacological dissection で立証した。
② 新規性：本研究で初めて、(a) β-glucan が myeloid-biased CD41⁺ LT-HSC と MPP3 を 28 日に渡って sustained に拡張すること、(b) BMT 実験で trained LT-HSC が 12 週後も myeloid lineage bias を持続することを示し、TI が真の HSC レベルの adaptation であることが novel に確立された。(c) 1,683 DEG の transcriptomics + lipidomics + Seahorse の統合により glycolysis ↑ + cholesterol biosynthesis ↑ + PPP ↑ + cholesterol efflux ↓ という多面的代謝シグネチャを同定したことも本研究で初めての報告である。(d) IL-1β を中心軸とし、IL1RA・2-DG・atorvastatin・anti-GM-CSF の 4 pharmacological tool を駆使した causal validation も novel な統合 approach として価値が高い。
③ 臨床応用 / Bench-to-bedside / translational：本研究の臨床応用は多岐に渡る橋渡しが直接的に提案される。①化学療法後の骨髄回復促進薬として β-glucan / zymosan / MTP-PE の応用 (5-FU suicide assay で生存率改善実証)、②BCG ワクチンによる新生児敗血症・他感染症防御の機序的根拠の提供、③CAR-T 療法など adoptive HSPC transplantation 前の β-glucan training による graft 機能向上、④抗腫瘍免疫療法 での myeloid lineage 強化 (例: tumor-associated macrophage の polarization 修飾)、⑤ICI 療法での bone marrow myeloid response の最適化、という 5 領域での臨床的有用性・臨床現場での実装可能性を直接示唆する。これは bench-to-bedside の橋渡しとして極めて高い translational 価値を持つ。
④ 残された課題 / 今後の検討 / limitation：①β-glucan 28 日効果の絶対的持続期間 (months scale, year scale で TI HSC 維持されるか) の検証が不足。②本研究は WT C57BL/6 male マウスのみで、aging / 性差 / 他系統での再現性は今後の検討課題。③ヒト臨床試験データ (敗血症予防、chemotherapy 後 HSC 回復) は本研究自体には含まれず、limitation として明示される。④TI に関与する HSC epigenetic landscape (DNA methylation, histone H3K4me3, ATAC-seq) の網羅的解明、⑤他 TI inducers (BCG, zymosan, low-dose LPS, oxidized LDL) と β-glucan 効果の比較研究、⑥ aging・cancer・自己免疫疾患での TI 機序の relevance 評価、⑦CD41⁺ LT-HSC の epigenetic memory が「真の memory」(self-renewal を通じて維持) か「環境誘導継代効果」 かの区別、が future research directions として残された。⑧本論文は extracellular vesicle と直接関係しないため Basic-Extracellular vesicles カテゴリーへの分類は誤分類と考えられ、Basic-Hematopoiesis or Basic-Innate-Immunity への再分類が望ましい (今後の取り扱い課題)。
方法
C57BL/6 WT マウス (male, age-matched) に β-glucan (200 μg / mouse) を単回腹腔内 (intraperitoneal, i.p.) 投与し、対照は PBS とした。24 時間 / 7 日 / 28 日後に骨髄 (BM) を採取し、fluorescence-activated cell sorting (FACS, BD LSRFortessa) で HSPC subpopulation を解析した。Gating strategy: LSK (Lin⁻cKit⁺Sca1⁺) → MPP (multipotent progenitor, CD48⁺CD150⁻LSK) / MPP3 (CD48⁺Flt3⁻CD150⁻LSK, myeloid-biased) / MPP4 (CD48⁺Flt3⁺CD150⁻LSK, lymphoid-biased) / ST-HSC (short-term HSC, CD48⁻CD150⁻LSK) / LT-HSC (long-term HSC, CD48⁻CD150⁺LSK) / CD41⁺ LT-HSC (myeloid-biased subset)、骨髄系前駆細胞は MyP (Lin⁻cKit⁺Sca1⁻) → GMP (granulocyte-macrophage progenitor, CD16/32⁺CD34⁺MyP) / CMP (common myeloid progenitor, CD16/32⁻CD34⁺MyP)。各実験で n=5-12 mice per group を使用。
機序解析: (a) single-cell qPCR を sorted LT-HSC (n=42 cells per condition) で実施、Mki67 / cyclins / TF (Gata1, Gata2, Gfi1b, Meis1, Itga2b/CD41) 等の発現を Hierarchical clustering で評価。(b) bulk RNA-seq を sorted LT-HSC (n=4 PBS, n=3 β-glucan, day 7) で実施し、reads を Liao et al. Bioinformatics 2014 の featureCounts で genomic feature にアサインし、Love et al. GenomeBiol 2014 の DESeq2 で differential expression (FDR=0.05) を解析、Ingenuity Pathway Analysis (IPA) と Gene Set Enrichment Analysis (GSEA, Liberzon et al. CellSyst 2015 の MSigDB hallmark gene sets を使用) で経路解析。(c) Untargeted metabolomics と shotgun lipidomics を sorted Lin⁻cKit⁺ progenitor (n=4 per group, 24 hr) で実施。(d) bioenergetic extracellular flux analysis (Seahorse XFe96) で extracellular acidification rate (ECAR, 解糖系活性) と oxygen consumption rate (OCR, OXPHOS 活性) を測定。Pharmacological intervention として IL-1 receptor antagonist (IL1RA, anakinra), 2-deoxyglucose (2-DG, hexokinase 阻害), atorvastatin (HMG-CoA reductase 阻害), anti-GM-CSF 中和抗体 を併用。
機能評価: (1) CD45.1/CD45.2 congenic system (CD45.1 / CD45.2 = pan-leukocyte CD45 protein の allelic variant、移植後の donor/recipient 細胞識別に使用) での bone marrow transplantation (BMT) を実施し、β-glucan 28 日後 LT-HSC を CD45.2⁺ donor から致死的放射線照射 CD45.1⁺ recipient (n=10 mice per group) に移植、12 週後に末梢血 lineage output (Gr1⁺CD11b⁺ myeloid vs CD19⁺ B 細胞) を解析。(2) LPS (lipopolysaccharide、Gram 陰性菌外膜由来 endotoxin) 二次チャレンジ (β-glucan 28 日後に LPS 単回投与、24 時間後 BM 解析、γ-H2AX⁺ LT-HSC で DNA damage 評価。γ-H2AX = phosphorylated histone H2AX、DNA 二本鎖切断マーカー)。(3) Chemotherapy protection assays: cyclophosphamide repeated rounds (Fig 4E) と 5-fluorouracil (5-FU) suicide assay (n=16 mice per group, Fig 4H)。生存比較は log-rank (Mantel-Cox) test。統計手法は Student t-test / Mann-Whitney U test / log-rank test / one-way ANOVA、p<0.05 を有意とした。