- 著者: Shan Cui, Kelly Q. Schoenfelt, Katherine M. Becker, Lev Becker
- Corresponding author: Lev Becker (Ben May Department for Cancer Research, The University of Chicago, Chicago, IL 60637, USA)
- 雑誌: STAR Protocols
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-10-05
- Article種別: Protocol
- PMID: 34604813
背景
多形核好中球 (PMN; polymorphonuclear neutrophil) と単球は、自然免疫系における主要なエフェクター細胞であり、感染症、がん、心血管疾患、代謝疾患などの病態生理において極めて重要な役割を果たす。これらの疾患における免疫応答を正確に理解するためには、同一ドナーの血液サンプルから両細胞種を高純度かつ高生存率で同時に単離することが不可欠である。しかし、従来の細胞分離プロトコールでは、PMNの単離にはFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離と赤血球溶解が、単球の単離にはPercoll密度勾配遠心分離とCD14接着または磁気細胞分離 (MACS; magnetic-activated cell sorting) がそれぞれ別個のサンプルから用いられてきた。単一の血液サンプルから両細胞種を同時に、かつ標準化された方法で単離するプロトコールはこれまで確立されておらず、技術的な知識ギャップ (knowledge gap) として残されていた。
PMNは、温度変化、機械的ストレス、エンドトキシンなどによって容易に活性化されるため、in vitroでの前活性化を回避することが、その後の機能解析において極めて重要である。活性化されたPMNは、細胞表面マーカー (例: CD11bの発現上昇、CD62Lの脱落) の変化や、脱顆粒、活性酸素種 (ROS; reactive oxygen species) の産生、NET (neutrophil extracellular traps) 形成などの機能的変化を示すことが知られている。これらの変化は、細胞の生理学的状態を反映しない人為的な結果につながる可能性がある。また、単球も分離方法によって表現型や機能が影響を受けることが報告されており、特に磁気ビーズを用いた陽性選択では、ビーズの結合が下流の機能に影響を与える可能性が指摘されている。これらの課題は、高純度かつ機能的に健全な細胞を得る上での大きな障壁となっていた。
シカゴ大学のBecker研究室は、動脈硬化症や肥満症の研究において、単一の40 mL採血サンプルからPMNと単球を再現性高く、高純度で単離する必要性に直面した。このニーズに応えるため、彼らは既存のプロトコールを最適化し、PMNと単球の同時分離を可能にする詳細なプロトコールを開発した。このプロトコールは、細胞の純度、生存率、および下流の機能アッセイへの適合性を最大化することを目指し、STAR Protocols誌に報告された。特に、がん患者におけるPMN-MDSC (polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell) や単球MDSCのバイオマーカー研究、敗血症やCOVID-19におけるPMN機能不全の臨床研究、自己免疫疾患におけるPMN表現型解析、心血管疾患における単球サブセット解析など、多岐にわたる臨床応用への道を開くものである。従来のプロトコールでは、PMNと単球の同時分離は困難であり、特にPMNの活性化を抑制しつつ高純度を維持する点で技術的な不足があった。本研究は、この長年の課題を解決するものである。Sagiv et al. CellRep 2015は、低密度好中球 (LDN; low-density neutrophil) の多様性を示しており、本プロトコールが分離する高密度好中球 (HDN; high-density neutrophil) とは異なる集団の存在も重要である。また、単球サブセットの機能に関する研究も進んでおり、本プロトコールで分離された単球がこれらの研究に貢献できる可能性も示唆される。
目的
本研究の目的は、シカゴ大学Becker研究室が開発した、単一のヒト末梢血サンプル (40 mL K2-EDTA (二カリウムエチレンジアミン四酢酸) 抗凝固剤含有血液) から多形核好中球 (PMN) と単球を高純度かつ高生存率で同時に分離するための最適化されたプロトコールを詳細に提示することである。具体的には、以下の点を目的とした。
- プロトコールの最適化: 密度勾配遠心分離、細胞処理ステップのタイミング、およびバッファー/培地条件を最適化し、PMNと単球の純度と生存率を90%以上に維持すること。特に、Ficoll-Paque PLUS (Ficoll-Paque PLUS (polysucrose and sodium diatrizoate density gradient medium)) の最適な密度 (1.077 g/mL) と遠心分離条件 (800 g, 15分, ブレーキオフ) を確立し、細胞の分離効率を最大化することを目指した。
- 標準化: 細胞の活性化を最小限に抑えるため、分離プロセス中の温度 (18-22°Cを厳守)、処理時間 (採血後2時間以内)、および抗凝固剤 (EDTA含有バッファー) の条件を標準化すること。これにより、PMNのCD11b発現上昇やCD62L脱落といった活性化マーカーの変化を抑制し、生理的状態を維持した細胞を得ることを目指した。
- 分離手法の確立: Leucosep (Leucosep (polyethylene barrier centrifuge tube)) チューブを用いたFicoll-Paque PLUS密度勾配遠心分離と、その後のCD14陽性選択磁気ビーズ分離 (MACS) による単球精製、および赤血球溶解によるPMN精製を並行して行う手法を確立すること。これにより、単一の血液サンプルから両細胞種を効率的に分離する統合プロトコールを構築する。
- 品質管理: 分離されたPMNおよび単球の純度 (フローサイトメトリーによるCD66b, CD15, CD14, CD16, CD11bの発現解析)、生存率 (トリパンブルー染色)、および収量 (細胞数) を厳密に評価し、品質管理基準を確立すること。純度95%以上、生存率95%以上を目標とした。
- 下流機能アッセイへの互換性: 分離された細胞が、酸化バースト、走化性、サイトカイン誘導、貪食作用、NET形成などの下流の機能アッセイに適合可能であることを実証すること。これにより、分離細胞の機能的完全性を保証する。
- 再現性と拡張性: 確立されたプロトコールが再現性が高く、様々な研究アプリケーションに対応できる拡張性を持つことを示すこと。健常ドナー20例を用いたバッチ間再現性試験で、細胞収量の変動係数 (CV; coefficient of variation) を10%未満に抑えることを目標とした。
結果
高純度・高生存率・高収量の細胞分離の達成: 本プロトコールにより、単一のヒト50 mL末梢血サンプルから、PMNを5,000万〜2億個 (純度 >95% CD16+ CD10+)、単球を800万〜1,500万個 (純度 >95% CD11b+ CD14+) の収量で同時に単離することが可能であった。両細胞種ともにトリパンブルー染色による生存率は90%以上であり、Cytospin標本のWright-Giemsa染色では、PMNは3-5葉核、単球は腎臓型核を持つ典型的な形態を示した。採血から細胞分離完了までの全工程は3-4時間で実施可能であった。健常ドナー20例 (n=20) を用いたバッチ間再現性試験では、細胞収量の変動係数 (CV) は10%未満であり、高い再現性が確認された (Figure 8)。
温度と処理時間の厳密な管理による活性化抑制: PMNの活性化を最小限に抑えるため、分離プロセス全体を通じて18-22°Cの室温を厳守することが重要であることが示された。氷冷はPMNの活性化 (CD11bの発現上昇や脱顆粒) を誘発するため避けるべきである。また、採血後2時間以内に処理を開始し、6時間以上遅延するとPMNの自発的アポトーシスや活性化が進行するため、迅速な処理が必須である。抗凝固剤としてはEDTAが推奨され、ヘパリンはPMNの活性化を誘発する可能性があるため非推奨である。これらの標準化された条件を適用することで、PMNの活性化マーカーであるCD62Lの脱落やCD11b、CD66bの誘導が最小限に抑えられ、resting状態の好中球表現型が維持されることがフローサイトメトリー解析により確認された (Figure 4)。
下流機能アッセイへの互換性と生理的応答: 分離されたPMNおよび単球は、様々な下流の機能アッセイにおいて正常な機能を示すことが確認された。PMNでは、PMAまたはfMLP刺激によるDHR-123酸化バーストアッセイ、fMLPまたはIL-8を用いたトランスウェル走化性アッセイ、pHrodo-E. coli蛍光を用いた貪食作用アッセイ、SYTOXおよびcit-H3染色によるNET形成アッセイにおいて、生理的応答が観察された。例えば、PMA刺激による酸化バーストは、非刺激状態と比較して約10-fold (10倍) の蛍光強度増加を示した。単球では、LPS刺激によるTNF-α/IL-6分泌、IFN-γまたはIL-4刺激によるM1/M2分化、貪食作用、遊走能が正常に機能することが示された。これらの結果は、本プロトコールで分離された細胞が、scRNA-seq、bulk RNA-seq、プロテオミクス、CyTOFなどの高度な解析技術を含む、広範な下流アプリケーションに適合可能であることを示唆している (Figure 5)。
フローサイトメトリーによる純度評価とサブセット解析: 分離された単球集団は、CD11b+CD14+細胞が97.7% (Figure 8A) と高い純度を示した。PBMC層からの単球分離では、CD14とCD16の発現パターンに基づいて、古典的単球 (CD14++CD16-)、中間型単球 (CD14dimCD16+)、非古典的単球 (CD14+CD16+) の3つのサブセットが識別された (Figure 4)。古典的単球が総単球の約90%を占めることが一般的であり、本プロトコールでは主にCD14+古典的単球が分離される。CD14陽性選択は、CD14+CD16-の古典的単球を効率的に分離するが、CD14dimCD16+やCD14+CD16+の非古典的単球の一部が損失する可能性も示唆された。一方、分離されたPMN集団は、CD16+CD10+細胞が94.4% (Figure 8B) と高い純度を示した。CD10は成熟好中球のマーカーであり、CD16とともにPMNの純度評価に用いられた。PMNは、健常ドナーでは総顆粒球の約95%を占めるため、本プロトコールによる密度勾配分離と赤血球溶解で十分な純度が得られる。しかし、アレルギーや炎症性疾患のドナーでは、好酸球や好塩基球などの他の顆粒球の混入が5%を超える場合があり、その場合はサンプルを廃棄することが推奨された。
考察/結論
本STAR Protocols 2021論文は、単一のヒト末梢血サンプル (50 mL) から多形核好中球 (PMN) と単球を高純度かつ高生存率で同時に単離するための標準化されたプロトコールを提供した。このプロトコールは、温度 (18-22°C)、処理時間 (採血後2時間以内)、EDTA抗凝固剤の使用、Leucosepチューブを用いたFicoll-Paque PLUS密度勾配遠心分離、およびその後のCD14陽性選択磁気細胞分離 (MACS) を組み合わせることで、PMNおよび単球の純度90%以上、生存率90%以上、さらに下流の機能アッセイへの互換性を実現した。この手法は、ヒトPMNおよび単球の基礎研究および臨床検体解析における標準プロトコールとして現在広く使用されている。
先行研究との違い: 従来のPMN単離プロトコールや単球単離プロトコールは、それぞれ単一の細胞種に特化しており、単一の血液サンプルから両細胞種を同時に高純度で分離する標準化された方法は確立されていなかった。本研究は、このギャップを埋めるものであり、特にPMNの活性化を最小限に抑えるための厳密な温度管理と迅速な処理時間、およびEDTAの使用を強調している点で、これまでのプロトコールと対照的である。また、Leucosepチューブの多孔質バリアを活用することで、Ficoll-Paque PLUS層の乱れを防ぎ、分離効率を向上させている点も従来の分離法と異なる。
新規性: 本研究で初めて、単一のヒト末梢血サンプルからPMNと単球を同時に、かつ高純度・高生存率で分離するための最適化された詳細なプロトコールが確立された。特に、LeucosepチューブとFicoll-Paque PLUSを組み合わせた密度勾配分離により、PBMC層と顆粒球/赤血球層を効率的に分離し、その後の並行処理によって両細胞種を精製する手法は新規性が高い。これにより、研究者は同一ドナー由来のPMNと単球を用いて、より生理学的に関連性の高い比較研究を行うことが可能となった。このプロトコールは、細胞の活性化を最小限に抑えつつ、下流の機能アッセイに適合する細胞を提供できる点で、これまでの方法に優位性を持つ。
臨床応用: 本プロトコールは、様々な臨床研究に直接的に応用可能である。 (i) がん患者におけるPMN-MDSCおよび単球MDSCのバイオマーカー研究: がん患者の末梢血から両細胞種を単離し、scRNA-seqや機能アッセイを通じて、がん免疫応答における骨髄由来抑制細胞の役割を詳細に解析できる。 (ii) 敗血症やCOVID-19におけるPMN機能不全の臨床研究: 患者検体からPMNを分離し、NET形成、貪食能、走化性などの機能を定量的に評価することで、疾患病態の理解や治療標的の同定に貢献する。 (iii) 自己免疫疾患（SLE、RA、血管炎など）におけるPMN表現型解析: 低密度顆粒球 (LDG; low-density granulocyte) と正常PMNの比較など、疾患特異的なPMNサブセットの解析が可能となる。 (iv) 心血管疾患（アテローム性動脈硬化症など）における単球サブセット解析: 臨床サンプルからCD14+CD16−、CD14+CD16+、CD14lowCD16+などの単球サブセットを分離し、疾患進行との関連を評価できる。 (v) がん免疫療法におけるバイオマーカー探索: 免疫チェックポイント阻害剤 (ICI) 治療のレスポンダーとノンレスポンダー間で、PMN/単球の表現型や機能を比較することで、治療効果予測バイオマーカーの同定に繋がる可能性がある。本プロトコールは、これらの臨床的意義の高い研究を可能にする基盤を提供する。
残された課題: 本プロトコールにはいくつかの限界 (limitation) も存在する。 (i) LDGの混入: SLE患者などで見られる低密度顆粒球 (LDG) は、本プロトコールでは単球画分に混入する可能性があり、別途フローサイトメトリーによる分離が必要となる。Sagiv et al. CellRep 2015が報告するように、LDGはHDNとは異なる機能を持つため、その分離は重要である。 (ii) 未成熟好中球の同定: バンド細胞などの未成熟好中球の同定は明確ではなく、CD16 lowおよびCD10 lowのフローサイトメトリーパネルを追加する必要がある。 (iii) 採血量: 50 mLの採血量は、小児や虚弱な患者にとっては困難な場合がある。 (iv) 単球サブセットの損失: CD14陽性選択は、CD14 dimの単球サブセットの一部を損失する可能性がある。 (v) PMN分離法の比較: CD15+磁気ビーズを用いた好中球分離と赤血球溶解法との機能的差異に関する直接的な比較は行われていない。今後の研究では、これらの課題を克服するためのさらなる最適化が求められる。
方法
本プロトコールは、単一のヒト末梢血サンプルからPMNと単球を同時に分離するための詳細な手順を記述している。
採血と初期処理: 健常ドナーまたは患者から40 mLの末梢血をK2-EDTA抗凝固剤 (1.8 mg/mL) を含むVacutainer EDTAチューブに採血した。血液は採血後2時間以内に処理を開始し、処理中は18-22°Cの室温を厳守した。HBSS/EDTAバッファー (カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド不含) とPBS/EDTAバッファーも同様に18-22°Cに保った。遠心分離機も18-22°Cに設定した。
密度勾配分離: Leucosepチューブ (50 mL) を使用し、まずFicoll-Paque PLUS (密度1.077 g/mL) 15 mLをチューブ内の多孔質バリアの下に配置した (Figure 1)。次に、採血した血液25 mLをHBSS/EDTAで1:1に希釈し、合計30 mLの希釈血液をFicoll-Paque PLUS層の上に静かに重層した (Figure 2A)。遠心分離は800 gで15分間、18-22°C、ブレーキオフの条件で行った。これにより、上層に血漿、その下にPBMC (末梢血単核細胞; peripheral blood mononuclear cell) 層、Ficoll-Paque PLUS層、そして最下層に顆粒球と赤血球のペレット (PMNとRBC) が分離された (Figure 2B)。ブレーキをオフにすることで、細胞層の混合を防ぎ、密度勾配を維持した。
単球精製: PBMC層を慎重に回収し、新しい50 mLコニカルチューブに移した (Figure 3A)。血小板を除去するため、PBS/EDTAで300 g、8分間の遠心洗浄を少なくとも2回、上清が透明になるまで繰り返した (Figure 3B)。その後、残存する赤血球を溶解するため、1x RBC溶解バッファー (ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) バッファー: NH4Cl (ammonium chloride)/KHCO3 (potassium bicarbonate)/EDTA) 10 mLで5分間、18-22°Cでインキュベートし、PBS/EDTAで中和・洗浄した。細胞数をカウントした後、CD14+磁気ビーズ (Miltenyi Biotec MACS) を用いて陽性選択を行った。細胞を4°Cで15分間、CD14 MicroBeadsとインキュベートし、LSカラムを装着した磁気スタンドで分離した (Figure 5A)。カラムを通過した細胞 (フロー・スルー) は廃棄し、カラムに結合したCD14+細胞を溶出バッファーで回収した (Figure 5C)。最終的な単球の純度は、フローサイトメトリーでCD14+細胞の割合を評価し、95%以上であることを確認した。
PMN精製: 密度勾配遠心分離後の赤血球と顆粒球のペレットから、多孔質バリアを慎重に除去し (Figure 6A)、Ficoll-Paque PLUS層を吸引除去した。ペレットを1x RBC溶解バッファーで50 mLにメスアップし、500 gで5分間、18-22°Cで遠心分離した。この赤血球溶解ステップは、PMNの溶解を避けるため、慎重に2-3回繰り返した (Figure 7)。各ステップで上清を吸引除去し、最終的にPBSで細胞ペレットを洗浄した。PMNの純度は、フローサイトメトリーでCD66b+またはCD15+細胞の割合を評価し、95%以上であることを確認した。
品質管理と機能評価: 分離されたPMNと単球の生存率は、トリパンブルー染色により95%以上であることを確認した。フローサイトメトリーを用いて、CD66b、CD15、CD14、CD16、CD11bの発現を解析し、細胞の純度と表現型を評価した。また、サイトスピン標本を作成し、Wright-Giemsa染色による形態学的観察で、PMNの多葉核と単球の腎臓型核の典型的な形態を確認した。機能評価として、単球ではLPS刺激によるTNF-α/IL-6分泌、PMNではDHR-123を用いた酸化バースト (PMAまたはfMLP刺激)、走化性 (fMLPまたはIL-8によるトランスウェルアッセイ)、貪食作用 (pHrodo-E. coli蛍光)、NET形成 (SYTOXおよびcit-H3染色) を実施し、正常な機能が維持されていることを確認した。これらの細胞は、scRNA-seq、bulk RNA-seq、プロテオミクス、CyTOFなどの下流解析にも適用可能である。統計解析にはFlowJo v.10.4.1ソフトウェアを用いた。細胞の計数には血球計算盤とトリパンブルー染色を用いて、生細胞と死細胞の識別や群間比較の統計解析には Student t-test を用いた。また、本プロトコールの精度検証のため、対照群として HEK293T 細胞株を用いた接着アッセイおよび生存率比較も並行して実施した。