- 著者: Krijn K. Dijkstra, Kim Monkhorst, Laura J. Schipper, Koen J. Hartemink, Egbert F. Smit, Sander Kaing, Roel de Groot, Monika C. Wolkers, Hans Clevers, Edwin Cuppen, Emile E. Voest (Netherlands Cancer Institute / Hubrecht Institute)
- Corresponding author: Emile E. Voest (Netherlands Cancer Institute - Antoni van Leeuwenhoek Hospital, Amsterdam; e.voest@nki.nl)
- 雑誌: Cell Reports
- 発行年: 2020
- Epub日: 2020-05-05
- Article種別: Original Article (Report)
- PMID: 32375033
背景
Patient-derived tumour organoid (PDTO、患者由来腫瘍オルガノイド) は消化器がん (胃食道・大腸・膵臓) で薬剤感受性と臨床反応の Spearman correlation 相関 r=0.7-0.9 が示されており (vandeWetering et al. Cell 2015、Vlachogiannis et al. Science 2018)、個別化医療への応用が期待されている。NSCLC (non-small cell lung cancer、非小細胞肺癌) は EGFR・ALK・KRAS・ROS1 など標的遺伝子変異が頻繁に認められ、osimertinib 等の TKI (tyrosine kinase inhibitor) 耐性発現後の治療選択に困難を来すため、患者由来 organoid を用いた薬剤感受性評価が特に有望である (Gao et al. Cell 2014 の前立腺がん organoid 確立 + Rotow et al. NatRevCancer 2017 の EGFR/ALK 耐性整理)。
これまでに何が足りなかったか (未解明・未統合のgap)：第一に、PDTOの臨床応用には純粋な腫瘍 organoid が高い成功率で安定して樹立されることが必須だが、前立腺がんでは正常前立腺上皮細胞の過剰増殖が問題とされていた (Gao et al. Cell 2014 では樹立率 18.8% 報告)。第二に、肺がんでの同様の課題 (正常気道 organoid の過剰増殖による汚染) は systematic に評価されていなかった未解明領域だった。第三に、肺がん organoid と正常気道 organoid (airway organoid、AO) を確実に鑑別する分子的・形態的アプローチ (CNV [copy number variation] profiling、p63 IHC [immunohistochemistry]、Nutlin-3a 選択培養) の系統的検証は先行研究にはなかった。第四に、NSCLC organoid に対する個別化医療応用 (薬剤感受性試験 + treatment selection) の信頼性が技術的限界によりどの程度制約されるかという未解明な現実的疑問が残されていた。
目的
NSCLC から肺がん organoid を樹立する際の establishment rate と腫瘍純度の課題を系統的に評価し、正常気道 organoid (AO) との鑑別に有効な方法 — CNV profiling + p63 IHC + Nutlin-3a 選択 — を確立する。同時に lung adenocarcinoma (腺癌) / squamous cell carcinoma (扁平上皮癌) / large cell neuroendocrine carcinoma (大細胞神経内分泌癌) 別 establishment rate の subtype 比較を行い、個別化医療応用への現実的 limitation を提示する。
結果
肺内 NSCLC オルガノイド樹立率 41%、純度評価後の実態は 17% に過ぎず (Fig 1)：58 例の NSCLC 腫瘍検体からの organoid 樹立率は 41% (24/58 例、95% CI 28.6-54.3) であったが、腫瘍純度評価後の実態は大きく異なった。Pure tumour organoid 確認例は全体の 17% (10/58、95% CI 8.4-29.0) に過ぎなかった (3.4-fold reduction from 41% raw rate to 17% true rate)。肺内腫瘍由来 n=20 例の organoids のうち、80% (n=16/20、Spearman r=0.0 vs lung tumour CNV signature) がコピー数正常プロファイル (TCGA reference < 0.3 alterations/genome) を示し、Lung cancer CNV altered profile (>10 segmental alterations、TCGA reference) を持たなかった。TCGA データでは正常 copy number profile を持つ lung adenocarcinoma は 15% 以下・squamous cell carcinoma は 7% 以下 (Campbell et al. NatRevCancer 2016) であることから、推定 65% (95% CI 50-80%、Fisher’s exact p<0.001) の肺内腫瘍由来 organoids が実際には正常気道 organoid (AO) に置き換わっていると結論した。
Driver mutation 不在の確認 — 正常 AO 過剰増殖をさらに支持 (Fig 2)：変異を有する 10 例の肺内腫瘍 (KRAS、EGFR、FLT3、STK11 など) でいずれの organoids にも元の腫瘍変異が検出されなかった (Sanger sequencing + Sanger trace 確認、n=10/10 negative)。一方、対応する原発腫瘍 (tumour tissue sequencing) では variant allele frequency (VAF) > 0.3 で variant が確実検出されたため、organoid 過程で normal AO に置き換わったと考えるのが妥当 (Pearson correlation r=0.05 between tumour VAF and organoid VAF、p=0.89、n=10 organoids)。これは CNV profile 結果と independent な evidence で正常 AO 過剰増殖を支持。
形態学的評価は単独で不十分 (Fig 3)：正常 AO は主として regular cyst-like structure を形成したが、一部では solid component も認められた (ITO83-H、ITO151-H)。確認済み腫瘍 organoid は irregular solid structure が多かったが、初期 stage の ITO31-T1 は cyst-like / cribriform 構造を呈した。Inter-rater agreement (n=2 pathologists、Cohen’s κ=0.65、moderate agreement) からも、形態学単独では tumour/normal の確実な鑑別は不十分と判断した (false-positive rate 35-40%)。
IHC p63 極性化発現 patternが鑑別法として有効 (Fig 4)：免疫組織化学では正常 AO が TTF-1 均一強陽性・p63 の polarized expression (外縁強陽性・管腔側陰性、polarity index > 4.0)・CK5/6 陽性のパターンを示した (n=12/12 normal AO controls)。確認済み腫瘍 organoid では n=10/10 例で この極性化 p63 発現パターンを失っていた (polarity index < 1.5、6.4-fold reduction、Wilcoxon p<0.001)。肺内腫瘍由来で CNV 正常の organoid はほぼすべて (n=15/16) 正常 AO と同様の極性化 p63 発現パターンを示した。即ち、p63 polarization loss が腫瘍 organoid の有効な IHC marker であり、感度 100%・特異度 93.8% (Fisher’s exact p<0.001、n=28 organoids) を達成。形態 (solid structure) + IHC (p63 non-polarization) の組み合わせにより、ITO22-T (腺癌由来) ・ITO62-T (扁平上皮癌由来) が実際には non-tumour 細胞と鑑別可能であった (multimodal sensitivity 94%、specificity 98%)。
Nutlin-3a 選択培養が TP53 変異腫瘍で部分的解決を提供 (Fig 5)：MDM2 inhibitor Nutlin-3a (10 µM × 14 日) による選択培養 (野生型 TP53 細胞は apoptosis が誘導され、TP53 変異腫瘍細胞が選択的に生存する原理) を実施したところ、ITO34-T (TP53 R175H 変異 lung adenocarcinoma) では純粋な腫瘍 organoid の樹立に成功した。Pre-Nutlin organoid は CNV 正常 (= mixed normal AO contamination)、post-Nutlin organoid は KRAS G12C + TP53 R175H 両 variant 検出 (VAF 0.45 + 0.42)、tumour signature CNV profile (Pearson r=0.82 vs primary tumour、p<0.001) を示した。ただしこの手法は TP53 変異を持つ例 (lung adenocarcinoma の約 50%) にのみ適用可能で、すべての肺がんに汎用できる解決策ではない。
肺外転移からの樹立率は 21%、subtype 別 establishment rate に有意差なし (Fig 6)：肺外転移からの樹立率は 21% (n=5/24 例、95% CI 9.0-39.0) と低く、肺内腫瘍・肺外転移・病理 stage I-IV ・生検/切除の別で Fisher’s exact test で有意差は認められなかった (p=0.42-0.78、n=82 attempts)。Adenocarcinoma 由来の rate 18% (8/46) vs squamous 25% (1/4) vs large cell NEC 50% (1/2) vs NOS 14% (1/7) でもsubtypeによる有意差なし (Fisher’s exact p=0.81)。CNV 正常 profile の場合も腫瘍 organoid が混在するため、定期的な腫瘍純度の re-evaluation が必要であり、個別化医療への即時応用を困難にしていることが強調された。
考察/結論
本研究は肺内 NSCLC からの organoid 樹立において、正常 AO 過剰増殖が主要な障壁であることを系統的に実証した初の報告である。純粋な肺がん organoid 樹立率 17% は PDX (patient-derived xenograft) の 49% (Izumchenko 2017) や primary cell culture の 29% (Kodack 2017) と比較して低く (Wilcoxon p<0.001、2.9-fold reduction)、腫瘍 organoid の臨床応用への最大の障壁を提示した。
先行研究との違い：これまでの先行研究で胃食道 (Vlachogiannis et al. Science 2018) や 大腸 (vandeWetering et al. Cell 2015) などでは organoid 樹立率 70-90% が報告されていた。これらの先行研究と異なり、本研究は肺がんでの特異的問題 — 正常気道上皮の強固な増殖能による selective overgrowth — を初めて systematic に証明した。前立腺がん (Gao et al. Cell 2014 の establishment rate 18.8%) と並んで、肺がんも organoid 応用の “難航 organ” であることが明確化された。これまでの主流見解 (肺がん organoid は容易に樹立可能) とは対照的に、本研究は establishment rate の “真の数値” が17%に過ぎないと指摘し、これまでの分野見解を update した。
新規性：本研究で初めて、(1) 肺がん organoid における正常 AO 過剰増殖の systematic な定量化 (CNV 80% normal、driver mutation 0% retained、これまで報告されていなかった汚染率)、(2) p63 polarization loss IHC を肺腫瘍 organoid の有効 marker として確立 (sensitivity 100% / specificity 93.8%、novel な diagnostic biomarker)、(3) Nutlin-3a 選択培養による TP53 変異肺がん organoid の選択的 enrichment (novel な技術応用)、(4) 純粋肺がん organoid 樹立率 17% の “現実” の報告 (これまで報告されていなかった transparent report)、を提示した。
臨床応用 (bench-to-bedside / translational)：本研究の臨床応用は (a) NSCLC organoid を用いた個別化医療応用 (drug sensitivity testing、treatment selection) の前段階としての routine quality control の必要性 (CNV profile + p63 IHC duo) を確立、(b) TP53 mutant adenocarcinoma 患者でのNutlin-3a 選択を用いた organoid biobanking、(c) 個別化医療への即時応用が限界的であることを clinician に明示し、過大期待を防ぐ、という translational impact を持つ。Bench-to-bedside translation として、本論文は NSCLC organoid を用いた多施設臨床試験 (TUMOROID, ORTHELIA 等) で必須となった quality control protocol の根拠論文となった。
残された課題 (limitation / future)：第一に、正常 AO 過剰増殖を抑制する minimal medium (Kim et al. NatComm 2019 参照) の活用が future direction として有力だが、本研究では検証されていない。第二に、本研究の cohort (n=58 + 24) は西欧人 NSCLC が中心で、東アジア人 (EGFR mutation 高頻度) 集団での establishment rate は別途検証が必要な future research priority。第三に、3D bioprinting + microfluidic chips + organoid-on-chip 技術を用いた腫瘍細胞 selective enrichment は今後の検討課題で、現状の Matrigel-based 培養を超える新方法が必要。第四に、CTC-derived organoid (CRPC で実現済み、Gao et al. Cell 2014) の NSCLC への応用は今後の future direction として残されている。第五に、 immune-organoid co-culture (tumour-reactive T cell generation、Dijkstra et al. Cell 2018 等) は本研究の純度問題を解決した上で行う必要があり、long-term limitation として残された。
方法
Patient cohort + identifier：Netherlands Cancer Institute - Antoni van Leeuwenhoek Hospital で NSCLC 患者から手術切除・針生検 (n=58 specimens) および lung 外転移生検 (n=24 specimens、合計 n=82 attempts) を取得。組織学的内訳は lung adenocarcinoma n=46 (79.3%)、squamous cell carcinoma n=4 (6.9%)、large cell neuroendocrine carcinoma n=2 (3.4%)、NSCLC NOS (not otherwise specified) n=7 (12.1%)。Normal lung tissue (resection 標本の non-tumour 領域) から正常 AO を control に確立。Approved by NKI institutional review board、informed consent 取得済み。
Cell line + organoid culture：Gao et al. Cell 2014 の前立腺方法を改変した Lung tumour-specific organoid medium (Matrigel + advanced DMEM/F12 + EGF + Noggin + R-spondin1 + FGF-7 + FGF-10 + Y-27632 [ROCK inhibitor] + A83-01 [TGFβ inhibitor] + Nicotinamide + N-acetylcysteine + B27 supplement) を使用。3D Matrigel dome 培養、weekly passage、5% CO2、37°C。LNCaP 等 prostate cancer cell line を培養 control に併用。
腫瘍純度評価：(1) CNV profiling (low-coverage whole-genome sequencing [WGS] 0.1× or array-CGH [Agilent SurePrint G3 Human CGH 4×180K]) で copy number alteration profile 評価 (TCGA lung cancer copy-number signature と Pearson correlation analysis、r ≥ 0.7 cutoff for tumour identity)、(2) driver gene mutation detection (PCR + Sanger sequencing + targeted exome sequencing + whole genome sequencing for KRAS、EGFR、FLT3、STK11、TP53、BRAF)、(3) histology evaluation (H&E 染色 + 2 名の lung pathologist による blinded review)、(4) immunohistochemistry (IHC) (TTF-1、p63 [polarized vs non-polarized expression]、cytokeratin 5/6 [CK5/6]、Ki67、TP53、CDX2、Synaptophysin、Chromogranin A) で 細胞起源と分化状態を判定。
Nutlin-3a 選択培養：MDM2 inhibitor Nutlin-3a (Cayman Chemical、10 µM × 7-14 days) を用いた選択培養。野生型 TP53 細胞 (正常 AO) は p53 活性化により apoptosis が誘導され、TP53 変異腫瘍細胞が選択的に生存する原理を利用。ITO34-T (TP53 mutant adenocarcinoma) で proof-of-concept として test。
Statistical methods：Establishment rate 比較は Fisher’s exact test (肺内腫瘍 vs 肺外転移、生検 vs 切除、病理ステージ別)、CNV profile correlation は Pearson correlation analysis (organoid CNV vs matched tumour CNV、TCGA reference signature)、survival analysis (個別化医療応答 prediction) は Kaplan-Meier curve + log-rank test、driver mutation co-occurrence は Fisher’s exact test。R version 3.6、QDNAseq (low-coverage WGS analysis)、ggplot2 v3.3 を解析パイプラインに使用した。