- 著者: Stephanie P.T. Yiu, Yuzhou Chang, Yao Yu Yeo, Huaying Qiu, Wenrui Wu, …, Qin Ma, Sizun Jiang, et al.
- Corresponding author: Sizun Jiang (Beth Israel Deaconess Medical Center / Harvard Medical School)
- 雑誌: Cancer Discovery
- 発行年: 2026
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 41874448
背景
空間トランスクリプトミクスと空間プロテオミクスはそれぞれ異なる長所を持つ。前者はゲノムワイドな遺伝子発現情報を提供するが、転写後調節やRNA-タンパク質相関の変動により機能的表現型の予測に限界がある。後者はより忠実に機能的分子表現型を捉えられるが、多重化能力に制約がある。従来、これら2つのモダリティを同一組織切片上で統合する方法は存在せず、隣接切片を用いた計算的統合が主流だった。しかし隣接切片の統合はアライメント誤差、組織変形、微細な腫瘍微小環境 (TME) の不均一性などにより細胞間の空間的な真の関係を捉えにくいという根本的問題があった (Frangieh et al. NatCancer 2026)。
同一スライド統合を可能にするための前提となる空間トランスクリプトミクスの技術的基盤はSeurat等の方法論によって整備されてきたが (Satija et al. NatBiotechnol 2015)、同一組織内での空間的セルフェノタイプの協調的状態変化を定量化する数学的手法も不足していた。さらにEBVウイルス関連拡散性大細胞型B細胞リンパ腫 (DLBCL) のTMEがどのように免疫応答を抑制しているかのメカニズムは未解明であり、EBV陽性DLBCLが免疫チェックポイント阻害療法への応答が低い原因も不明確な課題として残されていた (Enssle et al. CancerCell 2026)。
目的
同一FFPE組織スライド上で空間プロテオミクスと空間トランスクリプトミクスを順次統合するIN-DEPTH (integrated near-tissue digital enrichment phenotyping transcriptomics histology; 同一スライド空間マルチオミクス統合法) と、細胞間の空間的協調パターンを定量化するSGCC (Spectral Graph Cross-Correlation; スペクトルグラフ交差相関) 計算法を開発し、EBV関連DLBCLのTME空間再構築メカニズムを解明すること。
結果
IN-DEPTH法の技術的バリデーション — 複数プラットフォームで高い再現性：
IN-DEPTHは空間プロテオミクス (抗体染色・多重化免疫蛍光撮像) を先に実施したのち、同一スライドでRNA探索ハイブリダイゼーションによる空間トランスクリプトミクスを行う「タンパク質ファースト」設計を採用する。これにより、RNAシグナルを損なうプロテアーゼ処理（空間トランスクリプトミクスで必要）前にタンパク質撮像を完了させ、タンパク質エピトープとRNA品質の両方を保持することができる。多重免疫蛍光ベースのプロテオミクスプラットフォーム4種 (CODEX・SignalStar・Polaris・Orion) と空間トランスクリプトミクスプラットフォーム4種 (GeoMx・VisiumHD・CosMx・Xenium) の計11組み合わせで検証したところ、Orion-GeoMxの組み合わせ (R=0.692) を例外として、IN-DEPTHスライドと対照スライド間の遺伝子間相関はR≥0.938（最大R=0.991）を達成し、総RNA回収量も同等水準を維持した (Fig 1)。最大60サイクルの撮像を行った後でもRNA品質は高く保たれ (R=0.966、総RNA量は約2.5倍の低下のみ)、H&E形態も全条件で保存されていた。また逆順 (Xenium→CODEX) では大部分のタンパク質マーカーの染色強度が著しく低下し、プロテオミクスを先行させることの重要性が確認された。
扁桃組織でのIN-DEPTHの再現性確認とデコンボリューション基準データとしての活用：
隣接するFFPE扁桃組織2切片を2台の独立したGeoMxで処理し、11細胞集団について高い技術的再現性を確認した。タンパク質と転写産物のシグネチャの一致度は高く、単一細胞扁桃アトラスとの比較でも一貫した結果が得られた (Fig 2)。この高品質な参照データセットを用いてCIBERSORT、dtangle、MuSiC、SpatialDeconの4種のデコンボリューションアルゴリズムを評価したところ、いずれも低複雑度ROI (ジニ-シンプソン指数が低い) では相関が高 (~0.9) だった。さらにCD4 T濾胞性ヘルパー (Tfh) 細胞はタンパク質マーカーだけでは同定困難だが、空間トランスクリプトミクスのGSVAスコアが、B細胞密度との間でR=0.75の正の相関を示すことで空間的にTfhを同定できることを示した (Fig 2)。また10種の主要遺伝子発現プログラム (GEP; gene expression program) を同定し、各細胞型の既知機能に対応した転写プログラムを確認した。
SGCC (スペクトルグラフ交差相関) の開発と空間的細胞状態遷移の検出：
グラフ信号処理とSGWT (spectral graph wavelet transform) の数学的原理に基づくSGCCを開発した。SGCCは各細胞型の空間分布パターンをグラフ信号として表現し、低周波成分でマクロスケールの空間組織を、バンドパス成分でよりローカルな空間構造を捉える。バンドパス成分の追加により低周波のみの再構成を有意に改善することをシミュレーションで確認した (P=4.32×10^-12)。古典的な空間統計法 (クロスバリオグラム、ピアソン相関、双変量モランI、局所空間クロス相関指数) と比較してSGCCは空間パターンをより鋭敏に識別した。扁桃組織のCD4 T細胞とBCL6+B細胞のSGCC解析では、低SGCC値の領域 (暗帯; DZ) でB細胞の体細胞突然変異関連プログラム・DNA複製プログラムが、高SGCC値の領域 (明帯; LZ) でTCRシグナリング・抗原提示プログラムが増強されており、DZ/LZ両帯の典型的な転写プログラムの再現に成功した (Fig 3)。
EBV陽性DLBCLにおける免疫抑制性マクロファージ分極とCD4 T細胞選択的機能不全：
2施設由来のFFPE組織マイクロアレイ (TMA) から採取したEBV陽性 (n=17) ・EBV陰性 (n=13) DLBCLについてCODEX-GeoMx IN-DEPTHを実施した。30マーカー抗体パネルで8細胞集団を同定し、38 ROIのゲノムワイドトランスクリプトームを取得した。TMAコアレベルの解析でEBV陽性DLBCLは免疫浸潤が多く、EBV陰性は腫瘍細胞が豊富であった (Fig 4)。細胞組成の詳細な解析では、EBV陽性DLBCL群で制御性T細胞 (Treg) の増加と特徴的なマクロファージ分極を認め、免疫抑制性CD68+CD163+マクロファージはEBV陰性比で1.91倍増加 (P<0.05; 95% CI 1.64–2.25)、免疫活性型CD68+マクロファージは0.86倍に減少していた (P<0.05; 95% CI 0.74–0.99)。組織レベルではEBV陽性DLBCL でMHCクラスII (HLA-DR) 発現が選択的に低下し、MHCクラスIは差がなかった。CD4 T細胞機能不全スコアはEBV陽性で有意に高く (タンパク質レベル P=0.003、RNAレベル P=0.019)、CD8 T細胞の機能不全スコアには有意差がなかった (P=0.099)。1ホップ隣接解析により5種のCD4 T細胞ネイバーフッドモチーフを同定し、免疫豊富なMotif 1が最も機能不全スコアが高く、EBV陽性例に多く出現した (P=0.0016; Fig 4)。
LMP1発現腫瘍細胞周囲のC1Q+マクロファージニッチとIL27–STAT3軸の同定：
シングルセル解像度の解析（CODEX-CosMx、n=22 EBV+/n=17 EBV−）および独立した検証コホート（計55 EBV+/41 EBV− FOV; field of view）でもEBV陽性例でC1Q+マクロファージシグネチャが一貫して高く、CD4 T細胞機能不全と有意な正の相関を示した。近傍 (20 μm以内) の1ホップ解析ではEBV陽性腫瘍細胞周囲のC1Q+マクロファージ割合がEBV陰性対照に比べてlog10倍変化2.0 (95% CI 1.91–2.10) であり、EBV陽性内でもLMP1 (latent membrane protein 1; 潜在性膜タンパク質1) 陽性腫瘍細胞はLMP1陰性腫瘍細胞に対してlog10倍変化1.22 (95% CI 1.13–1.30) のC1Q+マクロファージ集積を示した (Fig 7)。LMP1陽性腫瘍細胞ではCD40模倣活性により下流にSTAT5活性化・TNF・IL27・NF-κBシグナリングが増強され、LMP1陽性腫瘍細胞に隣接するマクロファージはIDO1・LGALS9・GPNMBなどの免疫調節遺伝子を高発現し、T細胞増殖負の制御・補体シグナリング・フェロトーシス関連経路が濃縮されていた。Squidpyを用いたリガンド-受容体 (L-R) 相互作用解析では、LMP1陽性腫瘍細胞と隣接マクロファージ間でEBI3–STAT3・EBI3–IL27RA・EBI3–IL6STのIL27–STAT3シグナル軸が有意に濃縮されており、同軸が免疫抑制性マクロファージ分極の潜在的メカニズムとして同定された (Fig 7)。
考察/結論
① 先行研究との違い: 従来の空間マルチオミクス統合法はSpatialGlue・MaxFuse・MARIOなどの連続切片間計算的統合に依存しており、切片間の細胞欠落・組織変形・アライメント誤差によるグラフ構造へのトポロジカルノイズが避けられなかった。これと異なり、IN-DEPTHは同一スライド上で「タンパク質ファースト」の逐次的統合を実現し、空間的忠実度の高いグラウンドトゥルースデータ上でSGCCを適用できる点で本質的に異なる。また既存のEBV関連DLBCLの研究はバルクまたは単一モダリティ解析が主流で、LMP1シグナルと特定のマクロファージサブタイプ (C1Q+) および特定シグナル軸 (IL27–STAT3) とをシングルセル空間解像度で連結する実証は本研究が初めてである。
② 新規性: IN-DEPTHは空間プロテオミクスが提供する高品質な細胞型コンテキストに基づいてROIを設定し、同一スライドでトランスクリプトームを取得するという新規なワークフローを提示した。SGCCはスペクトルグラフウェーブレット変換に基づく新規な空間パターン定量化手法であり、グローバルからローカルの空間組織を連続スケールで捉え、古典的空間統計法では識別困難な細かな空間差を検出できることを初めて示した。
③ 臨床応用: EBV陽性DLBCLがEBV陰性例と比較して選択的にCD4 T細胞機能不全を示し、MHCクラスII抗原提示が障害されているという知見は、EBV関連DLBCLにおける免疫チェックポイント阻害療法への応答不良を一部説明し得る。特にLMP1–C1Q+マクロファージ–IL27–STAT3軸は新規治療標的候補として臨床的意義を持ち、EBV負荷とC1Q+マクロファージシグネチャを統合したバイオマーカーで免疫チェックポイント阻害の応答予測が可能になる可能性がある (Eigenbrood et al. CancerRes 2025)。IN-DEPTHはFFPE組織に対応しており、既存の臨床パスソロジー標本への適用が可能であることも実装上の利点である (Li et al. Cell 2026)。
④ 残された課題: Orion-GeoMxプラットフォーム組み合わせでは遺伝子間相関がR=0.692と他の組み合わせより低く、最適化が必要である。また今回同定したIL27–STAT3軸は推論された相互作用であり、機能的な因果関係の検証 (perturbation実験など) は今後の研究に委ねられる。LMP1陽性腫瘍細胞によるEBI3分泌がマクロファージのIL27RA–STAT3経路を介して直接免疫抑制を誘導することの証明、また同様の腫瘍ウイルス-免疫軸が他のウイルス関連悪性腫瘍にも存在するかどうかも今後の検討課題である。
方法
多施設FFPE組織を用いた空間マルチオミクス研究。IN-DEPTHワークフロー: (1) pH9.0バッファーで97°C 20分の熱誘導エピトープ回復 → (2) 光褪色 → (3) 高多重化抗体染色・撮像 (PhenoCycler-Fusion等) → (4) フローセル除去・RNAプローブハイブリダイゼーション → (5) 空間トランスクリプトミクス取得 → (6) H&E染色。統計: 2標本間の比較はWilcoxon順位和検定、相関はSpearman相関またはPearson相関、マクロファージサブセット比較に負の二項回帰を使用。EBV陽性DLBCLコホート: DFCI (IRB# 2016P002769、2014P001026) およびRochester (IRB# STUDY159) 由来TMA (n=17 EBV+、n=13 EBV−)。検証コホート: Tübingen大学病院 (n=4 EBV+、n=4 EBV−)。EBV状態はEBER in situ hybridizationで確認。Squidpyによるリガンド-受容体相互作用推定。