- 著者: Manuel A. Sanchez-Garcia, Pranvera Sadiku, Brian M. Ortmann, Niek Wit, Yutaka Negishi, Patricia Coelho, Ailiang Zhang, Chinmayi Pednekar, Andrew J. M. Howden, David M. Griffith, Rachel Seear, Jessica D. Kindrick, Janine Mengede, George Cooper, Tyler Morrison, Emily R. Watts, Benjamin T. Shimeld, Leila Reyes, Ananda S. Mirchandani, Simone Arienti, Xiang Xu, Alexander Thomson, Alejandro J. Brenes, Helena A. Turton, Rebecca Dowey, Rebecca C. Hull, Hazel Davidson-Smith, Amy McLaren, Andrew Deans, Gourab Choudhury, Katherine Doverman, David Hope, Oliver Vick, Alastair Woodhead, Isla Petrie, Suzanne Green, Nina M. Rzechorzek, Lance Turtle, Peter J. M. Openshaw, Malcolm G. Semple, Duncan Sproul, J. Kenneth Baillie, Alfred A. R. Thompson, David R. Mole, Alex von Kriegsheim, Moira K. B. Whyte, Musa M. Mhalanga, James A. Nathan, Sarah R. Walmsley
- Corresponding author: Sarah R. Walmsley (University of Edinburgh)
- 雑誌: Nature Immunology
- 発行年: 2025
- Epub日: 2025-10-28
- Article種別: Original Article
- PMID: 41152617
背景
急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) は、低酸素血症を特徴とする重篤な疾患であり、好中球が血管および肺胞上皮の損傷を媒介することが知られている。ARDS患者では、急性期において循環好中球の頻度、表現型、機能の変化が報告されており、全身性低酸素が骨髄の骨髄系細胞応答を急性的に形成し、好中球エフェクター機能に影響を与える可能性が示唆されている。好中球は1日あたり約1,000億個という高い回転率を持つ短命な自然免疫細胞であり、骨髄でのエピジェネティックプログラミングが循環好中球の機能に速やかに反映される。
これまでの研究では、BCGワクチン接種やβ-グルカン投与が骨髄の造血幹前駆細胞 (HSPC) のヒストンH3リジン4トリメチル化 (H3K4me3) を増加させ、好中球の長期的機能強化 (訓練免疫) を誘導することが報告されていた。この訓練免疫は、顆粒球単球前駆細胞 (GMP) の拡大とクロマチンアクセシビリティの変化を介して生じることが示唆されている。例えば、Mitroulis et al. Cell 2018は、GMPの変調が訓練免疫の不可欠な要素であることを示し、またMoorlag et al. (Cell Rep 2020) はBCGワクチン接種が好中球の長期的な機能再プログラミングを誘導することを報告している。しかし、全身性低酸素という急性障害刺激が、短命な好中球の長期的機能変化を誘導し得るかどうか、またそのエピジェネティック機序は未解明であった。特に、これまでの研究ではGMPが訓練免疫の主要な骨髄前駆集団と考えられていたが、より分化段階が進んだ好中球特異的前駆細胞集団 (proNeu1、proNeu2、preNeu) との関係は検討されていなかった点が知識のギャップとして残されていた。
さらに、末梢組織における低酸素は、組織損傷を増悪させる過炎症性好中球応答を促進することが示されているが、中心的な再プログラミング機構が、これらの損傷応答を克服し、疾患耐性を促進するために活性化され得るか否かは不明であった。宿主抵抗性と疾患耐性のバランスを長期的に変化させる中心的な機構が、循環好中球コンパートメントの適応不良な再プログラミングを維持する可能性も考慮する必要がある。Watts et al. (J Clin Invest 2021) は、低酸素がマウス好中球のタンパク質スカベンジングを促進し、中心炭素代謝を維持することを示しており、低酸素が好中球機能に与える影響の複雑性が示唆される。また、Ballesteros et al. Cell 2020は、組織環境が好中球の運命をどのように共選択するかを報告しており、好中球の多様な機能的適応が示唆される。本研究は、ARDS生存患者における好中球の長期的機能障害の有無と性質を評価し、全身性低酸素がその主要因となるかを健常者の高地暴露モデルと動物実験で検証するとともに、骨髄における持続的H3K4me3消失の責任前駆細胞集団を同定し、N末端ヒストン3クリッピングとの関連を解明することを目的とした。このアプローチにより、急性低酸素性傷害が好中球免疫に与える長期的な影響の分子メカニズムを明らかにすることが期待されたが、その詳細な分子機構には不足している点が多かった。
目的
本研究の目的は、まずARDSから回復した患者における好中球の長期的機能障害の有無と性質を詳細に評価することである。次に、この機能障害が全身性低酸素によって引き起こされる主要な要因であるかを、健常ボランティアの高地暴露モデルおよびマウスの全身性低酸素モデルを用いて検証する。さらに、低酸素によって誘導されるH3K4me3の持続的な消失が、骨髄内のどの好中球前駆細胞集団に起源を持つのかを同定し、そのメカニズムとしてN末端ヒストン3 (H3) クリッピングが関与しているかを解明する。最終的に、BCGワクチン接種がこの低酸素誘発性の好中球機能障害を部分的に回復させる可能性を評価し、新たな治療戦略の基礎を築くことを目指す。
結果
ARDS生存患者の好中球における持続的機能障害: ARDSから回復した患者の循環好中球は、退院3〜6ヶ月後も異常な活性化状態を示した。具体的には、CD66bの有意な上昇とCD62Lの低下が持続し (n=14〜15、それぞれp<0.05)、未熟好中球の拡大は認められなかった (Fig. 1c,d)。LC-MSによる代謝解析では、ピルビン酸および乳酸の減少とアセチルCoAの持続的な増加が検出された (Fig. 1e)。4,000種以上のタンパク質プロファイリングでは、細胞骨格関連タンパク質の増加とアズール顆粒カーゴ (MPO、ELANEなど) の有意な減少が確認された (Fig. 1f)。機能面では、α-1-アンチトリプシン脱顆粒の低下 (n=4、p<0.05)、LPS刺激による生存延長、およびS. aureus SH1000のオプソニン貪食能の有意な低下 (n=4、p<0.05) が観察された (Fig. 1g-i)。これらの機能障害は、退院後6ヶ月以内に二次感染の微生物学的陽性例が高頻度に存在することと関連していた (Fig. 1j)。
H3K4me3のゲノムワイドな消失とその遺伝子標的: ChIP-seq解析により、ARDS生存患者の好中球では、治療群に関わらずゲノムワイドなH3K4me3の広範な消失が確認された (Fig. 3b,c)。Gene Ontology (GO) およびReactome経路濃縮解析では、好中球脱顆粒がH3K4me3レベルが差次的に変化する最上位の経路として同定された (Fig. 3d)。個別遺伝子レベルでは、顆粒タンパク質および成熟関連遺伝子 (LYZ、SERPINA1、RAB3D、FOS)、カルシウムシグナリング遺伝子 (CALM1、CALM2、CALM3、CALR)、炎症応答遺伝子 (IFNAR2、IRF7、CXCR2、TNFRSF1A) においてH3K4me3の顕著な消失が検出された (Fig. 3e-g)。これらの結果は、ARDSが好中球の主要な活動に関連する遺伝子のH3K4me3エピゲノムプロファイルを変化させ、機能的な自然免疫記憶につながる可能性を示唆している。
高地誘発低酸素血症がARDSと同様のH3K4me3消失を再現する: 全身性低酸素が好中球応答の持続的な再プログラミングに寄与するかを検証するため、7日間の高地暴露 (4,775 m) を受けた健常ボランティアの縦断的コホート研究を実施した。このコホートには20名の健常ボランティアが含まれた。高地暴露後3〜4ヶ月の健常ボランティアでも、CD66bの増加とCD62Lの低下、顆粒カーゴタンパク質の減少、MPO放出障害 (n=9、p<0.05)、およびS. aureus SH1000のオプソニン貪食能低下 (n=14、p<0.05) がARDS生存患者と類似した形で観察された (Fig. 4d-g)。ChIP-qPCRにより、顆粒タンパク質/成熟関連遺伝子 (LYZ、RAB3D)、カルシウムシグナリング遺伝子 (CALM1、CALR)、炎症応答遺伝子 (IFNAR2、CXCR2) でH3K4me3の有意な消失が確認され (Fig. 4h-j)、全身性低酸素がヒト好中球のエピジェネティック再プログラミングの主要因であることが実証された。
H3K4me3消失はGMPではなくproNeu/preNeuに起源を持つ: 低酸素応答におけるH3K4me3レベルの持続的変化を駆動するメカニズムを解明するため、C57BL/6Jマウスの全身性低酸素モデルを用いた。S. aureus SH1000皮膚感染モデルにおいて、7日間の全身性低酸素暴露後5週間の再酸素化期間を経たマウスは、膿瘍サイズと細菌数が増加し、抗菌応答が障害されることを確認した (n=9 mice、Fig. 5b,c)。低酸素肺傷害モデルでは、成熟骨髄好中球のH3K4me3レベルが免疫ブロットで低下していることを確認した (Fig. 5e)。
以前の報告では、β-グルカンや慢性炎症に対する長期的な好中球再プログラミングのメカニズムとして、GMPの拡大とクロマチンアクセシビリティの変化が示されていた。しかし、Cut&Runシーケンス解析による骨髄GMPのH3K4me3プロファイルでは、低酸素暴露後5週間においてGMPにはH3K4me3の持続的変化が認められなかった (Fig. 5g)。この結果は、GMPが訓練免疫の責任集団とされていた先行研究とは対照的である。
そこで、好中球系統のより下流に位置する増殖性前駆細胞集団が、低酸素によるH3K4me3の持続的減少の原因であると仮説を立てた。1週間の低酸素暴露後3ヶ月再酸素化マウスの骨髄では、proNeu1、proNeu2、preNeu集団においてH3K4me3/H3比の有意な低下がフローサイトメトリーで検出された (n=3〜4 mice/群、各集団でp<0.05) (Fig. 5h-j)。これらの集団の細胞頻度自体は正常対照マウスと同等であったことから、エピジェネティック状態の変化が選択的に生じていることが示された。これらの知見は、好中球にコミットした前駆細胞が、循環細胞で観察される長期的なエピジェネティック再プログラミングの基盤であることを示している。
N末端H3クリッピングが低酸素による長期的H3K4me3消失の機序である: 急性低酸素が好中球前駆細胞においてH3クリッピングを誘導し、H3K4me3の長期的な消失をもたらすかを検証した。FACSで単離したpreNeuをキモトリプシン消化後、LC-MS/MSで解析したところ、低酸素暴露マウスのpreNeuでは、総ヒストンペプチド数および絶対H3量は正常対照と同等であった (Fig. 6b,c)。しかし、N末端H3ペプチドKQTARKSTGGKAPRKQ (K4トリメチル化部位リジンを含む) の量が低酸素条件で有意に消失しており (n=4 replicates、p<0.05)、H2BのN末端ペプチドでは同様の消失が認められなかった (Fig. 6d)。この結果は、低酸素が部位特異的なH3 N末端切断を誘導し、K4メチル化の基質リジンを物理的に除去することで、H3K4me3の持続的消失をもたらすことを示唆している。このH3クリッピングは、H3K4me3の約0.5 log2FCの低下を引き起こした。
BCGワクチン接種が低酸素誘発性H3K4me3消失と感染脆弱性を部分的に回復させる: 低酸素誘発性の好中球機能障害と感染脆弱性に対するBCGワクチン接種の効果を評価した。低酸素肺傷害後の再酸素化マウスにBCGを接種 (8日目または21日目) すると、5週間後のS. aureus皮膚感染モデルでBCG未接種群 (n=8 mice) と比較してBCG群 (n=17 mice) の膿瘍コロニー形成単位 (c.f.u.) が有意に低下し (p<0.05)、病原体コントロールの改善が示された (Fig. 6f)。BCG接種マウスでは、循環好中球のH3K4me3量がフローサイトメトリーで部分的に回復しており (n=3 mice/群)、H3K4me3の動的変化がin vivoでの感染アウトカムと相関することが実証された (Fig. 6g)。これらの結果は、低酸素が好中球のH3K4me3を長期的に抑制し、感染アウトカムに影響を与える新たな役割を明らかにし、このH3K4me3の消失が自己再生能力を持つ好中球前駆細胞におけるN末端H3クリッピングに起因することを示している。
考察/結論
本研究は、ARDSという急性低酸素性傷害が、短命な好中球に長期的機能変化を誘発するという逆説的な現象の分子機序を解明した。その中核は、全身性低酸素が骨髄の好中球特異的前駆細胞 (proNeu1、proNeu2、preNeu) においてN末端H3クリッピングを誘導し、K4トリメチル化の基質となるリジンを物理的に除去することで、分化後の成熟好中球に至るまでゲノムワイドなH3K4me3消失が持続するというモデルである。
先行研究との違い: 先行研究では、β-グルカンやBCGによる訓練免疫において、GMPがHSPCからH3K4me3の増加を介して好中球機能強化を誘導する主要な骨髄前駆集団と考えられていた (Mitroulis et al. Cell 2018、Moorlag et al. Cell Rep 2020)。しかし、本研究では、低酸素によって誘導されるH3K4me3の消失はGMPでは観察されず、より分化した好中球特異的前駆細胞であるproNeu1、proNeu2、preNeuに起源を持つことが示された点で、これまでの報告とは対照的である。この知見は、訓練免疫における正のエピジェネティック再プログラミングとは異なり、低酸素が引き起こす適応不良な負の再プログラミングが、異なる前駆細胞集団を介して生じることを示唆している。
新規性: 本研究で初めて、全身性低酸素が好中球前駆細胞においてN末端H3クリッピングという不可逆的なヒストン修飾を誘導し、これがH3K4me3の長期的な消失と好中球免疫の機能障害を引き起こすメカニズムであることを新規に同定した。このN末端H3クリッピングは、Cheung et al. (Nat Immunol 2021) が単球からマクロファージへの分化においてCTSG/ELANE/PRTN3依存的H3クリッピングを報告したことと類似しており、組織・系統を超えた普遍的機序の可能性を示唆する。
臨床応用: 本知見は、ARDS生存患者が二次感染リスク増大に直面するという臨床的課題に対し、H3K4me3消失という具体的な免疫記憶メカニズムを提示した点で臨床的意義が大きい。BCGワクチン接種が低酸素誘発性の好中球機能障害を部分的に回復させる可能性を示したことは、疾患後免疫再建戦略の基礎となる。好中球の代謝、エピジェネティック、機能プログラムにおける変化が、ARDS後の新規形成される循環好中球に長期的に維持されるというデータは、疾患状態における好中球の役割を理解する上で重要である。
残された課題: 今後の検討課題として、H3クリッピングを誘導する具体的なセリンプロテアーゼの同定、HIF経路との相互作用の解明、骨髄局所の低酸素が直接的な原因となるのか、あるいは末梢組織からの循環シグナルが骨髄に作用するのかの解明が残されている。また、慢性低酸素性疾患 (COPD、肺線維症など) や重症COVID-19後遺症における同様の機序の検討、および臨床的なBCGワクチン接種プロトコルの最適化が求められる。Kapellos et al. CellRep 2023はCOPDにおける好中球の変化を報告しており、本研究の知見が他の慢性疾患にも適用される可能性を示唆する。本研究は、好中球の再プログラミングが細胞レベルで比較的わずかな変化であっても、集団全体で発現された場合には生物学的に関連する非線形効果に変換される可能性を示唆しており、長期的な好中球性炎症の操作を可能にする治療戦略の開発につながるだろう。
方法
本研究では、ARDS生存患者、健常ボランティアの高地暴露コホート、およびマウスモデルを用いた多角的なアプローチを採用した。
ARDS生存患者研究: Royal Infirmary of Edinburghを含む多施設から、Berlin基準に基づく中等度〜重症ARDSから回復した患者を募集した。退院3〜6ヶ月後に末梢血好中球を採取し、以下の解析を実施した。患者はAPACHE IIスコアに基づいて重症度を評価された。
- 表現型解析: フローサイトメトリーにより、CD66bおよびCD62Lの表面発現を評価した (n=14〜15)。
- 代謝解析: LC-MSを用いて、ピルビン酸、乳酸、アセチルCoAなどの代謝産物レベルを測定した (n=5)。
- プロテオーム解析: LC-MSにより4,000種以上のタンパク質を定量し、細胞骨格関連タンパク質やアズール顆粒カーゴタンパク質の変化を評価した (n=8)。
- 機能アッセイ: α-1-アンチトリプシン脱顆粒 (ELISA、n=4)、LPS刺激による好中球生存試験 (顕微鏡解析、n=7)、および黄色ブドウ球菌 (S. aureus SH1000) のオプソニン貪食能 (フローサイトメトリー、n=4) を評価した。
- エピジェネティック解析: 好中球からH3K4me3 ChIP-seqを実施し、ゲノムワイドなH3K4me3変化をDiffBindで解析した (健常者n=3、非ステロイド投与ARDS生存者n=3、ステロイド投与ARDS生存者n=4)。
高地暴露コホート研究: 健常ボランティア20名 (男性8名、女性12名、平均年齢22歳) を対象に、7日間の高地暴露 (ボリビア、4,775 m) を実施し、3〜4ヶ月後に末梢血好中球を採取した。
- 表現型・機能解析: ARDS生存患者と同様に、CD66b、CD62L発現、MPO放出 (ELISA、n=9)、およびS. aureus SH1000貪食能 (フローサイトメトリー、n=14) を評価した。
- エピジェネティック解析: ChIP-qPCRにより、LYZ、RAB3D、CALM1、CALR、IFNAR2、CXCR2などの主要遺伝子におけるH3K4me3レベルを定量した (n=7〜14)。
マウスモデル研究: 3〜6ヶ月齢の雄C57BL/6Jマウスを使用し、UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act of 1986に準拠して実験を実施した。
- 全身性低酸素モデル: 10% O2環境下で1週間飼育後、5週間または3ヶ月の再酸素化期間を設けた。
- 低酸素肺傷害モデル: LPS吸入後に1週間10% O2暴露し、5週間または3ヶ月再酸素化した。
- 感染モデル: S. aureus SH1000皮下感染モデルを用いて、膿瘍サイズと細菌数を評価した (n=9)。
- H3K4me3解析: 骨髄成熟好中球のH3K4me3レベルを免疫ブロットで確認した。骨髄GMP集団のH3K4me3をCut&Runシーケンスで解析した。proNeu1、proNeu2、preNeu集団の細胞内H3K4me3レベルをフローサイトメトリーで評価した (n=3〜4/群)。
- N末端H3クリッピング解析: FACSで単離したpreNeuをキモトリプシン消化後、timsTOF SCP-LC-MS/MSによりN末端H3ペプチドを定量した (n=4/群)。
- BCGワクチン接種: 低酸素肺傷害後の再酸素化マウスにBCGワクチン (2-8 × 10⁵細菌) またはPBSを静脈内投与 (8日目または21日目) し、S. aureus皮膚感染モデルにおける病原体コントロールと循環好中球のH3K4me3レベルを評価した (n=8〜17)。
統計解析: GraphPad Prism v.10ソフトウェアを用いて統計解析を実施した。データは正規性検定 (Shapiro-Wilk) 後、2群比較にはt検定またはMann-Whitney U検定、多群比較にはANOVAまたはFriedman検定を用いた。p<0.05を有意差ありとした。