- 著者: Swann JW, Fung JH, Chen Z, Olson OC, Collins A, Lhakhang T, Proven MA, Zhang R, Rabadan R, Passegué E
- Corresponding author: Raul Rabadan / Emmanuelle Passegué (Columbia University, New York)
- 雑誌: Cell Stem Cell
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-06-18
- Article種別: Resource Article (Original Article)
- DOI: 10.1016/j.stem.2026.05.007
背景
造血幹細胞および前駆細胞 (HSPC; hematopoietic stem and progenitor cell) は、感染・炎症・化学療法・再生ストレスに対して緊急骨髄造血 (EM; emergency myelopoiesis) と呼ばれる機構で骨髄系細胞産生を急速に増幅する (Olson et al. 2020, Cold Spring Harb Perspect Med; Swann et al. 2024, Nat Rev Immunol)。HSC (hematopoietic stem cell) では IL-1β や TNF-α が転写因子 (TF; transcription factor) PU.1 を早期活性化して骨髄系コミットメントを促進し (Pietras et al. 2016, Nat Cell Biol)、多能性前駆細胞 MPP (multipotent progenitor) のリンパ球系偏向サブセット MPP4 では IL-6 が myeloid fate へ再プログラムし (Reynaud et al. 2011, Cancer Cell)、GMP (granulocyte macrophage progenitor) は炎症・再生刺激で一時的な自己複製クラスターを形成して好中球産生を増幅する (Hérault et al. 2017, Nature)。これらの EM 経路は解消後に終結するが、老化・癌・慢性炎症では持続または異常活性化して治療標的となる。先行研究では Hoxb5-Cre (Hoxb5プロモーター駆動 Cre リコンビナーゼ) や Flt3 (FMS-like tyrosine kinase 3)/Tie2-Cre を用いた系統トレーシング実験から HSC は敗血症・炎症の EM engagement で必ずしも必須でないことが示唆されている (Fanti et al. 2023, Cell Stem Cell; Munz et al. 2023, Blood)。しかし、異なる EM 誘導因子が HSPC 階層の同一レベルに作用するのか、共通の分子モジュールを共有するのかは不明であった。単細胞 RNA シークエンス (scRNA-seq; single-cell RNA sequencing) 技術の進歩により大規模な単細胞解析が可能になっている一方で、マウス HSPC サブセットを高解像度かつ一貫して注釈付けする手法や、分化トポロジーを定量的に比較する統一フレームワークが欠如しており、このようなリソースの不足が骨髄微小環境の詳細な単細胞解析 (Tikhonova et al. Nature 2019) との統合も含め、複数の EM モデルにわたる体系的な比較解析を妨げていた。
目的
マウス HSPC の 9 つの EM 誘導条件にわたる scRNA-seq データを統合的に解析し、異なる EM inducers が HSPC 階層をどのように再構成するか、そして共通の分子モジュールが存在するかを解明するとともに、同定モジュールの臨床的意義を AML において検証すること。
結果
HemaScribeによる高解像度マウスHSPC自動注釈： scRNA-seq 解析における HSPC サブセット注釈の一貫性不足を解決するため、新規アノテーション法「HemaScribe」を開発した (Fig 1)。FACS ソートした 10 種の HSPC 集団 (HSC, ST-HSC (short-term HSC), MPP2, FcγR+ MPP3 (FR+ MPP3), FcγR- MPP3 (FR- MPP3), MPP4, CLP (common lymphoid progenitor), MkP (megakaryocyte progenitor), EryP (erythroid progenitor), GMP (granulocyte macrophage progenitor)) をオリゴ標識抗体でハッシュタグし、bulk RNA-seq 参照 (ImmGen/Haemopedia) を用いた broad classifier とラベル転移に基づく fine classifier を組み合わせた。GMP はさらに GP (granulocyte progenitor), cMoP (common monocyte progenitor), mGMP (multilineage GMP) に細分類した。標準的なラップトップ上で 20,000 細胞を 50 秒未満でアノテーション可能であり、Azimuth, CellTypist, scType の 3 種の既存手法と比較して ground truth (ハッシュタグラベル) との対応で有意に高い Precision・Recall を示した (n=biological replicates, one-way ANOVA with Tukey’s post hoc test; Fig 2C)。同一参照データで訓練した場合のみ scANVI (single-cell annotation using variational inference) が HemaScribe と同等の性能を示した。MPP2 と FR+ MPP3 は最も移行的な細胞型として最低の recall を示したが、これは silhouette score が最低（転写・フローサイトメトリー空間ともに最も重複）という生物学的特性と一致する (Fig S2A)。既存の公開データセット (Lin- BM 細胞、LK/LSK データ、Tabula Muris) への適用により、以前のアノテーション誤りを是正できることを示した（例: 「macrophage」クラスターが plasmacytoid dendritic cell 特性遺伝子を発現していた誤注釈の検出）。
HemaScapeによる造血分化トポロジーの定量化： HSPC の分化過程を定量的に可視化する「HemaScape」ツリーモデルを構築した (Fig 3)。参照オリゴハッシュ scRNA-seq データに対して elastic embedding (EE) で次元圧縮後、DensityPath で高細胞密度クラスターを安定細胞状態として同定し、minimum spanning tree で分化経路を推定、PAGA (partition-based graph abstraction) で連結性を評価して統合した分化ツリーを構築した。HoxB5-Cre:R26LSL-tdT マウスを用いた蛍光標識伝播時系列実験（label propagation tree）との比較において、HemaScape は Monocle3 および Slingshot よりも forbidden cell fate rate が有意に低く (one-way ANOVA with Tukey’s post hoc, n=independent scRNA-seq LK replicates, mean ± SD; Fig 3F)、CytoTRACE2 スコアとの逆相関も Monocle3 より有意に強かった (Fig 3G)。また CITE-seq データの HemaScape へのマッピングにより、CD24 が nodes 1+2 (HSC/ST-HSC 付近) と EryP を、CD62L が node 9 を富化する新規表面マーカーを同定し、FACS 分離と 10× scRNA-seq により検証した (Fig S6C-D)。SCENIC (single-cell regulatory network inference and clustering) 解析により、HemaScape の主要分岐点から GATA1 (赤血球)、C/EBPα (骨髄系)、ETS1/TCF4 (リンパ系) の既知コミットメント決定因子を正確に再現した。
異なるEM誘導因子はHSPC階層の異なる層に作用する： 9 つの EM 誘導条件 (短期 7 日/慢性 20 日 IL-1, G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor; 2-4 日), 5-fluorouracil (5FU) 8 日後, LPS (lipopolysaccharide) 16h, pIC (polyinosinic:polycytidylic acid) 2-4 日, EPO (erythropoietin) 2 日, 胎児 E18.5, 加齢 24 か月) の LK scRNA-seq データセットを HemaScribe でアノテーションし、scDC (single-cell differential composition) 解析で細胞頻度変化を評価した (Fig 4A)。5FU は HSC/MPP を広範に拡大させ線系コミット前駆細胞を減少させた。pIC と LPS は MPP に対してより微細な変化をもたらし、pIC は mGMP 頻度も増加させた (Fig 4B)。G-CSF と IL-1 は HSC/MPP 頻度にほとんど影響を与えずに GMP を劇的に拡大し EryP を減少させた (Fig 4C)。Waddington-OT による最適輸送解析において、pIC は initial HSC/MPP が骨髄系拡大に直接寄与するのに対し、G-CSF はこの primitive compartment にほぼ影響を与えないことが示された (Fig 4D)。pIC の効果として PAGA 解析で HSC-MkP 間の連結性増加が認められ (Fig 4E, S9C-D)、HSC-MkP バイパスの type I IFN 依存性と一致した。MPP4 の分析では pIC, LPS, IL-1 が MPP4/CLP から mGMP/cMoP へのリンクを増強し G-CSF がこのリンクを抑制することが判明した (Fig 4F)。機能的検証として MPP4 移植実験 (sublethally irradiated congenic recipients, n=5 mice per group, mean ± SD, multiple t tests; Fig 4G) において、pIC のみが移植 MPP4 の末梢血 myeloid 産生 (Gr1+/CD11b+ 細胞) を延長した。epigenetic poising の観点からは、committed myeloid progenitor nodes (G-J) がランダムサンプルと比較して G-CSF 応答遺伝子の resting chromatin accessibility が高く、MPP node E と MkP node K が pIC signature 富化を示したことから (Fig S9A-B)、myeloid progenitors は G-CSF に対して epigenetically poised であり、MPP は pIC に対して poised 状態にあることが示された。
NMFによる共通・固有の分子モジュールの同定： 9 条件 25 scRNA-seq サンプルを CCA (canonical correlation analysis) で統合後、NMF (non-negative matrix factorization) を k=40 で実施した (cross-validation および cNMF (consensus NMF) による安定性確認、cNMF の平均 Spearman rho=0.69 for best-matching factors; Fig 5A, S12B)。perturbation で変動する 4 因子を詳細解析した。M18 は HSC/ST-HSC 特異的で急性 IL-1 + LPS + pIC と関連し、脊椎動物間で最も高い配列保存性を持ち、TCF12 と RUNX1 TF regulons と相関した（早期 HSPC の急性活性化モジュール; Fig 5C-D)。M12 は HSC/ST-HSC で慢性 IL-1 + 5FU で活性化し、JUN/FOS family と AP-1 TF regulons が最高相関を示した (Fig 5E)。M40 は HSC/ST-HSC で LPS + pIC に強く関連し、Ly6a (Sca-1) や Irf7 など IFN 誘導遺伝子を top loading genes とし、STAT1, STAT2, IRF7 TF regulons と相関した (type I IFN 応答モジュール; Fig 5F)。M24 は GMP を中心とした myeloid progenitors で活性化し、5FU・G-CSF・pIC・LPS の複数 EM 誘導因子により誘導される共通モジュールであり、Ldha (lactate dehydrogenase A), Cox7b などの代謝遺伝子と Ifitm1, Ifitm3 などの IFN 誘導膜貫通タンパク質を top loading genes として含む (Fig 5H)。M24 は独立した G-CSF・pIC・慢性 IL-1 処理データセットで骨髄系コミット前駆細胞での強い誘導が確認された（外部検証; Fig S13)。
M24/YBX1軸の機能解析とAML予後予測： M24 は 5FU 暴露後 day 8 (HSPC 最大活性化時点) に myeloid-biased MPP3 と GMP の両方で最も増加した因子の 1 つであることを確認し (SMART-seq データでも再現; Fig 6A-B)、公開 GMP bulk RNA-seq (murine 心筋梗塞, DSS 誘発性炎症性大腸炎, 炎症性脊椎関節炎, LPS 誘発敗血症) の 4 モデル全てで M24 top 100 loading genes の有意な富化が認められた (permutation testing; Fig 6C)。M24 の putative upstream regulator として YBX1 (Y-box binding protein 1) を同定した。MDA-231 乳癌細胞の公開 CLIP-seq (cross-linking immunoprecipitation) データ再解析では、YBX1 が M24 モジュールの多数の遺伝子 mRNA に結合し、M24 top loading genes の有意な過剰表現が認められた (Fisher’s exact test, odds ratio=5.9, p=1.35×10^-15; Fig S14D)。YBX1 タンパク質レベルは day 8 5FU 処理 MPP3 で有意に上昇したが IL-1 処理 MPP3 では変化なかった (intracellular flow cytometry, one-way ANOVA with Tukey’s post hoc; Fig 6G)。機能的検証として ex vivo GMP 液体培養実験 (n=4 biological replicates per group, mean ± SD, two-way ANOVA with Sidak’s post hoc test; Fig 6H-K) では、5FU 処理 GMP がコントロール GMP より有意に速く増殖し、YBX1 inhibitor SU056 (YBX1i) がこの過剰増殖をコントロールレベルに回復させた。YBX1i はコントロールや IL-1 処理 GMP に有意な影響を与えず、PU.1 inhibitor DB2313 (PU.1i) は 5FU 処理 GMP の過剰増殖を抑制しなかった（特異性の確認)。機構的には YBX1 阻害は 5FU 暴露 GMP に対して選択的な細胞死 (caspase 3/7 luminescent assay で apoptosis 増加) を誘発し、増殖率には影響しなかった (EdU incorporation after 1h; Fig 6L)。ヒト検証として、G-CSF 暴露およびLPS/Pam3CSK4 (Pam3CSK4, TLR1/2 アゴニスト) 処理のヒト BM scRNA-seq NMF (30 因子) から human factor H2 を同定し、M24 との間で最強の cross-species 相関を示し (M24-H2 correlation 最高; Fig S14F)、YBX1 が H2 の最大 predicted regulator であった。さらに mSig24 は MLL-AF9 融合タンパク質によって GMP から形質転換した AML マウスモデルで有意に富化され、HSC/MPP 由来の Tet2^f/f:Vav1-iCre^+/-:Flt3^ITD/+ モデルでは富化されなかった (Fig 7D)。TCGA-LAML と Beat AML コホートにおいて hSig24 スコアは cell-of-origin 分類の “primitive”, “intermediate”, “GMP” サブタイプで “mature” サブタイプより有意に高値を示した (one-way ANOVA with Tukey’s post hoc; Fig 7E)。TP53 WT 患者の解析では hSig24 最高 20% が最低 20% と比較して TCGA-LAML と Beat AML 両コホートで有意に不良な全生存期間 (OS) を示し (log rank test; Fig 7F)、多変量 Cox 回帰 (年齢・性別・前治療歴・既往悪性腫瘍を共変量) でも hSig24 は独立した予後不良因子として残存した。ELN2022 リスクスコアへの hSig24 追加により model fit が有意に改善したが、APS、LSC17、Stem11 などの既存遺伝子スコアでは改善しなかった (ANOVA test for Cox model fits; Fig 7H)。さらに hSig24 は小児 TARGET-AML コホートでも予後予測能を持ち、リンパ系悪性腫瘍や大多数の固形腫瘍では有用でなく AML への高い特異性を示した。
考察/結論
本研究は、HSPC の緊急骨髄造血を網羅的に解析するための 2 つの新規ツール（HemaScribe・HemaScape）を開発し、9 条件にわたる EM の定量的分子地図を構築した点に最大の新規性がある。Hérault et al. (2017, Nature) が示した GMP クラスターによる好中球増幅や Pietras et al. (2016, Nat Cell Biol) による HSC での PU.1 活性化など、先行研究が各 EM 誘導因子の効果を個別に検討してきたのと対照的に、本研究は初めて複数条件を統一的な細胞・分子解析基盤で比較し、共通モジュールの同定と臨床応用まで展開した。
主要な知見として、LPS や pIC などの病原体由来産物が造血コンパートメント全域 (HSC/MPP を含む) にわたる広範な変化をもたらすのに対し、再生サイトカイン G-CSF は myeloid-restricted progenitors への集中した作用を示すことがこれまで報告されていない分子解像度で明示された。この差異は、myeloid progenitor nodes が G-CSF 応答遺伝子に対して epigenetically poised であり、MPP nodes が pIC 応答に poised であるという chromatin accessibility の非対称性によって説明され、表面受容体発現パターンだけでは説明できない内在的な差異の存在を示した。G-CSF が主に恒常的な骨髄系細胞産生に関与するという従来の理解とは異なり、pIC が HSC-MkP バイパスを含む造血階層全体の再構成を誘導するメカニズムが初めて系統的に解明された。
NMF 解析で同定された M24（骨髄系活性化モジュール）は、機構の異なる複数条件で骨髄系前駆細胞に共通して誘導されることから、造血系が多様な刺激に対してゲノムにコード化された有限のモジュールセットで応答するという概念を支持し、疾患を横断する共通制御標的の存在を示した。YBX1 はこの共通モジュールの候補制御因子として、mRNA 安定化を通じて EM 活性化 GMP の増殖を促進する。RNA 結合タンパク質が免疫制御に果たす多彩な役割は Turner et al. NatRevImmunol 2026 に詳述されており、YBX1 は AML 細胞株において既知の依存性タンパク質であり (Perner et al. 2022, Leukemia)、小分子阻害薬 SU056 も初期評価されているが、本研究では YBX1 が生理的骨髄系細胞拡大においても機能することを初めて示した。
臨床的意義として、hSig24 は TP53 野生型 AML 患者における独立した予後不良因子であり、既存の ELN2022 リスクスコアを超える予後情報を提供する。細胞起源分類との整合性（GMP 由来 MLL-AF9 モデルへの選択的富化）は、M24 がアクティブな骨髄系増殖プログラムとして AML 細胞に流用されることを示唆する。HSC がストレスを記憶して造血の質的変化をもたらすことを示した Zeng et al. Nature 2026 の知見とも相補的に、本研究は骨髄系前駆細胞レベルでの EM モジュールが慢性炎症・白血病発症に共通して流用される機構を提示する。今後の方向性として、YBX1 を標的とした EM-activated myeloid progenitor の選択的制御戦略の開発、細胞起源分類と hSig24 の統合的 AML リスク評価系の確立、さらに epigenetic 修飾や他の制御層との統合による EM 誘導因子ごとの直接・間接効果の解明が今後の課題として残されている。本研究の limitation として、pIC と G-CSF の比較は調和した時系列で実施されたが他の条件は異なるタイミングで適用されており直接比較には制約があり、転写解析のみでは直接・間接効果を分離する力が限られる。
方法
9 種の EM モデル (短期/慢性 IL-1, G-CSF, 5FU, LPS, pIC, EPO, 胎児 E18.5, 加齢 24 か月マウス) の BM Lin-/c-Kit+ (LK) および Lin-/Sca-1+/c-Kit+ (LSK) scRNA-seq データセット (10× Chromium, 合計 25 サンプル) を統合解析した。HemaScribe は bulk RNA-seq 参照 (ImmGen, Haemopedia, neutrophil progenitor databases) の broad classifier と、FACS ソート 10 HSPC サブセット (hashtag labeled, pooled for 10× scRNA-seq) のラベル転移に基づく fine classifier で構成し、R パッケージとして公開した (github.com/RabadanLab/HemaScribe)。HemaScape は EE (elastic embedding) による次元圧縮、DensityPath による密度クラスター同定、minimum spanning tree、PAGA connectivity を組み合わせた分化ツリーとして実装した。TF regulon は SCENIC、epigenetic poising は combined LK/LSK multiome (ATAC+RNA-seq) 公開データ、分化傾向は Waddington-OT (scRNA-seq time course)、転写応答強度は Augur で評価した。分子モジュールは CCA 統合後の NMF (k=40, cross-validation, cNMF 安定性確認) で解析し、in silico knockout は CellOracle を使用した。機能実験: HSC/MPP4 移植 (lethally/sublethally irradiated congenic recipients, n=5/group)、ex vivo GMP 液体培養 (±YBX1i SU056 / PU.1i DB2313, n=4 biological replicates/group、Gr1+/CD11b+ ドナー由来骨髄系細胞を末梢血でフォロー)。YBX1 発現は intracellular flow cytometry、増殖は EdU incorporation (1h)、apoptosis は caspase 3/7 luminescent assay。ヒト EM は G-CSF 暴露またはLPS/Pam3CSK4 ex vivo 処理のヒト BM scRNA-seq 公開データを human reference embedding にマッピング後 NMF (30 因子) で解析。AML 予後解析は TCGA-LAML、Beat AML、小児 TARGET-AML コホートにおける hSig24 スコアの Kaplan-Meier (log rank test)、univariable/multivariable Cox regression、ELN2022 との尤度比比較 (ANOVA test for Cox model fits) で評価した。scRNA-seq データは GEO: GSE296404, GSE298048 に寄託。