- 著者: Michael J. T. Stubbington, Orit Rozenblatt-Rosen, Aviv Regev, Sarah A. Teichmann
- Corresponding author: Aviv Regev (Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA); Sarah A. Teichmann (Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, UK)
- 雑誌: Science
- 発行年: 2017
- Epub日: N/A
- Article種別: Review
- PMID: 28983043
背景
免疫系は、一次・二次リンパ組織および末梢血・リンパ管を循環する多様な細胞系譜からなる複雑な生態系を形成する。この生態系は、抗原受容体 (TCR・BCR) の遺伝的多様性によってさらに複雑化し、その解析は極めて困難であった。従来のフローサイトメトリーやバルク RNA シーケンス (RNA-seq) は、細胞集団の平均的な情報しか提供できず、細胞サブポピュレーションの微細な違い、分化状態の連続的な変化、あるいは組織特異的な適応を捉えることが困難であった。例えば、T helper (Th) 細胞の分類は、Th1、Th2、Th17 といった離散的なサブセットとして理解されてきたが、その間の連続的な状態や可塑性は十分に捉えられていなかった (Shay et al. 2013)。また、腫瘍微小環境における免疫細胞の多様性や機能状態も、バルク解析では平均化されてしまい、個々の細胞が果たす役割の全貌は未解明なままであった。
近年、massively parallel single-cell RNA シーケンス (scRNA-seq) 技術 (例: 10x Chromium、Drop-seq、Smart-seq2) の急速な普及により、数万細胞規模で 1 細胞レベルでの網羅的遺伝子発現解析が実現した (Svensson et al. 2017)。この技術革新は、免疫学の理解を根本から刷新する機会をもたらしている。初期の先駆的な研究では、わずか 18 個のマウス骨髄由来樹状細胞 (BMDC) を用いた scRNA-seq 解析により、LPS 刺激後の主要免疫遺伝子の二峰性発現が明らかになり、細胞レベルの不均一性が初めて定量化された (Shalek et al. 2013)。これは、従来のバルク解析では見過ごされてきた細胞間の多様性が、免疫応答において重要な役割を果たす可能性を示唆した。しかし、これらの技術が免疫学全体に与える影響や、今後の Immune Cell Atlas (ICA) 構築に向けた具体的な展望については、まだ体系的な整理が不足しており、特に細胞状態の連続性や細胞間相互作用の包括的な理解には課題が残されている。
本レビューは Science 358(6359) 号の「Single-Cell Genomics」特集号に掲載されたものであり、自然免疫、適応免疫、抗原受容体解析、および細胞間ネットワークの 4 つの軸から最新の成果を統合している。特に、免疫細胞の分類が M1/M2 や Th1/Th2/Th17 のような二分論的・離散的枠組みから、連続的・動的な細胞状態スペクトルへと更新されつつあることが示唆される。本稿は、これらのギャップを埋め、scRNA-seq が免疫システムの理解にどのように貢献し、将来的にどのような方向性を持つかについて包括的な視点を提供する。
目的
本レビューの目的は、scRNA-seq およびシングルセルゲノミクスの技術的原理と最新の計算手法を概観することである。具体的には、自然免疫細胞 (樹状細胞 (DC)、自然リンパ球 (ILC)、マクロファージ) から適応免疫細胞 (T 細胞、B 細胞、腫瘍浸潤リンパ球 (TIL)) まで、幅広い免疫細胞の単一細胞解析における実証例を提示する。さらに、抗原受容体シーケンスとの統合解析の現状と、Immune Cell Atlas (ICA) 構築に向けた今後の展望について論じる。本レビューは、scRNA-seq が免疫学研究にもたらす変革を包括的に整理し、その概念的意義と将来的な応用可能性を提示することを意図している。
結果
scRNA-seq 技術の多様化と計算解析基盤の確立: scRNA-seq は、初期の少数細胞 (例えば、Shalek et al. 2013 によるマウス BMDC 18 個) から、現在では数百万細胞規模へと急速に拡大している。主要なプラットフォームには、高スループットで UMI (Unique Molecular Identifier) による定量的バイアス補正が可能な droplet-based (10x Chromium、Drop-seq) と、高感度で全長 RNA をカバーする plate-based (Smart-seq2) がある。さらに、CITE-seq (Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing) は DNA バーコード化抗体を用いてタンパク質と RNA の同時計測を可能にする。初期の実験では、LPS 刺激したマウス BMDC 18 個の scRNA-seq 解析により、数百種の主要免疫遺伝子が二峰性発現を示すことが明らかになり、細胞レベルの不均一性が初めて定量化された。さらに、1,700 個のマウス BMDC を 3 種の病原体関連分子パターンで時系列刺激した実験では、細胞の非同期性による不均一性が動的変化の反映であることが示された。質量細胞計 (CyTOF) は 1 細胞あたり数十種のタンパク質を同時検出し、scRNA-seq を補完する。計算手法としては、次元削減 (PCA、UMAP)、クラスタリング、pseudotime 推定 (Monocle など)、RNA velocity が整備され、静的スナップショットから細胞分化の時系列を推定できるようになった (Fig 2A)。Perturb-seq (Perturbational single-cell RNA sequencing) は CRISPR 大規模スクリーンと scRNA-seq を統合し、DC (Dendritic Cell) 活性化における転写因子ネットワーク (制御 vs. 抗ウイルス応答) を解明した (Dixit et al. 2016)。
自然免疫細胞の単一細胞解析: ILC・マクロファージ・DC の多様性: Bjorklund ら (2016) はヒト扁桃から 648 個の ILC (Innate Lymphoid Cell) を単離し scRNA-seq を実施した。非バイアスクラスタリングにより ILC1、ILC2、ILC3、NK 細胞の 4 集団が同定され、各集団の新規マーカー遺伝子に加えて、ILC3 の 3 つの機能的サブセットが発見された。マウス大腸 ILC のマイクロバイオータ条件依存的解析では、ILC1/ILC2/ILC3 各サブセットに加え、ILC1-ILC3 間の可塑的細胞状態が同定された。マウスマクロファージへの Salmonella 感染実験では、細菌の増殖状態に応じた多様なマクロファージ活性化スペクトルが示され、従来の M1/M2 二分類を超えた連続的多様性が確認された。ヒト DC の scRNA-seq 解析 (Villani et al. 2017) では 6 種類の DC サブセットが同定され、うち 1 つの新規サブセットは扁桃・関節リウマチ患者の滑液に存在し、T 細胞と直接近接していることで自己免疫への役割が示唆された。マウス Alzheimer モデルでの microglia scRNA-seq (Keren-Shaul et al. 2017) では、神経変性を抑制する可能性を持つ新規 microglia サブセット (DAM (disease-associated microglia)) が同定された。ゼブラフィッシュとヒトの比較 scRNA-seq により、脊椎動物間で保存された免疫プログラムも解明された。
適応免疫の単一細胞解析: T 細胞・B 細胞・TIL の機能と分化:
- CD4+ T 細胞: TH17 細胞の「病原性」スペクトルが連続的な転写プロファイルとして同定され、自己免疫疾患誘導能との相関が示された (Gaublomme et al. 2015; Wang et al. 2015)。マラリア感染モデルでは、monocyte がケモカインリガンド・受容体ネットワーク経由で CD4+ T 細胞の TH1 方向への分化を規定することが scRNA-seq で予測され、monocyte 除去実験で検証された (Lönnberg et al. 2017)。
- CD8+ T 細胞・TIL: メラノーマ (Tirosh et al. 2016; n=4,645 細胞解析) では、悪性細胞が患者間多様性の約 80% 超を占める一方、T 細胞・マクロファージなどの非悪性細胞は細胞種別にクラスタリングされた。肝細胞癌 (Zheng et al. 2017) においても TIL (Tumor-Infiltrating Lymphocyte) クローンの拡大度と疲弊状態の関連が解明された。B16 マウスモデルでは特定タンパク質による T 細胞抑制状態の分子機構が示された (Singer et al. 2016)。
- pseudotime 解析: ゼブラフィッシュ造血幹細胞 (n=数百細胞) から終末分化細胞までの分化スペクトルを静的スナップショットから推定することに成功し (Macaulay et al. 2016)、その後 T 細胞発生や TH1/TFH 分化岐路にも適用された (Fig 2B)。T 細胞分化の採算点推定では、Monocle などの pseudotime ツールが全転写プロファイルの連続変化を定量化し、特定のプログラム活性化・終止にかかる時間スケールが細胞モジュールごとに異なることが示された (Setty et al. 2016)。
抗原受容体 (AgR) 解析との統合: クローン動態と転写状態の同時解読: scRNA-seq から TCR (T cell receptor)/BCR (B cell receptor) 配列を同時解読する統合解析が複数実証されている。大腸癌 TIL の TCR シーケンスにより、FOXP3-RORC+ と FOXP3+RORC+ の 2 集団が TCR 配列を共有し共通の祖先細胞を持つことが判明した (Han et al. 2014)。droplet ベース封入と標的 AgR 増幅により数十万個のリンパ球から paired 配列が検出された (Briggs et al. 2017)。Salmonella 感染マウス脾臓 CD4+ T 細胞 (n=多数の独立 IC 解析) では、同一クローン (同一 TCR を持つ姉妹細胞) が TH1 と TFH (T follicular helper) の両細胞運命に分布することが、pseudotime 分岐推定と TCR クローン追跡の統合で示された (Lönnberg et al. 2017) (Fig 3B)。メラノーマサンプル (n=4,645 細胞) では、クローン増殖の程度と T 細胞疲弊状態が相関することが確認された (Tirosh et al. Science 2016)。さらに、複数ドナー由来ペアリング TCR α/β 配列の大規模解析と機械学習により、TCR 配列のみから抗原認識特異性のモチーフを推定できることが示され (Dash et al. 2017; Glanville et al. 2017)、これまでは見えなかった「配列→特異性」の変換が約 80% 精度で予測可能となった (Fig 3C)。
細胞間コミュニケーションと疾患応用: Tirosh et al. Science 2016 によるメラノーマ n=4,645 細胞の単一細胞解析では、悪性細胞は患者間で多様である一方、T 細胞、B 細胞、マクロファージ、内皮細胞などの非悪性細胞は腫瘍起源ではなく細胞種ごとにクラスタリングされることが示された。TCGA (The Cancer Genome Atlas) の数百例規模のバルクデータとの統合により、腫瘍内の CD8+ T 細胞高発現と癌関連線維芽細胞 (CAF) のコンプリメントタンパク質発現の有意な相関 (p<0.05) が予測された。マウスのマラリア感染後 3 日目のマクロファージ、脾臓 CD4+ T 細胞、DC の統合解析では、化学走性リガンド・受容体ネットワーク解析でモノサイトが T 細胞の TH1 分化を支持することが予測され、モノサイト除去実験で検証された (Lönnberg et al. 2017)。Imaging Mass Cytometry による乳がん組織内の免疫細胞空間分布の同定など、空間トランスクリプトミクスとの統合が免疫細胞間相互作用の組織内文脈の理解に重要であることが示された (Giesen et al. 2014) (Fig 4)。scRNA-seq のコストは 2009 年から 10 年間で約 1,000 倍低下し、普及が急加速した。感染症 (CMV、マラリア)、自己免疫 (関節炎、全身性エリテマトーデス (SLE))、がん免疫腫瘍学 (TIL 多様性、チェックポイント応答) における scRNA-seq 応用が活発に進んでいる。ヒト DC の分類においても scRNA-seq は従来の表面マーカー分類を超え 6 種類のサブセットを同定し、そのうち 1 種の新規サブセットが関節リウマチ滑液に存在することで自己免疫との接点が示唆された (Villani et al. 2017)。DAM (disease-associated microglia) の同定など神経免疫学への波及も急速であり、scRNA-seq の疾患適用領域は本レビュー時点で既に免疫系全体を網羅していた。
考察/結論
本レビューは、scRNA-seq が免疫学に「個々の細胞を見る」分解能をもたらし、従来のバルク解析では不可能であった細胞状態の連続性、組織特異的適応、クローン動態、転写サブポピュレーションの解明を実現していることを包括的に示す。
先行研究との違い: 従来の免疫細胞分類は、M1/M2 や Th1/Th2/Th17 のような二分論的・離散的枠組みに限定されていた。これに対し、本研究で示された scRNA-seq 解析は、免疫細胞が連続的かつ動的な細胞状態スペクトルを持つことを明らかにし、これまでの理解とは対照的な、より複雑な細胞多様性を提示した。例えば、ヒト扁桃 ILC 648 個の解析では ILC3 内の 3 つの機能サブセットが同定され、メラノーマ 4,645 細胞解析では TIL 疲弊スペクトルが連続的に存在することが示された。
新規性: 本研究で初めて、pseudotime 解析と抗原受容体 (TCR/BCR) シーケンスの統合により、静的スナップショットから細胞分化の時系列と運命決定の分岐点を推定できる手法論が確立されたことが強調された。マラリア感染モデルでの TH1/TFH 分岐推定とクローン関係の同時解析 (Lönnberg et al. 2017) はその代表例である。また、TCR 配列のみから抗原特異性モチーフを機械学習で推定できることが示されたことは (約 80% 精度)、これまで報告されていない「配列→特異性」の変換予測を可能にする新規な知見である。
臨床応用: これらの進歩は新規治療標的の同定と患者層別化に直結し、特にがん免疫療法における TIL サブセット解析、疲弊状態のモニタリング、およびチェックポイント応答予測に大きな臨床的インパクトをもたらす。TCR 配列からの抗原特異性予測は、将来の TCR-pMHC (peptide-MHC) 特異性予測診断ツール開発の先駆けとなる可能性を秘めている。scRNA-seq のコストは 2009 年以降の 10 年間で約 1,000 倍低下しており、これにより大規模コホートでの多様な疾患状態の scRNA-seq が可能となり、臨床現場での応用が加速すると考えられる。
残された課題: 今後の検討課題として、空間トランスクリプトミクス、CITE-seq (Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing)、TCR/BCR シーケンスの多モダリティ統合をさらに進める必要がある。これにより、細胞間相互作用の組織内文脈をより詳細に理解することが可能となる。また、Immune Cell Atlas (ICA) は Human Cell Atlas の免疫特化部門として、多様な組織・疾患状態・分化段階にわたる包括的参照マップを構築することが期待されるが、その実現には国際的な大規模な共同研究が不可欠である。一塩基多型を自然な細胞バーコードとして利用した多重化解析により費用効率的な大規模コホート scRNA-seq も実現可能であり、白血球計数が「scRNA-seq 定義の細胞種・状態の比率アッセイ」へと進化する臨床診断革新の将来像も示されているが、その標準化と臨床実装にはさらなる研究が残されている。初期の 18 個の BMDC 解析から始まり数百万細胞規模へと拡大したスケールの変化 (約 5 桁以上の規模拡大) は、単なる技術的改良を超え免疫学のパラダイムシフトを象徴しているが、その膨大なデータの統合と解釈には高度な計算手法のさらなる発展が求められる。
方法
本論文はレビュー記事であるため、特定の実験プロトコルやデータ解析手法は記述されていない。代わりに、既存の多数のシングルセルゲノミクス研究を統合し、その技術的進歩、計算手法、および免疫学における応用例を概説している。
情報源: 本レビューの情報源は、免疫学分野におけるシングルセル解析に関する主要な学術論文、特に scRNA-seq の開発と応用に関する研究である。引用文献リストには、Science、Nature、Cell などのトップジャーナルに掲載された、この分野のランドマークとなる研究が含まれる。例えば、初期の scRNA-seq 開発に関する Shalek et al. (2013, 2014) や、メラノーマにおける TIL 解析に関する Tirosh et al. Science 2016 の研究が参照されている。これらの論文は、PubMed および Web of Science などの主要な学術データベースを用いて特定された。
技術的原理の解説: Drop-seq、Smart-seq2、CITE-seq (Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing) などの主要な scRNA-seq プラットフォームの技術的原理が説明されている。これらの技術は、細胞分離、RNA 逆転写、ライブラリ調製、シーケンス、およびデータ解析の各段階で異なるアプローチを採用しており、それぞれ異なる感度、スループット、および情報量を提供する。例えば、droplet-based の技術は高スループットであり、UMI (Unique Molecular Identifier) を用いて定量的バイアスを補正する一方、plate-based の Smart-seq2 は高感度で全長 RNA をカバーする。CITE-seq は、DNA バーコード化抗体を用いてタンパク質と RNA の同時計測を可能にする。
計算手法の解説: scRNA-seq データ解析に用いられる主要な計算手法が紹介されている。これには、次元削減 (例: 主成分分析 (PCA)、UMAP)、クラスタリング、pseudotime 推定 (例: Monocle)、および RNA velocity が含まれる。これらの手法は、高次元の遺伝子発現データから細胞間の関係性を抽出し、細胞分化の連続的な軌跡や運命決定の分岐点を推定するために用いられる。Perturb-seq (Perturbational single-cell RNA sequencing) のような CRISPR 大規模スクリーンと scRNA-seq を統合する手法についても言及されており、遺伝子摂動が細胞状態に与える影響を単一細胞レベルで解析するアプローチが示されている。統計手法としては、ベイズガウス過程潜在変数モデルを用いた次元削減や、ガウス過程の重複混合を用いた分岐する擬時間軌跡の推定などが用いられている。
免疫細胞の解析例: 自然免疫細胞 (ILC (Innate Lymphoid Cell)、マクロファージ、DC (Dendritic Cell)) および適応免疫細胞 (T 細胞、B 細胞、TIL (Tumor-Infiltrating Lymphocyte)) の単一細胞解析における具体的な研究例が多数提示されている。これらの研究は、新規細胞サブセットの同定、細胞分化経路の解明、疾患における免疫細胞の役割の特定など、幅広い知見をもたらしている。例えば、ヒト扁桃からの ILC 解析 (Bjorklund et al. 2016) や、マウス Alzheimer モデルにおける microglia の解析 (Keren-Shaul et al. 2017) が挙げられる。
抗原受容体解析との統合: scRNA-seq データから TCR (T cell receptor)/BCR (B cell receptor) 配列を同時に解読する統合解析の進展が論じられている。これにより、特定のクローンに属する T 細胞や B 細胞の転写状態や分化運命を追跡することが可能となる。
将来展望: Immune Cell Atlas (ICA) の構築に向けた国際的な取り組みや、空間トランスクリプトミクス、多モダリティ統合、および大規模コホート研究の可能性が議論されている。これらの展望は、免疫学研究の今後の方向性を示すものである。