- 著者: Xiaowen Chen, Xiuli Yuan, Yixin Chen, Xiufang Cui, Nianhua Cao, Meng Yi, Huanli Xu, Nuaner Yao, Uet Yu, Senmin Chen, Chao Liu, Min Zhang, Xiaoyun Huang, Jianming Song, Xianping Jiang, Benxiang Zheng, Sixi Liu, Zongbin Liu, Feiqiu Wen
- Corresponding author: Feiqiu Wen (Department of Hematology and Oncology, Shenzhen Children’s Hospital, Shenzhen, China), Zongbin Liu (Shenzhen Zigzag Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, China), Sixi Liu (Department of Hematology and Oncology, Shenzhen Children’s Hospital, Shenzhen, China)
- 雑誌: SSRN (preprint)
- 発行年: 2024
- Epub日: 2024-03-15
- Article種別: Original Article
- DOI: 10.2139/ssrn.4761284
背景
遠隔転移はがん関連死の主要な原因であり、幹細胞様特性と免疫回避特性を持つ腫瘍細胞、すなわち転移開始細胞である MICs (metastasis-initiating cells) によって開始される。循環腫瘍細胞である CTCs (circulating tumor cells) は一般に血行性転移の「種」と考えられているが、そのほとんどはアノイキス、ずり応力、免疫監視により遠隔臓器への定着に失敗する。したがって、実際に転移を開始する MICs の表現型を同定し、その生存戦略を特徴づけることは極めて重要である。これまでの研究では、マウスモデルにおいて CTC の腫瘍形成能を評価する際に in vitro 培養プロセスを経ているものが多く、免疫能を有するマウスにおける初代 CTC の転移開始能力に関する研究はまだ初期段階にある。循環中のどの腫瘍細胞サブポピュレーションが重要な MICs であり、どのように転移ストレスを乗り越えるのかは、さらに解明されるべき課題である。
転移は、非腫瘍細胞、特に免疫細胞が関与する複雑なカスケードである。好中球は最も豊富な白血球として、転移進行中の「両刃の剣」のような効果により注目を集めている。Szczerba et al. (2019) は、好中球が CTC とクラスターを形成し、がん細胞の細胞周期進行をサポートすることを報告した。Wculek and Malanchi (2015) は、好中球が転移を開始する乳がん細胞の肺定着を（前）転移微小環境内でサポートすることを示した。また、好中球細胞外トラップである NETs (neutrophil extracellular traps) は、Albrengues et al. (2018) により、炎症後に播種された休眠がん細胞を覚醒させることが示され、Yang et al. (2020) は、CCDC25 を介して乳がん患者の肝転移を促進することを報告した。これらの研究は、NETs が CTC を捕捉し、前転移部位での転移を促進することを示唆している。しかし、NETs と CTC の間の他の相互作用については未解明な点が多い。
一方、T 細胞免疫療法が好中球を動員して腫瘍抗原回避変異体を排除することや、好中球が腫瘍の根絶を誘導し、転移性播種を減少させるために利用できることも報告されている。Gungabeesoon et al. (2023) は、治療によって誘発された全身性好中球がインターフェロン遺伝子シグネチャーを獲得し、肺がん患者の免疫療法アウトカムと正の相関があることを示した。しかし、転移カスケードを橋渡しする循環中の腫瘍細胞の生存における好中球の役割に関する研究は不足している。
細胞内細胞現象（エンタシス、細胞共食い）は、同種および異種の両方で観察されるが、血中循環状態での腫瘍-好中球細胞内細胞である CIC (cell-in-cell) の存在とその MIC 機能は未解明であった。従来の CTC 捕捉法は抗原-抗体相互作用に基づくものが多く、DPC (double-positive cell) の検出を限定的にしていた。さらに、赤血球溶解などの血液前処理が CIC の外膜や CTC_NETs の NETs 成分を損傷する可能性があり、これが DPC がこれまで見過ごされてきた理由であると考えられる。本研究は、深圳小児病院の Wen らのグループが、神経芽腫、乳癌、大腸癌、肺癌患者において、CFD-Chip (cascaded filter-deterministic-lateral-displacement chip) を用いたラベルフリー全血 CTC 単離と scRNA-seq (single-cell RNA sequencing) による決定的なアプローチにより、新規 CIC 表現型を同定し、その MIC 機能と臨床的意義を明らかにすることを目指したものである。
目的
本研究の目的は、以下の点を明らかにすることである。 (1) CFD-Chip を用いたラベルフリー全血処理により、形態学的に特徴的な循環性細胞内細胞腫瘍細胞である CICs (cell-in-cell tumor cells) を含む CTC とその変種を単離すること。 (2) scRNA-seq、RNA velocity 解析、およびプロテオミクス解析により、CICs の分子プロファイルを詳細に解析すること。 (3) CICs が好中球シグネチャー（MPO (myeloperoxidase)、ELANE (neutrophil elastase)、S100A8/A9 など）を特異的に発現していることを確認すること。 (4) anuclear neutrophil (AN) の vital NETosis という新規形成機序を介した CICs の形成メカニズムを解明すること。 (5) BALB/c ヌードマウスを用いた in vivo 転移アッセイにより、CICs が既存の CTC と比較してより高い転移開始能力を持つことを実証すること。 (6) 神経芽腫、乳癌、大腸癌、肺癌患者を含む臨床コホートにおいて、CICs 数と転移、治療効果、および予後との相関を評価すること。 (7) CICs が液体生検における新たな転移バイオマーカーとして、また免疫療法の標的として臨床的有用性を持つ可能性を確立することである。本研究は、CICs の同定と特性評価を通じて、血行性転移のメカニズムに関する新たなパラダイムを提示し、がんの診断、予後予測、および治療戦略の改善に貢献することを目指す。
結果
CICsの同定と好中球シグネチャー: 神経芽腫患者 2 例 (NB01, NB02) の末梢血 scRNA-seq 解析により、CD45 陽性/GD2 陽性の二重陽性細胞 (DPC) が同定された。DPC はさらに 2 つのサブタイプに分類された。一つは CTC_NETs (DPC-I) であり、多核 DNA 網状構造を持つ NETs に捕捉された CTC の特性を示し、MPO および citH3（NETs 特異的マーカー）を発現した (Figure 2C)。その外層は CD11b および CD66b 陽性、CD68、CD163、CD14 弱陽性であった (Figure 2B)。もう一つは CICs (DPC-II) であり、単一核と二重層膜構造を特徴とし、CD45 陽性、GD2 陽性を示した (Figure 2A)。CICs は MPO、ELANE、S100A8/A9、CD66b といった好中球マーカーと、CK、EpCAM といった腫瘍マーカーを共発現した (Figure 2F, 2M)。NB01 の末梢血では CD45 陽性腫瘍細胞の比率が 49:12 (CTC:CIC) であり、NB02 では 267:69 であった (Figure 1E)。原発腫瘍や骨髄転移では CD45 陽性画分が低率であったことから、DPC が循環中でより高い生存優位性を持つことが示唆された。scRNA-seq 解析では、DPC の幹細胞性スコアが CTC よりも有意に高く (p < 2.22e-16)、好中球活性化に関連する遺伝子発現が豊富であることが示された (Figure 1G)。
CICsの新規形成機序の解明: 免疫蛍光染色と in vitro 共培養実験により、CD15 陽性好中球が vital NETosis（非致死的 DNA 放出）を経て anuclear neutrophil (AN) となり、この AN が腫瘍細胞を被覆することで CICs が形成されるという新規メカニズムが証明された (Figure 2G)。興味深いことに、CICs は CD66b 陰性であったが CD11b 陽性であり、これは好中球が AN 形成中に CD66b 顆粒を選択的に放出するが CD11b は放出しないことによって説明された。乳癌患者の末梢血から単離された CICs の scRNA-seq 解析では、これらの癌細胞が Human Primary Cell Atlas の参照マーカーを用いて自動的に好中球としてアノテーションされ、CICs が好中球の特性を持つことが示唆された (Figure 2I)。さらに、赤血球溶解などの血液前処理が ANs および CICs の外膜を破壊することが確認され、これが CICs がこれまでの研究で見過ごされてきた理由であると説明された。
CICsの強力な転移開始能力の検証: BALB/c マウスを用いた in vivo 転移アッセイでは、FACS で純化した約 400 個の CICs を静脈内注射した群 (n=5 mice) では 5/5 匹のマウスで肺転移が観察された (100%) のに対し、同数の約 400 個の CTCs を注射した群 (n=5 mice) では 3/5 匹のマウスで肺転移が観察された (60%) (Figure 5B)。CICs 群は有意に強い転移開始能力を示し、63 日間の観察期間において CICs 群は有意に不良な DFS (Figure 5C) と OS (Figure 5D) を示し、肺転移が肉眼的および組織病理学的に広範であった (Figure 5E)。CICs は CTC と比較して、幹細胞性スコア（NANOG, SOX2, OCT4 などの幹細胞性シグネチャー）が有意に高く (Figure 1G, p < 2.22e-16)、幹細胞様 MIC 表現型を持つことが示唆された。
CICsの分子特性と免疫回避機序: バルク RNA-seq と質量分析ベースのプロテオミクス解析により、CICs は CTC と比較して以下の分子特性を示すことが明らかになった。(i) 上皮間葉転換 (EMT) 関連遺伝子 (ZEB1, SNAI1, TWIST1, Vimentin) が有意に上昇しており、バルク RNA-seq において Vimentin は log2FC 2.4 の発現亢進を示した (Figure 6G)。(ii) ケモタキシス関連遺伝子 (CXCR4, CCR2) も上昇しており、遠隔臓器へのホーミング能力が増強されている可能性が示唆された (Figure 6F)。(iii) 免疫チェックポイント分子である PD-L1 (CD274)、CD80、CD86 の有意な高発現が確認され、PD-L1 は log2FC 3.1 の有意な上昇を示し (Figure 6J)、T 細胞による抑制からの回避に寄与すると考えられた。さらに、in vitro 活性化 CD8+ T 細胞細胞傷害性アッセイ (n=3 replicates) では、CICs は CTC よりも有意に高い生存率を示し (Figure 7F, p = 2.3223e-6)、フィルター膜透過能も優れており (Figure 7H, p = 0.0313)、毛細血管透過能が増強されていることが示唆された。これらの結果は、CICs が腫瘍細胞と好中球の共謀により、好中球シグネチャー、より強い遊走能力、ケモタキシス能力を獲得し、EMT、免疫チェックポイント発現、および AN 被覆による物理的遮蔽を通じて、ずり応力や免疫監視から腫瘍細胞を保護し、循環中の重要な MICs として機能することを示唆している。バルク RNA-seq では、CICs において 77% 以上の好中球マーカー遺伝子と 62% 以上のマクロファージマーカー遺伝子が上方制御されていた (Figure 6B)。
CICsの臨床相関と予後予測: 神経芽腫患者 43 例の解析では、転移群 (n=28 patients) における CICs 陽性率は 100% であったのに対し、非転移群 (n=15 patients) では 87.5% であり、CICs が転移特異的なマーカーである可能性が示唆された (Figure 3B)。CTC 陽性率では有意差は認められなかった。再発神経芽腫患者 9 例では、CICs 陽性率が 100% であり、CTC (66.67%) や CTC_NETs (55.56%) よりも最も感度の高い再発マーカーであることが示された (Figure 3D)。また、乳癌、大腸癌、肺癌患者 154 例のコホートでは、転移群における CICs 数が非転移群よりも有意に高く (Figure 3G, p = 0.0048)、進行性疾患 (PD) 患者における CICs 数も安定疾患 (SD)、部分寛解 (PR)、完全寛解 (CR) 患者よりも高かった (Figure 3H, p = 5.2372e-8)。M0（転移なし）の乳癌、肺癌、大腸癌患者において、血液 5 mL あたりの CICs 数が 35 個を超える患者は、35 個以下の患者と比較して有意に不良な無増悪生存期間 (PFS) を示し (Figure 3L, HR 2.508, 95% CI 1.413-4.452, p=0.0069)、早期再発予測バイオマーカーとしての CICs の有用性が示された。
考察/結論
本研究は、CFD-Chip を用いたラベルフリー全血処理、scRNA-seq、および異種移植転移アッセイを組み合わせることで、好中球シグネチャーを持つ循環性細胞内細胞腫瘍細胞 (CICs) が、従来の循環腫瘍細胞 (CTCs) を超える重要な転移開始細胞 (MICs) であることを初めて体系的に実証した、液体生検バイオマーカーおよび転移メカニズムに関するパラダイムシフトをもたらすプレプリントである。
先行研究との違い: 本研究は、好中球が単に CTC とクラスターを形成して細胞周期進行をサポートするという従来の報告 (Szczerba et al. 2019) や、NETs が前転移部位で CTC を捕捉するという報告 (Yang et al. 2020) と異なり、循環血中において脱核好中球 (AN) が腫瘍細胞を直接被覆して二重膜構造の CIC を形成し、物理的および免疫学的なシールドとして機能することを初めて明らかにした。
新規性: 本研究で初めて、anuclear neutrophil (AN) の vital NETosis を介した腫瘍細胞の取り込みという新規の細胞内細胞形成機序が解明された。CICs は、上皮間葉転換 (EMT)、PD-L1、CD80/CD86 の高発現、および幹細胞性といった総合的な転移性表現型を示すことが明らかになった。また、従来の赤血球溶解処理が CICs の外膜構造を破壊するため、これまでの研究で DPC が見過ごされてきた技術的要因を新規に同定した。
臨床応用: 本知見は、がん転移の早期診断および治療戦略の臨床応用に直結する。臨床的意義として、第一に、CFD-Chip のようなラベルフリー全血処理法を用いることで、液体生検による転移バイオマーカーの検出精度を大幅に改善できる。第二に、M0 患者において血液 5 mL あたりの CICs 数が 35 個を超えることが早期再発を警告する強力なバイオマーカーとなるため、臨床現場における予後予測に貢献する。第三に、CICs における PD-L1、CD80、CD86 の高発現は、免疫チェックポイント阻害剤の新たな適用対象となる可能性を示唆する。第四に、好中球の vital NETosis を阻害する薬剤（例：PAD4 阻害剤 GSK484 や DNase I）は、CICs 形成を阻止し、転移を抑制するための合理的な治療戦略となる。
残された課題: 今後の検討課題として、CICs と CTCs の機能的差異が in vivo でどのように（例えば、肺への血管透過性や生存能力の違いによって）分離されるのかという詳細な分子メカニズムの解明が残されている。また、vital NETosis 機序の分子基盤（PAD4 や ROS 依存性など）の解明も不十分である。Limitation として、本研究は SSRN に掲載されたプレプリントであり、まだ査読が完了していないため結果の解釈は予備的であること、神経芽腫のコホートサイズ (n=43) が比較的小さく、多施設共同研究によるさらなる検証が必要であること、および CFD-Chip 技術の商業化と臨床検査室での標準化には課題が残されていることが挙げられる。
方法
患者とサンプル収集: 2019年4月から2023年12月にかけて、深圳小児病院の血液腫瘍科で診断された神経芽腫患者 43 名と健常小児 6 名が本研究に含まれた。末梢血サンプルは、初期診断時、各化学療法コースの前後に、および再発時に採取された。また、2021年7月から2022年4月にかけて、深圳人民病院の腫瘍科で診断された乳癌、大腸癌、肺癌患者 154 名も含まれた。全ての患者から書面によるインフォームドコンセントが得られ、本研究はヘルシンキ宣言の原則に従い、深圳小児病院および深圳人民病院の倫理委員会によって承認された。
CTC捕捉: 患者の末梢血 3 mL（小児患者）または 5 mL（成人患者）をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 4 mL で希釈し、CFD-Chip を用いて処理した。CFD-Chip は、細胞の形態学的サイズと変形能に基づいてラベルフリーで細胞を単離するため、抗体相互作用を必要とせず、CICs の形態を保持できる。SK-N-SH (human neuroblastoma cell line) 神経芽腫細胞を健常者の血液サンプルにスパイクし、CFD-Chip で処理したところ、平均回収率は 87.6% であった。
分子解析: 神経芽腫患者 2 例 (NB01, NB02) の原発腫瘍、末梢血、骨髄転移組織から単離された細胞を用いて、10x Genomics Chromium プラットフォームによる scRNA-seq を実施した。FASTQ ファイルは Cell Ranger (v6.0.0) を用いて参照ゲノム (GRCh38) にアラインメントされ、リードフィルタリング、バーコードカウント、UMI カウントが行われた。Seurat v4.0.1 を用いて細胞をクラスタリングし、SingleR と既知のマーカー遺伝子を用いて細胞型をアノテーションした。また、inferCNV を用いてコピー数変異 (CNV) を推定した。マウスモデルの CICs と CTCs の特性を詳細に解析するため、バルク RNA-seq と質量分析ベースのプロテオミクス解析も実施した。
免疫蛍光染色: CFD-Chip で単離された細胞は、ポリ-L-リジンでコートされた 96 ウェルプレートに播種され、4% パラホルムアルデヒドで固定後、0.1% TritonX-100 で透過処理された。PE 抗 CD45 抗体、FITC 抗 GD2 抗体、citrullinated histone H3 (citH3, NETsマーカー)、MPO、ELANE、S100A8/A9、CD15、CD45、EpCAM、Cytokeratin (CK)、E-cadherin、Vimentin、CD11b、CD66b、CD68、CD163、CD14 などの抗体を用いて多重染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。
In vivo転移アッセイ: BALB/c ヌードマウスおよび免疫能を有する BALB/c マウスに、FACS (fluorescence-activated cell sorter) で純化された CICs 約 400 細胞または CTCs 約 400 細胞を尾静脈から静脈内注射 (i.v.) した。Luc-GFP-4T1 (mouse breast cancer cell line) 乳癌細胞株を用いたマウスモデルおよび Neuro-2a (mouse neuroblastoma cell line) 神経芽腫細胞株を用いたマウスモデルを確立した。63 日間観察し、ルシフェラーゼシグナルとヘマトキシリン・エオシン (H&E) 染色により肺転移を評価し、無病生存期間 (DFS) と全生存期間 (OS) を比較した。
In vitro実験: GFP-SK-N-SH 細胞と患者の末梢血を共培養し、ANs (anuclear neutrophils) の形成と vital NETosis を介した CICs 形成を誘導した。活性化 T 細胞細胞傷害性アッセイでは、MUC1 ペプチドで免疫した BALB/c マウスから得られた活性化 T 細胞と、4T1 腫瘍担持マウスから単離された CTCs および CICs を共培養し、生存率を比較した。トランスウェルアッセイにより、CICs と CTCs のフィルター膜透過能を比較し、遊走能力を評価した。
統計解析: 統計解析には GraphPad Prism 9 および IBM SPSS Statistics を用いた。2群間の統計的差は Mann-Whitney U test または Wilcoxon signed-rank test、あるいは Student t-test を用いて比較し、p 値が 0.05 以下を有意とした。Kaplan-Meier 生存曲線を作成し、ログランク検定 (log-rank test) を用いて群間の統計的有意差を評価した。Cox 比例ハザードモデル (Cox regression) も、無増悪生存期間、無病生存期間、全生存期間のイベント発生までの時間データを要約するために実施された。