FISH

一行要約

FISH (蛍光 in situ ハイブリダイゼーション) は蛍光標識 DNA プローブを用いて間期核・中期分裂像の特定遺伝子座を可視化する分子病理 gold standard で、肺癌領域では ALK / ROS1 / RET 融合遺伝子検出、MET 増幅、HER2 増幅 の診断確定 assay として、Kwak et al. NEnglJMed 2010 以降の precision oncology 時代を駆動した手法である。一方で multiplex 性に欠けるため、NGS-panel / Bulk-RNA-seq / IHC との role-sharing が現在のルーチン診断の標準。

一行要約 (補足)

EML4-ALK の発見 (Soda et al. Nature 2007) と crizotinib の臨床効果実証 (Kwak et al. NEnglJMed 2010、Camidge et al. LancetOncol 2012)、ROS1 rearrangement の同定 (Bergethon et al. JClinOncol 2012、Takeuchi et al. NatMed 2012) はいずれも break-apart FISH を companion diagnostic として確立し、NSCLC の fusion oncogene 時代 を切り開いた。

メカニズムと派生手法

標準ワークフロー

(1) 検体: FFPE 切片 (4–5 μm) / touch imprint / 細胞診検体。前処理 (脱パラフィン、蛋白分解、変性) が hybridization 効率を左右。(2) プローブ設計: 標的遺伝子座を覆う BAC / fosmid 由来 DNA をフルオロフォア (SpectrumOrange / SpectrumGreen / Aqua 等) で nick translation 標識。(3) Hybridization: 標的 DNA とプローブを共変性 → 一晩 hybridize (通常 37 °C, 16 h)。(4) 洗浄 + DAPI 対比染色 → 落射蛍光顕微鏡で 50–100 cells 判読。(5) 判定: 陽性カットオフは assay ごとに pre-validated (ALK Vysis: ≥ 15% split / single-3’ 細胞、MET: MET/CEP7 ≥ 2.0 等)。

主要 assay 形式

形式	原理	用途例
Break-apart FISH	切断点両側に異なる色 → 分離シグナルで rearrangement 検出	ALK (Vysis Abbott)、ROS1、RET、NTRK1/2/3、EWSR1
Dual-fusion FISH	2 遺伝子別色 → 融合接近で同色 colocalization	BCR-ABL1 (血液)、肺癌では RET-KIF5B 検証
Locus-specific + control	標的 + 中心体 / 内部対照の比	MET/CEP7、HER2/CEP17、EGFR/CEP7
CISH / DISH	蛍光を酵素発色で置換、明視野顕微鏡で判読可能	HER2 (乳癌) / ALK (一部 NSCLC ラボ)

関連手法との比較

• vs IHC: タンパク発現を可視化、安価で multiplex 不要。ALK では D5F3 / 5A4 抗体 IHC が FISH と高い一致率を示し (Conklin et al. JThoracOncol 2013、Selinger et al. ModPathol 2013) スクリーニングのデフォルトに。ROS1 SP384 IHC も FISH に匹敵する感度 (Hofman et al. JThoracOncol 2019)。
• vs RT-PCR / Bulk RNA / NGS fusion panel: RNA-based assay は EML4-ALK の variant 1/2/3 を直接読み出し variant 別 efficacy 評価が可能 (Yoshida et al. JClinOncol 2016)。NGS は novel partner 同定に強い (Nakaoku et al. ClinCancerRes 2014)。
• vs single-molecule FISH (smFISH) / RNA ISH: 個別 RNA 分子を可視化、空間トランスクリプトーム時代の基盤。

主要エビデンス (肺癌領域での貢献)

ALK 融合と crizotinib

Soda et al. Nature 2007 が EML4-ALK 融合を NSCLC で発見、Vysis break-apart FISH (LSI ALK Dual Color, Abbott) が companion diagnostic として開発された。Kwak et al. NEnglJMed 2010 が ALK FISH 陽性 NSCLC に対する crizotinib の劇的奏効を報告し、precision oncology の象徴的成果に。Camidge et al. LancetOncol 2012 は phase 1 拡大 cohort で ORR 約60%、PFS 中央値 約10 ヶ月を確立。Camidge et al. ClinCancerRes 2010 は IHC スクリーニング + FISH 確定の hybrid アルゴリズムを提案、現代の testing flow の原型となった。Soria et al. AnnOncol 2018 は FISH 陽性細胞の比率と crizotinib 効果の相関を 3 prospective 試験で検証、cut-off 周辺の borderline cases では IHC / NGS 補完が推奨されると示した。

ROS1 / RET / NTRK 融合

Bergethon et al. JClinOncol 2012 は ROS1 break-apart FISH で 1.7% の NSCLC を ROS1 陽性と同定、crizotinib 感受性を実証。Takeuchi et al. NatMed 2012 が break-apart FISH + IHC + RT-PCR の triple cross-validation で RET / ROS1 / ALK の頻度と分布を体系化。Sun et al. JThoracOncol 2019 は ROS1 FISH / IHC / NGS 間の不一致が腫瘍内 heterogeneity に由来することを示し、複数 modality 併用の必要性を強調。NTRK 融合では FISH / IHC / RT-PCR / NGS の長短が論じられ (Solomon et al. CancerRes 2019)、low prevalence では pan-Trk IHC スクリーニング → confirmatory NGS / FISH のアルゴリズムが推奨される。

MET / HER2 増幅

MET 増幅は EGFR-TKI 耐性機構として古典的 (Engelman et al. Science 2007) であり、MET/CEP7 比 ≥ 5 の high-level amplification が osimertinib 耐性の薬剤標的 (Sequist et al. LancetOncol 2020)。MET exon 14 skipping 自体は配列 / NGS で検出されるが、増幅は FISH が定量的に有用 (Awad et al. JClinOncol 2016)。HER2 では NSCLC の amplification が driver の一部を構成するが頻度は低く、Smit et al. LancetOncol 2024 の DESTINY-Lung01 では HER2 mutation 主軸で展開 (FISH は補助)。

限界と pitfall

解析的限界

• 判読者間 variability: split signal の判定は経験依存。中央検査機関での読影が大規模試験で標準。
• Single-modality: 1 プローブセット = 1 alteration、multiplex 化困難。NSCLC では ALK / ROS1 / RET / NTRK / MET / HER2 を同時にカバーするには NGS / RNA fusion panel が効率的。
• Inversion vs translocation: EML4-ALK は同一染色体内逆位のため、break-apart シグナル間距離が小さい場合に偽陰性。NGS / RNA-seq で rescue 可能。
• Low tumor cellularity: 50–100 cells を判読する必要があり、生検検体で困難なことがある。
• Pre-analytical factors: FFPE 固定時間 (< 6 h は under-fixation、> 72 h は over-fixation)、切片厚、脱灰 protocol がシグナル品質に直結。

現代診断における residual role

NGS panel が SOC となった現在でも FISH が残る用途:

1. NGS で検出困難な novel fusion partner の存在検証 (break-apart positive but no NGS hit)
2. MET amplification の定量 (NGS の copy number は purity / heterogeneity 依存性が高い)
3. 少量検体 / RNA 不良 FFPE での rescue (DNA-FISH は RNA quality 不要)
4. Companion diagnostic としての規制承認の連続性 (過去の臨床試験 protocol 互換性)

Open Questions

• NGS / RNA fusion panel SOC 時代の FISH の位置づけ — orphan companion diagnostic として残るのか、完全に置換されるのか
• MET amplification cut-off の臨床標準化 — MET/CEP7 ≥ 2 vs ≥ 5 vs gene copy number ≥ 10 のどれを使うか
• Heterogeneous expression / mosaic positivity の臨床解釈 (Sun et al. JThoracOncol 2019)
• AI-assisted automated FISH scoring によるラボ間 variability の縮小
• Liquid biopsy への応用: ctDNA-based fusion detection (NGS-panel / ctDNA-liquid-biopsy) と組織 FISH の補完性

重要論文 Top 10

1. Kwak et al. NEnglJMed 2010 — ALK FISH 陽性 NSCLC への crizotinib 劇的奏効、precision oncology の paradigm-defining work
2. ★★★★★ Soda et al. Nature 2007 — EML4-ALK 融合発見、break-apart FISH companion diagnostic の起点
3. ★★★★★ Bergethon et al. JClinOncol 2012 — ROS1 break-apart FISH で 1.7% NSCLC を同定、crizotinib 感受性確立
4. ★★★★ Camidge et al. LancetOncol 2012 — ALK FISH-selected NSCLC への crizotinib phase 1 拡大、ORR/PFS の foundation
5. ★★★★ Soria et al. AnnOncol 2018 — FISH 陽性比率と crizotinib efficacy の量的関連、borderline cases の解釈基盤

関連エンティティ

• ALK / ROS1 / MET / HER2
• NGS-panel / In-situ-hybridization
• Crizotinib / Alectinib

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