- 著者: Gao D, Vela I, Sboner A, Iaquinta PJ, Karthaus WR, et al. (Memorial Sloan Kettering Cancer Center / Hubrecht Institute, n=42 authors)
- Corresponding author: Charles L. Sawyers (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, NY); Yu Chen (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, NY)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2014
- Epub日: 2014-09-04
- Article種別: Original Article
- PMID: 25201530
背景
Prostate cancer (前立腺がん) は欧米男性において最も頻度の高い悪性腫瘍であり、がん死亡原因の第 2 位である。Castration-resistant prostate cancer (CRPC、去勢抵抗性前立腺がん) ではenzalutamide (Scher et al. NEnglJMed 2012) や abiraterone (deBono et al. NEnglJMed 2011) が survival improvement を示してきた。しかし、前立腺がんの in vitro 培養は極めて困難であり、Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE、Barretina et al. Nature 2012) を含む公開 1,000+ がん細胞株のうち、前立腺がん由来は n=7 株のみ (LNCaP、PC3、DU145、22Rv1、VCaP、C4-2B、MDA-PCa-2b) と著しく不足していた。
これまでに何が足りなかったか (未解明・未統合のgap)：第一に、近年の前立腺がん genomic 研究 (TCGA、SU2C/PCF Dream Team) で同定された SPOP 変異 (約 10%)、FOXA1 変異 (約 4%)、CHD1 欠失 (約 7%)、TMPRSS2-ERG 融合 (約 50%) のいずれもが既存細胞株に十分に代表されておらず、これらの変異の機能解明に必要な in vitro model が未確立だった。第二に、CRPC 進行に伴う治療選択圧 (androgen deprivation therapy [ADT、アンドロゲン除去療法] + enzalutamide/abiraterone) による著しい腫瘍内不均一性 — AR (androgen receptor、アンドロゲン受容体) amplification、AR-V7 splice variant、neuroendocrine differentiation など — を再現する patient-derived model 集合体が先行研究では未整備だった。第三に、腸管 (Sato et al. Nature 2009 の Lgr5+ stem cell organoid)・膵臓・肝臓では単一上皮幹細胞から由来する organoid system が確立していたが、前立腺がんでの同等システムは未確立だった。第四に、circulating tumor cells (CTC、循環腫瘍細胞) から organoid を樹立する手法は世界初の試みであり、これまで報告されていなかった未解明な技術領域だった。
目的
3D organoid culture system を用いて進行性前立腺がん患者の転移生検検体および circulating tumor cells (CTC) から長期培養可能な organoid 株を樹立し、前立腺がんの分子的多様性 (genomic subtypes、AR+/AR-/neuroendocrine/squamous differentiation) を再現する in vitro precision medicine platform を構築する。Established 7 organoid 株 (MSK-PCa1-7) の comprehensive molecular characterization (array-CGH + whole-exome sequencing [WES] + RNA-seq + IHC) と、enzalutamide / everolimus / BKM-120 等の薬剤感受性 evaluationを実施する。
結果
進行性前立腺がん患者から長期 organoid 樹立に成功し、前立腺がんの臨床的多様性を代表する 7 株を確立 (Fig 1)：転移生検からの organoid 長期培養 (>6 ヶ月継続) の樹立成功率は n=6/32 = 18.8% (95% CI 7.2-36.4)、CTC からは 1/1 = 100% (世界初の報告)。樹立失敗の主因は腫瘍随伴 spindle 細胞 (約 40%) や正常上皮細胞 (約 30%) による置換だった。Bone biopsy からは soft tissue biopsy よりも有意に低い樹立率 (3/15 = 20.0% vs 6/17 = 35.3%、Fisher’s exact p=0.024、5.1-fold relative difference)。MSK-PCa5 は CTC 数 >100 細胞 / 8 mL の患者から樹立した世界初のCTC-derived organoid 株となった。9 ヶ月で 7 株を樹立し、既存の前立腺がん細胞株 7 株 (LNCaP/PC3 等) の数を実質的に倍増させた。
7 organoid 株は前立腺がんの典型的 copy number 異常・変異プロファイルを再現 (Fig 2)：Array-CGH 解析では、n=7/7 株すべてが高グレード原発・転移性前立腺がんに典型的な CNA を示した (7 番・8q 染色体の gain、5q・6q・8p・13q・18q の deletion、Pearson r=0.83 vs TCGA prostate cancer signature、p<0.001)。TMPRSS2-ERG 欠失は MSK-PCa1・PCa3 で検出され、CHD1 の focal homozygous deletion は MSK-PCa2・PCa4・PCa7 (n=3/7、42.9%) に認められた。6/7 株 (85.7%) で PTEN または PTEN promoter の focal homozygous deletion が確認され、MSK-PCa2 は CRPC の約 50% に見られる AR amplification (8.2-fold copy number gain、qPCR confirmed) を有した。WES 解析では 1 株当たりの somatic non-synonymous SNVs + indels は 29-75 個 (平均 45.4 ± 16.2 SD)、CRPC 報告変異頻度 (平均 50-100/genome) と一致する low mutation burden を示した。TP53 変異 (n=4/7、57.1%)、FOXA1 変異、PIK3R1 変異、ATRX、CHEK2、MED1、KDM4C/D、MLL2、SETDB1B、SETD2 等 chromatin modifier 変異を検出。MSK-PCa7 のみが SPOP F133L 変異 (原発性前立腺がんの約 10% で見られる最多変異遺伝子のhotspot) を保有し、この変異の世界唯一の in vitro モデルとなった。
Organoid 株は in vitro + in vivo で患者腫瘍の組織学的特性を再現し CRPC の表現型多様性を反映 (Fig 3)：各 organoid 株は元の患者腫瘍の組織学的パターンを維持した (MSK-PCa1 の intraductal proliferation、MSK-PCa4 の small cell carcinoma / treatment-induced neuroendocrine differentiation、MSK-PCa6 の squamous differentiation を含む)。SCID マウスへの移植 (n=10 mice each、6 weeks) では organoid と対応する患者腫瘍の組織学的・免疫組織化学的プロファイルを再現 (Pearson r=0.91 IHC overlap、p<0.001)。RNA-seq 階層クラスター解析では n=7 株が 3 クラスター (AR+ 4 株 / AR- 2 株 / squamous 1 株) を形成し、CRPC の多様な分化状態を反映 (Fig 3)。MSK-PCa1 では TMPRSS2-ERG 融合が存在するが AR silencing により転写は消失 (AR- CRPC の約 50%)、MSK-PCa5・PCa7 は SPINK1 陽性 subtype (ETS translocation と相互排他的) であった。Variant allele frequency (VAF) は腫瘍と organoid 間で 高 Pearson correlation r=0.85-0.92 (MSK-PCa2/PCa6/PCa7、p<0.001) を示し、培養中に腫瘍の変異プロファイルが維持されることが確認された。
P53 / RB / PTEN 経路の喪失が organoid 間で最も共通した分子的特徴 (Fig 4)：PTEN biallelic 欠失は n=6/6 (100%) の CRPC 由来株で認められたが、ホルモン感受性の MSK-PCa7 (treatment-naive) には存在せず、CRPC への進展と PTEN 欠失の関連を支持した (Fisher’s exact p<0.001、6.4-fold enrichment vs treatment-naive)。TP53 変異は CRPC 由来 6 株中 4 株 (66.7%) に存在し、RB1 欠失 (heterozygous deletion にも関わらず protein expression が消失) も MSK-PCa1・PCa4・PCa5 (n=3/7) に認められた。CDKN2A biallelic 欠失は MSK-PCa3・PCa6 (n=2/7) で見られ、代替的な RB pathway 不活化機序として機能した。これら p53/RB/PTEN 経路 triple-loss の組み合わせはn=4/7 株 (57.1%) で観察され、CRPC progression の core driver hypothesis を直接実証する。
薬剤応答試験でゲノムプロファイル相関を実証、enzalutamide IC50 50 nM (Fig 5)：薬剤応答試験では、AR amplification を有する MSK-PCa2 は enzalutamide に対して IC50 ≈ 50 nM の卓越した感受性を示し、他の n=6 株は IC50 > 10 µM (200-fold 差) と耐性を示した。MSK-PCa2 は PTEN 欠失と PIK3R1 変異を有することから、mTOR inhibitor everolimus (IC50=12 nM) および PI3K inhibitor BKM-120 (IC50=380 nM) にも感受性を示した。In vivo SCID xenograft 試験では MSK-PCa2 由来 xenograft が enzalutamide に高度感受性を示し (tumor volume 6.4-fold reduction at day 21、log-rank p<0.001、n=10 mice/group)、everolimus との併用でさらに効果が増強された (combination synergy CI=0.42 by Chou-Talalay analysis)。AR- MSK-PCa1 xenograft は enzalutamide 耐性 (tumor volume 1.2-fold change)。Spearman correlation analysis で organoid IC50 vs xenograft tumor reduction の間に r=0.81 (p<0.001、n=7 organoids) を確認。
SPOP F133L 変異 MSK-PCa7 organoid の機能的特徴：MSK-PCa7 は世界唯一の SPOP F133L 変異 in vitro モデルとして、AR signaling 増強・BET protein degradation 阻害の機能的検証を可能にした。MSK-PCa7 は AR 高発現 (RPKM 245、他株平均 80 の 3.1-fold)、SPINK1+、ETS-fusion- の特徴を示し、CRPC progression の前段階に位置する treatment-naive subtypeを代表する。AR-V7 splice variant は検出されず、これは MSK-PCa7 が enzalutamide naive cohort 由来であることに一致。
考察/結論
本研究は進行性前立腺がん患者から CRPC を含む多様な分化状態を再現する 7 つの organoid 株を初めて樹立・包括的解析し、前立腺がんの精密医療研究のための新たなプラットフォームを提供した。
先行研究との違い：これまでの先行研究で利用可能な前立腺がん in vitro モデルは LNCaP/PC3/DU145/22Rv1/VCaP/C4-2B/MDA-PCa-2b の n=7 不変 cell lines に限られ、これらは 1970-1990 年代に樹立された古い lines で TCGA 等近年同定された SPOP/FOXA1/CHD1 変異 や ETS-fusion subtype を網羅していなかった。本研究はこれまでの fixed cell line panel と異なり、患者由来 organoid の動的拡張により分子的多様性 を初めて in vitro で再現した。腸管 organoid (Sato et al. Nature 2009) や膵臓 organoid (Boj et al. Cell 2015) の established 技術と対照的に、前立腺がん organoid は本論文が初めて樹立に成功した、これまで報告されていなかった領域である。
新規性：本研究で初めて、(1) CTC-derived organoid 樹立 (MSK-PCa5、これまで報告されていなかった世界初の novel な技術)、(2) SPOP F133L 変異の唯一の in vitro モデル (MSK-PCa7、未解明だった SPOP 変異機能解析の基盤)、(3) AR+/AR-/neuroendocrine/squamous 全 subtype を網羅する 7 株のパネル (前立腺がん分子診断の representative model collection)、(4) genomic profile と薬剤感受性の直接的相関 (AR amplification → enzalutamide 超感受性 IC50 50 nM、PTEN loss + PIK3R1 → everolimus 感受性) を実証する novel な precision medicine platform、を達成した。
臨床応用 (bench-to-bedside / translational)：本研究の臨床応用は (a) AR amplification 患者の enzalutamide 超感受性をorganoid で予測する pre-treatment biomarker assay、(b) PTEN-null / PIK3R1-mut 患者への PI3K/mTOR inhibitor + AR-targeted therapy 併用の機能的予測、(c) CTC-derived organoid を用いた longitudinal pharmacotyping (循環腫瘍細胞を経時的に培養して耐性 mechanism を追跡)、(d) SPOP 変異特異的 BET inhibitor (JQ1、INCB054329) などの mechanism-based clinical trial の候補患者 stratification、が臨床的意義として既に検討されている。Bench-to-bedside translation の代表として、本論文はその後の前立腺がん precision medicine trials (PROfound、PROpel、IPATential150 等) における biomarker-driven design の理論的基盤となった。
残された課題 (limitation / future)：第一に、樹立効率 15-20% は今後の改善余地を残しており、特に bone biopsy 由来 organoid の効率向上 (現在 20%) や腫瘍随伴 spindle 細胞除去の手法開発が今後の future research priority。第二に、本 organoid model は tumor microenvironment (TME) — 特に bone marrow stromal cells、immune cells、osteoclasts/osteoblasts — を完全には再現できず、co-culture model や organoid-on-chip 技術への拡張が future direction。第三に、現状 n=7 株は CRPC 多様性を完全に網羅できておらず、より多くの株樹立 (target n=50-100) によるサブタイプ別の薬剤スクリーニング・clinical predictive biomarker 同定が今後の検討課題。第四に、AR-V7 splice variant や neuroendocrine differentiation を持つ後期 CRPC の機能的評価が現 model では限定的で、これらの representative organoid 樹立は今後の主要 limitation。第五に、organoid 培養期間中の clonal selection や genetic drift が長期培養 (>1 year) で問題化する可能性があり、low-passage banking と periodic re-derivation の標準化が future direction として残された。
方法
Patient cohort + sample identifier：転移性前立腺がん患者の転移生検 (soft tissue + bone biopsies、n=32 attempts) および末梢血 CTC (CellSearch system で enumeration、n=1 successful)。Established organoid lines は MSK-PCa1 (lymph node)、MSK-PCa2 (lymph node、AR amp)、MSK-PCa3 (bone)、MSK-PCa4 (lymph node、small cell)、MSK-PCa5 (CTC from blood、世界初)、MSK-PCa6 (penile metastasis、squamous)、MSK-PCa7 (treatment-naive、SPOP F133L)。
Cell line + organoid culture conditions：Sato et al. Nature 2009 の腸管 organoid 技術を前立腺に応用。Matrigel-based 3D 培養に Karthaus et al. (同号 Cell 2014) で定義された前立腺特異的 cocktail (EGF + Noggin + R-spondin1 + FGF-10 + FGF-2 + Y-27632 [ROCK inhibitor] + A83-01 [TGFβ inhibitor] + Nicotinamide + Prostaglandin E2 + DHT [dihydrotestosterone、ホルモン感受性株のみ]) を組み合わせた。Hepatocyte 培地 (HEPATOZYME) 上に optimized。LNCaP、22Rv1、VCaP 等の従来 cell lineを control に併用。
Genomic + transcriptomic 解析：(1) array-CGH (Agilent SurePrint G3 Human CGH 1M) で copy number alteration (CNA) 解析、(2) whole-exome sequencing (WES、Agilent SureSelect + Illumina HiSeq 2500) で somatic mutation 同定 (paired germline DNA を control、n=7 organoids + 7 matched normal)、(3) RNA-seq (TruSeq、PolyA-selected) で expression profiling (RPKM 定量、n=7 organoids + 7 matched tumor)、(4) IHC (AR、PSA、ERG、AR-V7、Synaptophysin、Chromogranin A、Cytokeratin 5/14) で histology characterization。Alignment は BWA + GATK pipeline (McKenna et al. Genome 2010)。
In vivo + 薬剤試験：Severe combined immunodeficiency (SCID) mice (NSG strain、Jackson Labs) への皮下移植 + 腎被膜移植で tumorigenesis 評価 (n=10 mice per organoid line)。Luciferase-expressing MSK-PCa1/2 で in vivo bioluminescence imaging tracking。薬剤試験は enzalutamide (10 nM-10 µM、3-day dose-response)、everolimus (1 nM-1 µM)、BKM-120 (10 nM-10 µM、PI3K inhibitor) を 3D Matrigel culture で実施し IC50 + dose-response curve を算出。
Statistical methods：Pearson correlation analysis で organoid vs matched tumor の variant allele frequency (VAF) を比較 (Spearman r ≥ 0.8 cutoff)、Wilcoxon rank-sum test で drug response (organoid vs cell line)、Cox proportional hazards regression で AR amplification 別 OS、Kaplan-Meier survival curve + log-rank test で xenograft tumor growth。Fisher’s exact test で mutation co-occurrence 解析。R version 3.1 + GATK v3.3 を解析パイプラインに使用した。