- 著者: Mancy Tong, Julie A. Potter, Gil Mor, Vikki M. Abrahams
- Corresponding author: Vikki M. Abrahams (Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Yale School of Medicine, 310 Cedar Street, LSOG 305C, New Haven, CT 06510, USA; vikki.abrahams@yale.edu)
- 雑誌: The Journal of Immunology
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-05-13
- Article種別: Original Article
- PMID: 31167775
背景
早産は、世界中で年間10%以上の出産に影響を及ぼす一般的な妊娠合併症であり、新生児の死亡率と罹患率の主要な原因である (Goldenberg et al. 2008)。新生児ケアの進歩にもかかわらず、早産は依然として新生児死亡の主要な原因であり、神経発達上の問題や、その後の人生における代謝性疾患および心血管疾患のリスク増加と関連している (Hack and Fanaroff 2000)。自発的早産の原因は完全には解明されていないが、感染症が重要なリスク因子である (McElrath et al. 2008)。絨毛膜羊膜炎は、胎盤および胎児膜 (FMs) の炎症であり、早産の40〜70%で認められ、感染症の存在下で一般的に発生する (Andrews et al. 2006)。早産と関連するいくつかの炎症性サイトカインには、IL-1β、IL-6、およびTNF-αが含まれる (Romero et al. 1992)。絨毛膜羊膜炎は、FMsへの好中球浸潤を特徴とする (Menon et al. 2010)。
好中球は、IL-8などの走化性因子に続いて、感染部位に迅速に動員される短命の免疫細胞である (Kolaczkowska and Kubes 2013)。これらは、食作用、ミエロペルオキシダーゼ (MPO) やエラスターゼなどの抗菌酵素の脱顆粒、および好中球細胞外トラップ (NETs) の放出によって病原体を中和する (Nathan 2006)。NETsは、ヒストンとMPOおよびエラスターゼなどの抗菌酵素で装飾された細胞外クロマチンのネットワークであり、微生物を捕捉して中和する Brinkmann et al. Science 2004。NET放出は、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫感染症に応答して報告されているが、その放出メカニズムは刺激によって大きく異なる (Rochael et al. 2015; Narasaraju et al. 2011; Saitoh et al. 2012; Byrd et al. 2013; Boldenow et al. 2016)。PMAやカルシウムイオノフォアなどの古典的なNET誘導因子は、自殺性NETosisを誘導し、好中球はNET放出後に細胞死を遂げる Fuchs et al. JCellBiol 2007。一方、黄色ブドウ球菌は、好中球がNET押し出し後も生存能力と機能を保持する生存性NETsの放出を誘導することが報告されている (Pilsczek et al. 2010)。
感染症が早産のよく知られた引き金であり、これらの出産におけるFMsで好中球が一般的に観察されるにもかかわらず、FMsにおける好中球機能のメカニズムについてはほとんど知られていない点が未解明であった。妊娠マウスに高用量の細菌LPSまたは大腸菌を投与した先行研究では、好中球の枯渇は早産を予防しないことが示されており、これらの免疫細胞が早産の開始に寄与しない可能性が示唆されている (Rinaldi et al. 2014; Filipovich et al. 2015)。しかし、これらの研究は、好中球が子宮胎盤炎症に寄与することを示している。したがって、FMsにおける好中球機能のメカニズムを理解することは重要である。特に、早産がない場合でも絨毛膜羊膜炎は胎児の健康と発達に深刻な影響を与える可能性があるためである (Burd et al. 2011; Elovitz et al. 2011)。本研究の先行研究では、ヒトFMsが低レベルの細菌LPSに非常に敏感であることが報告されている (Cross et al. 2017)。低用量LPSへの曝露後、ヒトFM外植片は、好中球や他の免疫細胞を母体/胎児界面に動員する可能性のある多くの走化性および炎症性因子を分泌する (Hoang et al. 2014)。しかし、ヒト絨毛膜と好中球の間の相互作用、およびこれが好中球機能にどのように影響するかを調査した研究は、これまで報告されていない点が知識ギャップとして残されている。好中球の動員と蓄積が絨毛膜羊膜炎の主要な特徴であるため、本研究は、LPS曝露後のヒトFMsが好中球の動員、活性化、およびNET形成に及ぼす影響を調査し、関与するシグナル伝達メカニズムを解明することを目的とした。特に、絨毛膜羊膜炎における好中球と胎児膜、そしてNETの相互作用の具体的なメカニズムは未解明であり、特にTNF-αを介した胎児膜と好中球のクロストーク、および下流のシグナル伝達経路 (p38/ERK) の寄与はこれまで十分に解明されていなかった点が知識ギャップとして残されている。
目的
本研究の目的は、LPS刺激ヒト胎児膜 (FMs) が好中球の動員、活性化、およびNETs形成にどのように影響するかを決定し、関与するシグナル伝達メカニズムを解明することである。具体的には、LPS刺激ヒト胎児膜 (FM+LPS) が好中球をリクルート・活性化し、生存性NETs放出を誘導するかどうか、そしてこの過程でTNF-α、p38 MAPK、ERK、および活性酸素種 (ROS) がメカニズム的にどのように連携するかを、ex vivo培養、健常ドナー好中球、および薬理学的阻害剤を用いて体系的に解析する。また、in vivoマウスモデルを用いて、胎盤における好中球の動員とNET放出を検証することも目的とする。本研究では、ヒト胎児膜から得られた条件培地 (FM-CM) を用いて、好中球の遊走、脱顆粒、サイトカイン分泌、NET放出、生存率、食作用、ROS産生、および細胞内シグナル伝達経路の活性化を詳細に評価する。これらの知見は、絨毛膜羊膜炎における好中球の病態生理学的役割と早産への寄与をより深く理解するための基盤を提供することを目指す。
結果
未刺激FM-CMは好中球の遊走と活性化を誘導し、FM+LPSによってさらに増強される: ヒトFMsが好中球を動員できるか、そして感染時にこれが増強されるかを決定するため、好中球を未刺激または低用量LPS刺激FMsからのCMに曝露した。このFM-CMの組成は以前に特徴付けられており、LPS曝露がIL-6、IL-8、TNF-αを含む多くのケモカインおよびサイトカインのFM産生を増加させることを示している (Cross et al. 2017; Hoang et al. 2014)。未刺激FM-CMは、NT対照 (Opti-MEM培地処理好中球) と比較して、好中球遊走を1.6 ± 0.1倍有意に増加させた (n=8ドナーからの好中球を使用)。FM+LPSは、未刺激FM-CMと比較して1.3 ± 0.1倍、NT対照と比較して2.0 ± 0.2倍、これをさらに有意に増強した (p<0.01) (Fig. 1A)。刺激FM-CM中のLPSを対照するため、好中球を低用量LPS単独で処理したが、好中球遊走に有意な影響はなかった (Fig. 1A)。 FM-CMが好中球の活性化も誘導するかを決定するため、好中球の脱顆粒とサイトカイン/ケモカイン分泌を測定した。未刺激FM-CMは好中球MPO脱顆粒に有意な影響を与えなかったが、FM+LPSはNT対照と比較して好中球脱顆粒を1.6 ± 0.1倍有意に誘導した (n=12ドナーからの好中球を使用, p<0.01) (Fig. 1B)。LPS単独では好中球MPO脱顆粒に影響はなかった (Fig. 1B)。ELISAにより、未刺激FM-CMがNT対照と比較して好中球IL-8/CXCL8分泌を5.7 ± 0.9倍有意に増加させることを示した (n=12ドナーからの好中球を使用, p<0.001)。FM+LPSは、未刺激FM-CMと比較して好中球IL-8分泌を8.6 ± 1.0倍、NT対照と比較して42.5 ± 6.0倍、さらに有意に増強した (p<0.001) (Fig. 1C)。対照的に、LPS刺激FM-CMのみが、NT対照に対して好中球TNF-α分泌を118.4 ± 21.6倍誘導した (n=12ドナーからの好中球を使用, p<0.001) (Fig. 1D)。LPS単独では好中球IL-8またはTNF-α分泌に影響はなかった (Fig. 1C, 1D)。マルチプレックス分析はこれらの知見を検証し、未刺激FM-CMがG-CSF/CSF3、IL-6、IL-17、IP-10/CXCL10、およびMCP-1/CCL2の増加したレベルをNT対照と比較して好中球に分泌させることも示した (n=11ドナーからの好中球を使用) (Fig. 2)。上記のすべての因子の分泌は、FM+LPSの存在下でさらに有意に増強された (Fig. 2)。さらに、FM+LPSはGM-CSF/CSF2、GROα/CXCL1、IL-1β、IL-10、IFNγ、MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、およびRANTES/CCL5の好中球分泌を有意に誘導した (Fig. 2)。
未刺激FM-CMはNET放出を誘導し、FM+LPSによってさらに増強される: FM-CMが好中球を動員し活性化できることを示した後、FMsがNET放出を誘導できるかを次に調査した。Fig. 3に示すように、未刺激FM-CMとFM+LPSの両方が、可視化 (Fig. 3A, 3B) および細胞外DNAの定量化 (Fig. 3C) によって決定されるNETsの放出を誘導した。NTまたはLPS対照条件下では誘導されなかった (Fig. 3)。未刺激FM-CMとFM+LPSの両方に応答して好中球によって押し出された細胞外DNAは、NETマーカーであるシトルリン化ヒストン3および好中球エラスターゼと共局在し、NET形成を確認した (Fig. 3A)。未刺激FM-CMは、NT対照と比較してDNA放出を1.3 ± 0.1倍増加させた (n=13ドナーからの好中球を使用, p<0.01) (Fig. 3C)。FM+LPSは、未刺激FM-CMと比較してDNA放出を1.3 ± 0.1倍、NT対照と比較して1.6 ± 0.1倍、さらに有意に増強した (p<0.001) (Fig. 3C)。
未刺激FMとFM+LPSの両方が生存性NET形成を誘導する: 好中球は、好中球機能に異なる下流の結果をもたらす自殺性または生存性経路を介してNETsを形成できる。FM-CMによってどちらの経路が誘導されるかを決定するため、NET放出の動態、好中球生存率、および機能を評価した。FM-CMは刺激後5分以内に迅速なNET放出を誘導したが、自殺性NETosisの古典的な誘導因子であるPMAは30分後にのみ目に見えるNETsを誘導した (Fig. 4A)。安静時FMからのCMに曝露された好中球の合計97.5 ± 0.4%、LPS刺激FMからのCMに曝露された好中球の96.8 ± 0.4%が1時間後もPI陰性であり、未処理好中球と有意差はなかった (n=8ドナーからの好中球を使用)。逆に、好中球をPMAに曝露すると、PI陽性好中球の数が有意に増加した (p<0.001) (Fig. 4B)。さらに、未刺激FMとFM+LPSの両方に好中球を曝露すると、未処理好中球と比較して24時間以上の長期生存率が有意に増加したが (n=10ドナーからの好中球を使用, p<0.05)、PMAは好中球生存率を有意に低下させた (p<0.001) (Fig. 4C)。最後に、NET形成を誘導するために未刺激FMとLPS刺激FM-CMの両方に1時間曝露された好中球は、未処理好中球と比較して食作用能力を保持したが、PMAによる処理は好中球の食作用能力を有意に低下させた (n=6ドナーからの好中球を使用, p<0.001) (Fig. 4D)。
FM+LPSは好中球ROS産生を誘導し、下流のIL-8分泌とNET放出に寄与する: ROS産生は好中球における重要なシグナル伝達メカニズムである (Mitra and Abraham 2006)。FM+LPSは、未刺激FM-CMと比較してROS産生を2.9 ± 0.6倍有意に増加させた (n=6ドナーからの好中球を使用, p<0.05)。未刺激FM-CMによるROSの有意な増加は、NT対照と比較して認められなかった (Fig. 5A)。LPS単独では好中球ROSレベルに影響はなかった (Fig. 5A)。NADPHオキシダーゼ活性化とそれに続くROS産生が、FM+LPSに応答して観察される好中球活性の一部を媒介するかを調査するため、NADPHオキシダーゼ阻害剤であるDPIが用いられた。DPIは、FM+LPSが好中球IL-8分泌を9.0 ± 2.3%増加させる能力を有意に低下させた (n=7ドナーからの好中球を使用, p<0.05) (Fig. 5B)。DPIによって阻害されたFM+LPSによって誘導される他の唯一のサイトカインはIL-17であった (データは示されていない)。DPIは好中球MPO脱顆粒に影響を与えなかったが (Fig. 5C)、FM+LPSに応答したNET放出を22.0 ± 5.4%有意に阻害した (n=7ドナーからの好中球を使用, p<0.05) (Fig. 5D)。DPIの存在下では、FM+LPSに応答したNET放出量は、NT対照からのものと有意差はなかった (Fig. 5D)。
FM+LPSは好中球MAPキナーゼ経路を活性化する: FM-CMに応答した好中球活性化はROSによって部分的にしか媒介されなかったため、FM-CMによって好中球で活性化される細胞内経路を、2つの中心的な炎症経路であるNFκBとMAPKを調査することによって調べた。NT対照条件下での好中球は、NFκB経路の中心的なメディエーターであるp-p65の高い基礎レベルを発現した。p-p65のレベルは、未刺激またはFM+LPSに曝露された好中球で有意に変化しなかった (n=3ドナーからの好中球を使用) (Fig. 6A)。対照的に、FM+LPSは、NT対照と比較してp-p38 MAPK (Fig. 6B) を26.7 ± 4.9倍 (p<0.001)、p-ERK (Fig. 6C) を147.5 ± 67.8倍 (p<0.05)、p-JNK (Fig. 6D) を54.9 ± 30.8倍 (p<0.05)、それぞれ有意に増加させた。また、未刺激FM-CMと比較して、それぞれ13.0 ± 2.8倍、28.7 ± 9.0倍、11.2 ± 4.2倍増加した。
p38 MAPKおよびERKシグナル伝達経路の阻害は、FM+LPSに対する好中球応答を減少させた: MAPKシグナル伝達は、p38、ERK、またはJNKによって媒介され得る。FM+LPSによって好中球の活性化とNET産生を誘導するためにどのキナーゼが活性化されたかを調査するため、特異的阻害剤が用いられた。Fig. 7Aに示すように、特異的p38 MAPK阻害剤であるSB203580は、FM+LPSが好中球の(Fig. 7Ai) IL-8分泌を37.3 ± 4.5%、(Fig. 7Aii) MPO放出を27.3 ± 6.2%、(Fig. 7Aiii) NET放出を12.9 ± 3.8%増加させる能力を有意に低下させた (n=11ドナーからの好中球を使用)。Fig. 7Bに示すように、特異的ERK阻害剤であるSCH772984は、同様にFM+LPSが好中球の(Fig. 7Bi) IL-8分泌を22.7 ± 7.1%、(Fig. 7Bii) MPO放出を24.8 ± 6.9%、および(Fig. 7Biii) NET放出を16.6 ± 3.1%増加させる能力を低下させた (n=9ドナーからの好中球を使用)。対照的に、特異的JNK阻害剤であるSP600125は、FM+LPSに応答した好中球の(Fig. 7Ci) IL-8分泌、(Fig. 7Cii) MPO脱顆粒、または(Fig. 7Ciii) NET放出に影響を与えなかった (n=5ドナーからの好中球を使用) (Fig. 7C)。マルチプレックス分析はまた、p38 MAPKの阻害が、FM+LPSが好中球のIL-6、IL-17、RANTES、およびTNF-αの分泌を増加させる能力を有意に低下させたことを明らかにした (Supplemental Fig. 1)。対照的に、ERK (Supplemental Fig. 2) またはJNK (Supplemental Fig. 3) の阻害は、FM+LPSに応答した好中球のRANTES分泌のみを有意に阻害した。
FM由来TNF-αは好中球MAPKシグナル伝達およびその後の好中球活性化とNET放出を誘導する: TNF-αは、絨毛膜羊膜炎および早産と関連するよく知られた炎症性サイトカインである (Saji et al. 2000; Burdet et al. 2013)。先行研究では、低用量LPSがFMsにTNF-αの高レベル分泌を誘発することが報告されている (Cross et al. 2017; Hoang et al. 2014)。そこで、FM-CM中のTNF-αが絨毛膜における好中球活性化の原因であるかどうかを調査した。これをテストするため、TNF-α中和抗体をFM-CMに添加した。アイソタイプ対照IgGと比較して、抗TNF-α抗体の存在は、FM+LPSが好中球のp-p38 MAPK発現を61.0 ± 6.0% (Fig. 8Ai, 8Aii)、p-ERKを46.6 ± 4.5% (Fig. 8Ai, 8Aiii)、およびp-JNKを61.9 ± 4.1% (Fig. 8Ai, 8Aiv) 誘導する能力を有意に低下させた (n=5ドナーからの好中球を使用)。さらに、対照IgGと比較して、抗TNF-α抗体の存在は、FM+LPSが好中球のIL-8分泌を35.3 ± 3.8% (Fig. 8B)、MPO脱顆粒を26.2 ± 7.7% (Fig. 8C)、およびNET放出を12.7 ± 4.0%誘導する能力を有意に低下させた (n=8ドナーからの好中球を使用) (Fig. 8D)。マルチプレックス分析はまた、FM由来TNF-αの中和が、好中球のGROαおよびTNF-αの分泌を有意に阻害したことを明らかにした (Supplemental Fig. 4)。
in vivoでの胎盤好中球動員とNET放出: in vitroでの知見を検証するため、妊娠マウス (C57BL/6マウス) に低用量LPSまたはPBS (対照) を投与してFM炎症を誘導し (Cross et al. 2017)、胎盤および関連するFM組織で好中球とNETsのマーカーであるMPOとシトルリン化ヒストン3の免疫蛍光法を実施した。免疫蛍光法および形態学的分析により、対照マウス (Fig. 9A, 9B) およびLPS注射マウス (Fig. 9C, 9D) の両方の胎盤で好中球とNETsが同定された。10倍率での免疫蛍光の定量化により、LPS注射マウスの胎盤-FMユニットに動員された好中球が、対照マウス (6.7 ± 0.8好中球/mm^2の胎盤組織, n=3マウス) と比較して有意に多かったことが明らかになった (10.5 ± 0.8好中球/mm^2の胎盤組織, n=6マウス; Fig. 9E)。
考察/結論
早産は世界中で依然として主要な医療負担である。新生児死亡の70%以上を占め、神経発達上の問題や、その後の人生における代謝性疾患および心血管疾患のリスク増加と関連しているにもかかわらず、自発的早産の引き金と病態形成は依然として不明である (Hack and Fanaroff 2000)。FMsへの好中球浸潤は、早産で一般的に観察される絨毛膜羊膜炎の中心的な特徴であるが、母体/胎児界面におけるこれらの免疫細胞の機能、およびFMs自体が好中球の動員と活性化を制御するかどうかは、まだ完全に証明されていない点が残された課題であった。臨床的および実験的研究は、細菌感染、炎症、および早産との相関を示しているが (Kemp et al. 2010; Elovitz and Mrinalini 2004; Cardenas et al. 2011)、早産に関連する同定された微生物は生殖器管または胎盤に共通であることが多く (Aagaard et al. 2014)、単一の原因菌は同定されていない (Ganu et al. 2013)。したがって、本研究では、グラム陰性細菌感染を広くモデル化するために細菌LPSを使用した。ex vivo、in vitro、およびin vivoアプローチの組み合わせを用いて、ヒトFMsと好中球との直接的な相互作用を実証し、FM由来因子が好中球を直接動員・活性化し、好中球の生存能力や下流の機能を損なわない生存性NETsの放出を誘導することを示した。
新規性: 驚くべきことに、以前に特徴付けられた安静時ヒトFM外植片からのCMが、好中球を動員し、限定的な炎症プロファイル (IL-8、IL-6、G-CSF、IP-10、MCP-1) の分泌を誘導し、生存性NET放出を誘導できることを本研究で初めて示した。安静時FMsと比較して、LPS曝露FM外植片由来因子は、好中球の遊走、広範囲の炎症性サイトカインおよびケモカインの堅牢な分泌、および生存性NET放出をさらに増加させた。さらに、LPS曝露FM外植片は、好中球のROS産生と脱顆粒を誘発する因子も放出した。本研究で使用されたLPS用量は、FMs炎症を誘導するのに低用量であり、好中球を直接活性化しない (Cross et al. 2017; Hoang et al. 2014)。本研究では、好中球のサイトカイン/ケモカイン分泌、脱顆粒、およびNET放出に対するFMsの影響を具体的に調査した。これらは感染の解決に関与するメカニズムであるが、絨毛膜に付随的な組織損傷を引き起こす可能性もある。LPSに応答した母体/胎児界面での好中球動員とNET放出の増加は、妊娠マウスモデルでも検証された。メカニズム的には、LPS刺激FMsに応答した好中球IL-8分泌、MPO脱顆粒、およびNET放出の増加は、FM由来TNF-αによって部分的に媒介され、好中球p38 MAPKおよびERKシグナル伝達経路の活性化を引き起こした。好中球IL-8およびNET放出の増加はROS依存性でもあった。
先行研究との違い: いくつかの炎症性サイトカインが早産の病態形成に関与しているとされているが、本研究は、LPS刺激FM外植片からのCMに応答して好中球がこれらの因子を放出できることを初めて示した点で、これまでの報告と異なる。さらに、LPS刺激FM外植片からのCMに応答して、好中球は他の多くの炎症性サイトカインおよびケモカイン (IL-17、IFNγ、G-CSF、GROα、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、およびRANTES) ならびに抗炎症性IL-10も放出した。これらの炎症性因子の局所的な増加は、母体好中球や他の免疫細胞の浸潤、および局所的なPG産生をさらに促進し、早産のリスク増加につながる可能性がある (Romero et al. 1989; Casey et al. 1989)。さらに、IL-8は好中球によるNET放出をパラクリン的に誘導することも示されている (Gupta et al. 2005)。メカニズム的には、LPS刺激FMsに応答した好中球IL-8およびIL-17分泌はROS依存性であったが、IL-6、IL-8、IL-17、RANTES、およびTNF-αの分泌はp38 MAPK経路の活性化によって部分的に媒介された。対照的に、ERKシグナル伝達の阻害は好中球IL-8およびRANTES分泌を減少させ、JNKシグナル伝達の阻害はLPS刺激FM-CMに応答した好中球RANTES分泌のみを減少させた。p38 MAPKおよびNADPHオキシダーゼ活性の阻害はそれぞれFM+LPSに応答した好中球IL-8分泌を有意に減少させたが、どの阻害剤もIL-8応答を完全に消失させることはなかった。これは、これらの同定されたシグナル伝達メカニズムが、FM由来因子によって好中球で活性化される唯一の経路ではないことを示している。例えば、PI3K/mTORシグナル伝達も関与している可能性がある (Weichhart and Saemann 2008)。あるいは、単一のシグナル伝達分子がブロックされたときに好中球で代償メカニズムが誘発され、全体的な分泌サイトカインレベルに全体的な変化がないという可能性もある。FM由来TNF-αの中和も、FM+LPSによって誘導される好中球サイトカイン/ケモカイン分泌を完全に逆転させることはなかった。実際、LPS刺激FM外植片は、TNF-αに加えて、IL-1βや他の炎症性サイトカインのレベルも増加させることを以前に報告している (Cross et al. 2017; Hoang et al. 2014)。妊娠アカゲザルへのIL-1βの羊膜内投与は、好中球を絨毛膜に動員し、そこでIL-8とTNF-αを発現することが報告されている (Presicce et al. 2018)。したがって、FM由来IL-1βは、母体/胎児界面での好中球サイトカイン/ケモカイン産生を活性化するもう1つの重要な因子である可能性がある。サイトカイン/ケモカイン分泌とは対照的に、p38 MAPKおよびERK経路の阻害は、LPS刺激FMsからのCMに応答した好中球MPO脱顆粒をほぼ完全に逆転させ、ROSシグナル伝達の阻害は好中球NET放出をほぼ完全に逆転させた。本研究では、FM由来TNF-αの役割も発見された。TNF-αは好中球脱顆粒の主要な駆動因子であるように見えたが、NET産生には部分的にしか関与していなかった。これは、異なる好中球活性化プロセスが、少なくとも部分的に、異なる細胞内シグナル伝達メカニズムを介して互いに独立して起こっているという考えを支持する。FM+LPSとは対照的に、未刺激FM-CMに応答した好中球IL-8分泌とNET放出は、TNF-α、ROS、またはMAPKシグナル伝達とは独立していることが判明した。これは、安静時FMsによる好中球活性化が、異なるシグナル伝達経路およびTNF-α以外の因子によって媒介されることを示唆している。実際、未刺激FMsは、LPS刺激FMsと比較して異なるサイトカイン/ケモカイン分泌プロファイルを有しており、未刺激FMsは低レベルのTNF-αを分泌するか、全く分泌しない (Cross et al. 2017)。NET放出はIL-1β、IL-8、およびIL-17によっても誘導され得るため (Garley et al. 2017; Keshari et al. 2012)、これらの因子のいずれかが安静時FMsに応答した好中球活性化の原因である可能性がある。実際、安静時FMsがかなりのレベルのIL-8とIL-17を分泌することを以前に報告している (Cross et al. 2017)。
臨床応用: PMAやカルシウムイオノフォアなどの刺激に応答する古典的な自殺性NET放出は、好中球に細胞死を誘導し、最適なNETsは処理後3〜4時間で観察される Fuchs et al. JCellBiol 2007。これとは対照的に、FM-CMに応答したNET放出は、曝露後わずか5分で迅速に起こった。これは、黄色ブドウ球菌に応答した好中球による生存性NET放出のタイムラインと一致する (Pilsczek et al. 2010)。この考えをさらに探求するため、FM-CMに応答した好中球によるNET放出が、短期的または長期的な生存能力、あるいは食作用能力を損なわないことを実証した。実際、FM-CMの存在下では好中球の長期生存率が向上した。これらの観察は、安静時FMsとLPS刺激FMsの両方からのCMに当てはまった。これらの強力な証拠は、FM-CMが好中球に、自殺性NETosisにおける膜溶解ではなく、DNAの出芽およびエキソサイトーシスを介して生存性経路によってNETsを放出させることを支持する (Yipp and Kubes 2013; Delgado-Rizo et al. 2017)。FMsが好中球の生存を延長できるという事実は、アカゲザルの絨毛膜脱落膜のin vivo研究によって支持されている (Presicce et al. 2018)。それにもかかわらず、FM-CMに応答した生存性NET放出のメカニズムは、自殺性NETosisのメカニズムと完全に異なるわけではなかった。FM-CMによって誘導されるNET放出は、ROSシグナル伝達とp38 MAPKおよびERK経路の活性化に依存することも示されており、これらはPMA誘導自殺性NETosisの場合にも活性化される (Brinkmann et al. 2004; Fuchs et al. 2007; Keshari et al. 2013; Hakkim et al. 2011)。要約すると、FM由来因子は好中球に生存性NET放出を誘導し、好中球の死滅を引き起こさない。これは、絨毛膜羊膜炎において、好中球が除去されるのではなく、FM組織に蓄積する理由を説明できるかもしれない。したがって、感染の存在下では、好中球の継続的な動員とNET放出が病原体を中和するのに役立つ一方で、好中球の生存性NET形成は生存能力と機能を延長し、脱顆粒、ROS産生、および炎症性サイトカイン/ケモカイン分泌と組み合わさって、代わりに組織損傷を引き起こし、早産に寄与する可能性がある。
残された課題: 以前の研究では、妊娠17日目の妊娠マウスへの高用量LPSの子宮内投与によって誘導される即時早産を、母体好中球の全身的枯渇が予防しなかったと報告されているが (Rinaldi et al. 2014)、動員された好中球は、より生理学的な長期低悪性度感染モデルにおいて、組織損傷を進行的に引き起こすことによって依然として病理学的である可能性がある点が今後の検討課題である。実際、前述の研究では、好中球の枯渇はLPSに応答した子宮IL-1βおよびTNF-αレベルを減少させた (Rinaldi et al. 2014)。安静時FMsも好中球を動員し、生存性NET放出を誘導したため、正常な妊娠では、好中球がFMsで病理学的感染から組織を保護する監視の役割を果たす可能性があると推測される。実際、妊娠15.5日目の正常なマウス胎盤では、好中球とNETsが少数存在することが観察された。妊娠マウスへの低用量LPSの投与は、胎盤-FMユニットへの好中球流入とNET放出を増強した。これは、自然期または早産陣痛を経験した急性絨毛膜羊膜炎の女性のFMsでNETsが報告されている臨床的観察をさらに検証するものである (Gomez-Lopez et al. 2017)。in vivoでMPOとシトルリン化ヒストン3をNETsに共局在させたが、これらのマーカーはマクロファージ由来細胞外トラップにも存在するため、in vivoで観察されたETsが常在胎盤マクロファージ由来である可能性もある (Doster et al. 2018)。最近、絨毛膜脱落膜への好中球浸潤とNET放出が、非ヒト霊長類モデル (Boldenow et al. 2016) およびB群レンサ球菌による上行性膣感染のマウスモデル (Kothary et al. 2017) で報告されているが、単一の細菌因子であるLPSに応答したマウス胎盤におけるNET放出を報告した研究は、本研究が初めてである。さらに、in vitro研究から、ヒトFM由来因子が好中球に生存性NET放出を誘導することが示されており、これは古典的な自殺性経路を介して形成されるNETsとは異なる役割を持つ可能性がある。
方法
研究承認: ヒト組織の採取はイェール大学のヒト研究保護プログラム (No. 0607001625) によって承認された。すべての動物研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って実施され、イェール大学の動物実験委員会 (No. 2016-11589) によって承認された。
ヒト胎児膜条件培地 (FM-CM) の収集: 胎児膜は、妊娠37週から41週の間に、陣痛や既知の感染症/炎症のない予定帝王切開から収集された。羊膜と絨毛膜が intact なFM外植片は、以前に記載された方法で調製された (Cross et al. 2017)。翌日、FM外植片は、E. coli O111:B4由来の1 ng/ml LPS (Sigma-Aldrich) の有無にかかわらず、血清を含まないOpti-MEM (Life Technologies) で24時間処理された。このLPS用量は、ヒトFMsによる堅牢なサイトカイン応答を誘導するのに十分であり、好中球機能に直接影響を与えない濃度として選択された (Cross et al. 2017)。24時間後、無菌条件下で細胞を含まないFM-CMが収集され、2000 rpmで10分間遠心分離され、-80℃で保存された。患者間のばらつきの影響を減らすために、3つの異なるFMsからのCMがプールされた。合計で、本研究のために42人の女性のFMsからCMが収集された。好中球を処理する前に、プールされたFM-CMに2% FBS (Gemini Bio-Products) が添加された。
ヒト好中球の単離: 好中球は、健康な非妊娠女性の末梢血から単離され、直ちに使用された。血液はヘパリンコートバキュテイナー (BD Biosciences) に採血され、赤血球はデキストラン (Sigma-Aldrich) を用いて沈降された。好中球は、Histopaque 1077/1119勾配 (Sigma-Aldrich) を用いた密度遠心分離によって単離された。好中球は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液 (Life Technologies) で洗浄され、低張性赤血球溶解が実施された。単離された好中球画分は、フローサイトメトリー分析 (FACSCalibur; BD Biosciences) によるCD16b染色 (1:100希釈、No. 302005; BioLegend) によって95%以上純粋であることが確認された。
好中球遊走: 好中球遊走は、以前に記載された2チャンバートランスウェル遊走アッセイを用いて定量化された (Mulla et al. 2010)。2 x 10^5個の好中球が、3μmのポアを持つトランスウェル (上部チャンバー) に播種され、下部チャンバー (24ウェルプレート) には、無処理 (NT; Opti-MEM単独)、未刺激FM-CM (FM)、LPS刺激FM-CM (FM+LPS)、またはFM+LPSの対照としてLPS単独 (1 ng/ml) のいずれかが含まれた。37℃で1時間後、下部チャンバーに遊走した好中球の割合は、QCM 24ウェル比色細胞遊走アッセイ (Chemicon International) を用いて定量化され、光学密度は560 nmで読み取られた。各実験において、データは、トランスウェルなしで24ウェルプレートに直接配置された好中球からなる100%遊走対照に対して相対的に示された。
FM-CMによる好中球の処理: 好中球は、NT対照としてOpti-MEM培地、未刺激FM-CM (FM)、FM+LPS、またはFM+LPSの対照としてLPS単独 (1 ng/ml) で1時間処理され、その後、培地を2% FBSを含む新鮮なRPMI培地に交換し、37℃で4時間インキュベートされた。細胞を含まない培養上清が収集され、-80℃で保存された。一部の実験では、FM-CMは、好中球に添加する前に、中和抗TNF-α mAb (No. MAB610; R&D Systems) またはアイソタイプ適合対照IgG (R&D Systems) のいずれか1 μg/mlと20℃で1時間インキュベートされた。他の実験では、FM-CMへの曝露前に、好中球は37℃で30分間、NADPHオキシダーゼ阻害剤ジフェニレンヨードニウム (DPI; 10 μM; Sigma-Aldrich)、p38 MAPキナーゼ阻害剤SB203580 (1 μM; Selleckchem)、ERK阻害剤SCH772984 (10 nM; Selleckchem)、またはJNK阻害剤SP600125 (5 μM; Selleckchem) のいずれかで前処理された。使用された阻害剤の用量は、以前に好中球で有効であることが報告されている (Fuchs et al. 2007; Cuenda et al. 1995; Arndt et al. 2005; Zhang et al. 2016)。阻害剤は、培地交換を含む全処理プロセス中に培養系に保持された。
好中球サイトカイン分泌と脱顆粒: 好中球培養上清中のIL-8/CXCL8 (Enzo Life Sciences) およびTNF-α (R&D Systems) はELISAによって測定された。G-CSF/CSF3、GM-CSF/CSF2、GROα/CXCL1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFNγ、IP-10/CXCL10、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、RANTES/CCL5、およびTNF-αは、マルチプレックス分析 (Bio-Rad Laboratories) によって定量化された (Cross et al. 2017; Hoang et al. 2014)。好中球の脱顆粒は、ELISA (R&D Systems) によって培養上清中のMPOレベルを測定することによって定量化された。
NET放出: 好中球は、NT対照としてOpti-MEM培地、未刺激FM-CM (FM)、FM+LPS、またはLPS単独 (1 ng/ml) で37℃で5分から3時間処理された。一部の場合には、陽性対照としてPMA (100 nM) による処理が含まれた。NET放出は、Quant-iT PicoGreen dsDNAアッセイ (Thermo Fisher Scientific) を用いて培養上清中のdsDNA放出を測定し、Tecan Infinite M1000 PROマイクロプレートリーダー (Thermo Fisher Scientific) を用いて485/535 nmで蛍光を測定することによって定量化された。NET放出は、免疫蛍光法によっても可視化された。細胞外DNAは、SYTOX Green (167 nM; Thermo Fisher Scientific) またはHoechst (1 μg/ml; Life Technologies) を用いて染色された。その後、細胞は4%パラホルムアルデヒド (PFA) で固定され、シトルリン化ヒストン3 (No. ab5103, 1:100希釈; Abcam) および/または好中球エラスターゼ (No. ab21595, 1:100希釈; Abcam) に対する抗体で染色された。一次抗体結合は、Alexa Fluor 564標識抗ウサギ抗体 (1:500希釈; Thermo Fisher Scientific) を用いて検出された。細胞はObserver Z1倒立蛍光顕微鏡 (Zeiss) を用いて観察された。画像はVolocityソフトウェア (PerkinElmer) によって取得され、ImageJ (Schneider et al. 2012) でマージされた。
好中球生存率: 上記のように1時間の処理後、短期間の好中球生存率は、死細胞のヨウ化プロピジウム (PI) 染色、それに続くフローサイトメトリー分析 (FACSCalibur; BD Biosciences) によって調査された。細胞死の追加の陽性対照は、好中球を4% PFAで処理することによって調製された。長期間 (24時間) の好中球生存率は、製造元の指示に従ってCellTiter 96生存率アッセイ (Promega) を用いて調査された。好中球は、CellTiter基質を37℃で4時間添加する前に24時間処理された。490 nmでの光学密度が記録された。すべてのサンプルは3連でアッセイされ、細胞生存率はNT対照に対する倍率変化として示された。
好中球食作用アッセイ: 1時間の処理後、10%ヒト血清でオプソニン化されたpHrodo Red E. coli BioParticles (Thermo Fisher Scientific) が添加された。好中球は、4% PFAで固定し、フローサイトメトリー分析 (FACSCalibur; BD Biosciences) を行う前に、ビーズと37℃で2時間インキュベートされた。食作用指数は、処理後の食作用されたビーズの数/NT対照によって食作用されたビーズの数として計算された。
好中球ROS産生: 好中球のスーパーオキシド産生は、ルミノール化学発光法を用いて定量化された (Lundqvist and Dahlgren 1996; Zhang et al. 2013)。フィブロネクチンコートされた白色96ウェルプレート上で、好中球はルミノール (300 μM; Sigma-Aldrich) とHRP (40 U/ml; Sigma-Aldrich) と37℃で5分間インキュベートされた。その後、処理が添加され、化学発光はEnVision 2104 Multilabel Plate Reader (PerkinElmer) で直ちに測定された。読み取りは2分間、毎秒行われた。ピーク発光値が記録された。
ウェスタンブロット: 好中球は37℃で30分間処理され、その後、細胞はタンパク質のために溶解され、以前に記載されたようにウェスタンブロット分析が実施された (Mulla et al. 2013)。メンブレンは、Cell Signaling Technology (Danvers, MA) からの以下の一次抗体でプローブされた：p-p38 MAPK (No. 9211S; 1:10,000希釈)、T-p-p38 MAPK (No. 9212; 1:30,000希釈)、p-ERK (No. 9101; 1:1000希釈)、T-ERK (No. 4695S; 1:2000希釈)、p-JNK (No. 9251; 1:1000希釈)、T-JNK (No. 9252A; 1:1000希釈)、p-p65 (No. 3033S; 1:10,000希釈)、またはT-p65 (No. 8242S; 1:5000希釈)。画像は記録され、Gel Logic 100 (Eastman Kodak) およびCarestreamソフトウェア (Carestream Molecular Imaging) を用いて半定量的なデンシトメトリーが実施された。リン酸化タンパク質のレベルは、その特定のタンパク質の総量に対して正規化された。
in vivoでのNET形成の検出: C57BL/6マウスは時間交配され (The Jackson Laboratory)、妊娠15.5日目に20 μg LPSまたはPBSが腹腔内投与された。注射後6時間でマウスは屠殺され、胎盤とFMsは一緒に解剖され、4% PFAで固定された。この用量のLPSを妊娠マウスに腹腔内投与すると、PBS対照と比較してFMの炎症性サイトカイン発現が増加する (IL-1β: 2.4倍、IL-6: 1.3倍、KC [IL-8]: 1.6倍) (Cross et al. 2017)。5マイクロメートルの組織切片は、好中球およびNETsのマーカーであるLy-6G (No. 551459, 1:200希釈; BD Biosciences)、MPO (No. AF3667, 1:200希釈; R&D Systems)、およびシトルリン化ヒストン3 (No. ab5103, 1:100希釈; Abcam) に対する一次抗体を用いた免疫蛍光法によって分析された。一次抗体結合は、適切なAlexa Fluor結合二次抗体 (1:200希釈; Thermo Fisher Scientific) を用いて検出され、切片はDAPIで対比染色され、VECTASHIELD Antifade Mounting Mediumを用いて封入された。切片はLeica SP5共焦点顕微鏡を用いて可視化され、画像はLAS AFソフトウェア (Leica) を用いて記録された。
統計分析: 各実験は、異なる女性からの好中球を用いて少なくとも3回実施された。データがプールされた独立した実験の数は、図の凡例に「n =」として示されている。すべてのデータは、プールされた実験の平均 ± SEMとして報告されている。統計的有意性はp < 0.05に設定され、Prismソフトウェア (GraphPad) を用いて決定された。正規分布データの場合、有意性は多重比較のための1元配置ANOVAまたはt検定を用いて決定された。正規分布しないデータの場合、有意性は非パラメトリック多重比較検定またはWilcoxon符号順位検定を用いて決定された。