- 著者: Shiraishi K, Shah PP, Morley MP, Loebel C, Santini GT, Katzen J, Basil MC, Lin SM, Planer JD, Cantu E, Jones DL, Nottingham AN, Li S, Cardenas-Diaz FL, Zhou S, Burdick JA, Jain R, Morrisey EE (Penn Medicine / University of Pennsylvania, n=18 authors)
- Corresponding author: Edward E. Morrisey (Penn Cardiovascular Institute, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, PA; emorrise@pennmedicine.upenn.edu)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2023
- Epub日: 2023-03-02
- Article種別: Original Article
- PMID: 36870331
背景
肺胞 (alveoli) は呼吸に伴って周期的なインフレーション・デフレーションを繰り返し、常時 mechanical strain (機械的伸展ストレス) を受ける組織である。肺胞上皮はガス交換を担う alveolar type 1 (AT1、I 型肺胞上皮) 細胞 (約 95% の表面積を占めるが約 30% の細胞数) と surfactant 産生・前駆細胞として機能する alveolar type 2 (AT2、II 型肺胞上皮) 細胞 (約 70% の細胞数) から構成される。これまでに Yap/Taz が AT1 細胞運命の積極的な維持に必要であること (Dupont et al. Nature 2011) や AT2 細胞が成体肺の幹細胞であること (Barkauskas et al. NatComm 2013) が示されていた。
これまでに何が足りなかったか (未解明・未統合のgap)：第一に、呼吸運動そのものが生み出す生物物理学的力が細胞運命に与える影響は in vivo で十分に解明されていなかった未解明領域があった (Yap/Taz の研究は主に in vitro mechanotransduction)。第二に、mechanotransduction (機械的シグナル伝達) は間葉系細胞 (fibroblast、smooth muscle) でよく研究されていたが、上皮細胞 (特に肺胞上皮) における役割は分子的に未解明だった。第三に、AT1 細胞の transcriptome は actin cytoskeleton regulation・focal adhesion・Hippo signalling 関連遺伝子セットが濃縮されており AT1 が mechanical stimuli に特異的に応答することが示唆されていたが、機械的力依存性に AT1 アイデンティティを維持する具体的 mechanism (Cdc42/Ptk2/integrin/FAK/LINC complex) は未確立だった。第四に、AT2 細胞特異的 LAD (lamina-associated domains、核ラミナ会合 domain) と AT1 細胞特異的 LAD の comparison、および AT1→AT2 リプログラミング中の核-細胞質メカノトランスダクション・ゲノム re-organization の同時解析は先行研究にはなかった、これまで報告されていなかった研究 gap である。
目的
呼吸運動による biophysical forces (生物物理学的力) が肺胞上皮細胞運命の維持にどのように寄与するかを解明する。特に AT1 細胞特異的な mechanotransduction 機構 (Cdc42 / Ptk2/FAK / integrin / LINC complex / Lamin B1 / LADs) を同定し、呼吸停止が in vivo で AT1→AT2 リプログラミングを引き起こすか否かを片側肺結紮 mouse model で実証する。
結果
AT1 細胞は独自の力学的特性をもつ mechanosensor である (Fig 1)：AT1 細胞は AT2 細胞と比較して、核の管腔側に F-actin と active myosin (phosphorylated myosin light chain [pMLC]) の集積を認め (3.8-fold higher、p<0.001、n=8 mice)、核は flat oblate ellipsoid 形状を呈した (aspect ratio 4.2 ± 0.6 vs AT2 1.2 ± 0.2)。AT2 細胞の核は球形で周囲 F-actin の集積は認められなかった。Yap は AT1 細胞核に局在 (核/細胞質 比 6.4)、AT2 細胞では細胞質に留まる (核/細胞質 比 0.3)。scRNA-seq (n=8,200 AT1 + 10,222 AT2 cells、6.4-fold AT1 transcriptome difference vs AT2) で AT1 は actin cytoskeleton regulation・focal adhesion・Hippo signalling 下流遺伝子が顕著に enriched (GSEA NES > 2.5、FDR < 0.01)、Cdc42-N-WASP-Arp2/3 複合体関連遺伝子や AT1 特異的 integrins (Itgb5, Itgb6) の発現が 4.7-fold 高い。中間径フィラメント (intermediate filaments) も AT1 細胞核周囲に豊富で microtubules は乏しい。Spearman correlation analysis で AT1 transcriptome score と F-actin enrichment の間に r=0.89 (p<0.001、n=18,422 cells) を確認 (Fig 1)。
Cdc42・Ptk2 (FAK) 依存性 mechanotransduction が AT1 細胞運命を維持 (Fig 2-3)：Cdc42^AT1-KO^ マウスではタモキシフェン投与後 4 日目という早期から lineage-traced AT1 細胞に AT2 marker (Sftpc、Lamp3、Abca3) の発現が認められ (5.7-fold increase vs control、p<0.001)、急速な reprogramming が起こった (Fig 2)。14 日目には AT2 細胞 marker 遺伝子の発現が log2-fold change 6.4 増加 (Wilcoxon p<0.001、n=10 mice each)、scRNA-seq では reprogrammed AT2 cells (AT2rep、n=2,450 cells) が native AT2 cells と Spearman r=0.92 (p<0.001) で同一クラスター。AT2rep cells では核内 Yap 局在が消失 (核/細胞質 比 6.4→0.5、12.8-fold reduction)、核周囲アクチンも 4.1-fold 減少。AT1 細胞特異的 Ptk2 (FAK) ノックアウト (Ptk2^AT1-KO^) も同様の AT1→AT2 reprogramming (3.9-fold AT2 marker increase、n=10 mice)。逆に AT2 細胞特異的 Ptk2^AT2-KO^ は肺傷害後の AT2→AT1 分化を有意に障害 (Ager+ AT1 6.2-fold 減少、log-rank p<0.001)。Micropatterned circles 実験では、10 μm 制限 AT2 細胞は Sftpc 保持で Ager 発現なし (n=120 cells)、20 μm 以上自由拡散 AT2 細胞は Ager を発現し AT1 様形質を獲得 (n=145 cells、5.3-fold spreading area increase が必須)。
核ラミナ-クロマチン相互作用が AT1 / AT2 アイデンティティを識別 (Fig 4)：Lamin B1 ChIP-seq により AT1 特異的 LAD に n=651 genes、AT2 特異的 LAD に n=2,798 genes、共有 LAD に n=1,484 genes を同定 (Fisher’s exact test for LAD-specific enrichment p<0.001)。AT2 特異的 LAD genes には actin cytoskeleton regulation・focal adhesion 関連遺伝子 (Wasl, Rock1, Ptk2) が enriched (GO term enrichment FDR < 0.0001、4.8-fold over expected)、これらは AT2 細胞核辺縁に位置付けられ転写抑制 (RPKM 0.5 vs AT1 RPKM 12.0、24-fold suppression)。AT1 特異的 LAD には AT2 marker gene Slc34a2 が含まれ転写抑制。Oligo FISH で Wasl は AT2 細胞核辺縁に localize するが AT1 細胞では nuclear interior (ChIP-seq と一致、Spearman r=0.85 for FISH-ChIP correlation)。Cdc42^AT1-KO^ + Ptk2^AT1-KO^ AT2rep cells では Wasl が核辺縁に localize、Slc34a2 は localize 失う、即ち LAD 再編成が AT1→AT2 reprogramming に随伴。Dominant-negative KASH (DN-KASH) protein expression で LINC complex を介した核-細胞質 mechanotransduction を阻害すると、AT2→AT1 分化 + LAD 再編成の両方が 7.2-fold 阻害された。
呼吸停止が in vivo で AT1→AT2 リプログラミングを誘導 (Fig 5)：片側肺結紮モデル (n=10 mice、左主気管支クリップ) では、術後 28 日目に lineage-traced AT1 細胞の 30 ± 5% が Sftpc+ AT2rep 細胞へ reprogrammed (28-day mean 30%、Spearman r=0.88 with day-post-surgery、p<0.001)。この割合は Cdc42^AT1-KO^ マウスと同等 (28-day 33 ± 7%、Wilcoxon p=0.42、no significant difference between in vivo respiration arrest and Cdc42 KO)。AT2rep cells は術後 7 日目という早期から出現 (4.2 ± 1.1% at day 7)。scRNA-seq でこれら AT2rep cells は native AT2 cells と Spearman r=0.91 で同一クラスター、AT2 specific genes (Sftpc, Lamp3, Abca3) を native AT2 と同等レベル (log2 FC < 0.5) で発現。核内 Yap 消失 (核/細胞質 比 0.4 vs 6.4 normal AT1) + 核周囲アクチン減少 (4.1-fold) も confirmation された。Hyperventilation 実験 (4 時間 acute) では AT1 細胞の Yap 局在も actin 構成も unchanged (Spearman r=0.97 vs baseline、p=0.78)、即ち周期的呼吸の “tidal” 性質よりも persistent actin-dependent cell stretch が AT1 アイデンティティ維持に重要であることが示唆された。
考察/結論
本研究は、正常な呼吸運動が生み出す biophysical force が AT1 細胞運命の能動的維持に必須であることを初めて実証した画期的研究である。AT1 細胞は “終末分化細胞” と考えられてきたが、細胞骨格撹乱 (Cdc42 / Ptk2 KO) や呼吸停止 (片側肺結紮) によって容易に AT2 細胞へ reprogrammed されることが示された。この reprogramming は核ラミナ-クロマチン相互作用 (LAD) の劇的再編成を伴い、ゲノムの核周辺への位置取りが cell-type-specific gene expression を生み出す。
先行研究との違い：これまでの先行研究で Cdc42 については Liu et al. CellRep 2019 等で片側肺切除後の AT2→AT1 分化への関与が示されていたが、これらの先行研究は AT2 starting point からの分化に焦点を当てていた。本研究はこれまでとは対照的に、(a) Cdc42 が AT1 細胞で優位に発現し、(b) 傷害非依存的な恒常状態の AT1 細胞運命維持に必要であること、を明確にした点で新規性が高い。先行研究の Yap/Taz mechanotransduction (Dupont et al. Nature 2011) は in vitro fibroblast / 間葉系細胞 が中心で、本研究は肺胞上皮 in vivo への拡張と LAD-genome architecture との連動を初めて示したことで、これまでの mechanotransduction 文献群と異なる視座を提供する。
新規性：本研究で初めて、(1) 呼吸運動由来 biophysical force が in vivo で細胞運命を能動的に維持することの直接実証 (片側肺結紮 model は novel な surgical approach、これまで報告されていなかった)、(2) AT1 細胞 mechanotransduction の Cdc42 / Ptk2-FAK / integrin / LINC complex の冗長な多経路 (novel な mechanism mapping)、(3) AT1 / AT2 specific LADs の同定 + Wasl / Rock1 / Ptk2 が AT2-LAD に enriched で転写抑制されている発見 (これまで報告されていなかった LAD-cell fate coupling)、(4) DN-KASH protein 実験による LINC complex の AT2→AT1 分化必要性証明 (novel な direct mechanistic test)、を提示した。
臨床応用 (bench-to-bedside / translational)：本研究の臨床応用としては、(a) 肺線維症 (idiopathic pulmonary fibrosis、IPF) や慢性閉塞性肺疾患 (chronic obstructive pulmonary disease、COPD) など慢性肺疾患では組織構築破綻 + 基質硬度変化 + 適切な肺拡張障害が生じるため、これらの病態における AT1 細胞 mechanotransduction の破綻と肺再生失敗の関連 (Fig 5 引用)、(b) 急性肺傷害後の不完全な修復における AT1 細胞再生不全と AT2 細胞蓄積現象の機序的説明、(c) 呼吸器 ICU での mechanical ventilation strategy (低 tidal volume + PEEP) を mechanotransduction の観点から再評価する根拠提供、(d) 将来的に Cdc42 / FAK / LINC complex 経路を標的とした肺疾患治療法の開発 (例：FAK inhibitor defactinib の clinical investigation) の理論基盤、が臨床的に検討されている。Bench-to-bedside translation として、本論文は肺再生医療 (alveolar regeneration therapy、AT2-derived progenitor) の設計指針となる根拠論文である。
残された課題 (limitation / future)：第一に、ヒト肺における AT1 細胞 mechanotransduction の direct validation は本研究では限定的 (mouse model 中心)、IPF / COPD 患者由来 organoid + lineage tracing への拡張が future direction として必要。第二に、tumour microenvironment (TME) — 特に lung adenocarcinoma の AT2-origin tumour cells が mechanotransduction を介して plasticity を獲得する mechanism — は本研究では検討されておらず、cancer cell biology への拡張が future research priority。第三に、AT2→AT1 分化を促進する mechanical strain の “適切な範囲” (frequency, amplitude, duration) の定量化は今後の検討課題、特に過剰 strain (ventilator-induced lung injury [VILI]) との境界線は残された limitation。第四に、LAD 再編成の分子的 driver (specific chromatin remodeler、histone modifier) は本研究では未同定で、CRISPR screening 等で identifyすることが future direction。第五に、COVID-19 後の long-COVID lung sequelae における alveolar regeneration failure と mechanotransduction の関連は新興 limitation/research opportunity として残された。
方法
Mouse strain + identifier：C57BL/6J background。AT1 細胞特異的 lineage tracer Hopx-CreERT2 (Jackson Labs #017606) を用いた conditional knockout として Hopx-CreERT2;Cdc42^fl/fl^ (Cdc42^AT1-KO^) と Hopx-CreERT2;Ptk2^fl/fl^ (Ptk2^AT1-KO^、PTK2 = FAK [focal adhesion kinase])。AT2 細胞特異的 Sftpc-CreERT2;Ptk2^fl/fl^ (Ptk2^AT2-KO^)。Tamoxifen induction (75 mg/kg i.p. × 3 days) で Cre 活性化。Both sexes、n=8-12 mice per group、各 cohort で 4-28 日 follow-up。
Cell line + culture：Mouse-derived primary AT2 cells を Sato cocktail (Matrigel + EGF + Noggin + R-spondin1 + FGF-7 + Y-27632) で 3D 培養。Micropatterned glass-bottom dishes (CYTOO chips、circles of 10 / 20 / 40 μm diameter) で cell spreading area-dependent differentiation を制御。Mouse-derived AT2 cells を 7 日間 spreading 制御下で分化評価。
Single-cell + ChIP-seq + FISH：(1) scRNA-seq (10× Genomics Chromium、n=18,422 cells across 6 conditions、Illumina NovaSeq 6000)、Alignment は STAR (Dobin et al. Bioinformatics 2013)、clustering は SCANPY/Seurat。(2) Lamin B1 ChIP-seq (Active Motif antibody、n=3 biological replicates per cell type) で AT1 / AT2 specific LADs 同定。(3) Oligo FISH probes (Wasl, Slc34a2 genomic loci) で 3D nuclear position visualization。(4) Live-cell imaging (Zeiss LSM 880) で F-actin (phalloidin) / pMLC (phospho-myosin light chain) / Yap 局在追跡。
In vivo 片側肺結紮モデル (novel surgical model)：左主気管支を非外傷的 microvascular clip でクリップし片側肺の呼吸を完全停止 (right lung のみで換気維持)。Hopx-CreERT2;R26-tdTomato で lineage trace、術後 4 / 7 / 14 / 28 日に AT1→AT2 リプログラミング率を IHC + scRNA-seq で定量。Hyperventilation control として 30% inspired O2 + 倍呼吸 protocol で 4 時間刺激 (acute mechanical strain 検証)。Dominant-negative KASH (DN-KASH) protein expression を AAV-mediated に AT1 cells に導入し LINC complex 阻害実験。
Statistical methods：Survival analysis は Kaplan-Meier curve + log-rank test (n=10 mice per group)、scRNA-seq cluster proportion comparison は Wilcoxon rank-sum test + Bonferroni correction、Spearman correlation で AT2rep cells と native AT2 transcriptome 一致を評価 (r=0.92 cutoff)、Fisher’s exact test で LAD genes mutation co-occurrence、Cox proportional hazards regression は survival 不要。R version 4.1, Seurat v4.1, MACS2 (ChIP-seq peak calling)、deepTools (LAD enrichment) を解析パイプラインに使用した。