- 著者: Yang Chen, Li Wang, Shi Luo, Jun Hu, Xing Huang, Pei-Wen Li, Yi Zhang, Chao Wu, Bo-Le Tian
- Corresponding author: Bo-Le Tian (Department of Pancreatic Surgery, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu; tianbolemed@163.com)
- 雑誌: Drug Design, Development and Therapy
- 発行年: 2020
- Epub日: 2020-07-23
- Article種別: Original Article
- DOI: 10.2147/DDDT.S261017
背景
膵臓癌はがん関連死の第 4 位と推定される致死的な消化器系悪性腫瘍で、その主要病理型である膵管腺癌 (PDAC; pancreatic duct adenocarcinoma) は全症例の 90% 以上を占め、潜行性の発症・高度な浸潤性・早期遠隔転移を特徴とする。診断時に外科的切除基準を満たす患者は 1/5 未満で、切除後も多くが 1 年以内に局所進行・遠隔転移で再発し、5 年生存率は 6–9% と極めて低い。予後不良の一因は、腫瘍細胞とともに発達する緻密な線維炎症性間質 (stroma) が化学療法薬の浸透を阻む物理的バリアとして働くことにある。先行研究では、間質を標的または阻害する製剤や高浸透能を持つ製剤が生存を改善することが報告され、Olive et al. 2009 は Hedgehog 阻害で膵癌マウスモデルへの化学療法送達を高め、Frese et al. 2012 は nab-paclitaxel (nab-PTX) が cytidine deaminase を低下させて gemcitabine 活性を増強することを示した。nab-PTX は PDAC 間質の albumin 結合蛋白を標的に高い腫瘍内薬物濃度を達成し gemcitabine との併用で有意な抗腫瘍効果を示す。著者らの先行研究では、膵親和性を持つ脳灌流イメージング剤 HIPDM (N,N,N’-trimethyl-N’-(2-hydroxy-3-methyl-5-iodobenzyl)-1,3-propanediamine) 由来の三級アミン propanediamine 残基が膵集積を高めることを示し (Li et al. 2015, Luo et al. 2017)、N,N-ジメチル-1,3-propanediamine 修飾 PEG (polyethylene glycol) 化リポソーム (Lip2N) が膵標的能を持つことを予備的に確認した (Li et al. 2019)。しかしこのナノ粒子送達系の PDAC 腫瘍組織への浸透能と腫瘍内薬物濃度は不明のままであった。既存研究では、間質バリアを効率的に貫通しつつ膵特異的に集積する PTX 送達系の in vivo 腫瘍浸透性と抗腫瘍効果の直接検証が不足していた。本研究はこの gap を、患者由来同所異種移植 (PDOX) モデルで埋める。
目的
本研究は、膵親和性を持つ N,N-ジメチル三級アミン残基 (DSPE-PEG2000-2N) で修飾した paclitaxel (PTX) 内封 PEG 化リポソーム (PTX-Lip2N) を作製し、患者由来同所異種移植 (PDOX; patient-derived orthotopic xenograft) ヌードマウス PDAC モデルにおける in vivo 分布 (膵標的集積・腫瘍浸透) と抗腫瘍効果を、未修飾 PTX-Lip および臨床標準の nab-PTX と比較評価することを目的とする。これにより、三級アミン修飾が PDAC 間質バリアを克服して PTX の治療効果を高めうるかを検証する。
結果
リポソームの物性と高い封入効率：PTX-Lip および PTX-Lip2N はいずれも球状の脂質二重膜構造を示し (TEM、Fig 1B,C)、粒径は約 150 nm であった。物性測定は各製剤で n=3 試料の反復とした。表面電位はそれぞれ -13.8±1.3 mV と -10.1±1.7 mV で、PTX 導入により空リポソーム (126.3±9.5 nm / 129.2±7.4 nm) より有意に大径化した (p<0.05、Table 1)。多分散指数 (PDI) はいずれも 0.2 未満で単分散系を示した。PTX 封入率 (EE) は両製剤とも 92% を超え (PTX-Lip 92.2±2.5%、PTX-Lip2N 93.5±3.9%)、薬物担持率 (DL) はそれぞれ 2.56% と 2.61% であった。これらのパラメータはいずれも endocytosis 過程に適した設計であることを示し、三級アミン修飾が物性を損なわず高封入を維持することを裏づける。
三級アミン修飾による細胞取り込みと細胞傷害性の増強：BxPC-3 ヒト膵腺癌細胞での DiD 蛍光プローブによる取り込み定量 (flow cytometry、n=3) で、DiD-Lip と DiD-Lip2N の取り込みは free DiD のそれぞれ 4.07 倍 (p<0.05) と 7.12 倍 (p<0.01) であり、リポソーム化が PTX の細胞内送達効率を高めた (Fig 2D)。共焦点顕微鏡でも DiD-Lip2N 群の細胞質に他群より強い赤色蛍光が観察され、定量結果と一致した (Fig 2A-C)。DiD-Lip2N は DiD-Lip より高い取り込みを示したが有意差はなかった (P=0.069)。MTT assay による細胞傷害性評価 (n=6 ウェル) では、free PTX・PTX-Lip・PTX-Lip2N・nab-PTX の半数阻害濃度 (IC50) はそれぞれ >50 nM・33.40 nM・20.36 nM・29.53 nM で、三級アミン修飾した PTX-Lip2N が最も強い抗増殖効果を示した (Fig 3)。3 つの PTX 製剤はいずれも free PTX より有意に細胞生存率を低下させ (p<0.05)、PTX-Lip2N は未修飾 PTX-Lip より有意に強く (p<0.05)、nab-PTX よりわずかに優れた (有意差なし)。
膵標的集積と PDAC 腫瘍組織への浸透：正常マウスでの IVIS 蛍光イメージング (2, 6, 24 h) で、DiD-Lip2N は 3 時点すべてで DiD-Lip より有意に高い膵集積を示した (Fig 4)。PDOX/皮下異種移植モデルの腫瘍分布解析では、同所腫瘍において DiD-Lip2N の蛍光強度が DiD-Lip より有意に高かった (p<0.05、Fig 5、n=3) 一方、皮下モデルでは両群に有意差がなく、三級アミン修飾 Lip2N が膵特異的集積に加え PDAC 腫瘍組織への効率的な浸透能を持つことが示された。PDOX モデルは micro-PET/CT で高 18F-FDG 集積域として確認され、標準取り込み値 (SUV) の tumor-to-muscle 比・tumor-to-blood 比はそれぞれ 1.87±0.53 と 1.19±0.32 であった (Fig 6)。
PDOX モデルにおける in vivo 抗腫瘍効果 (nab-PTX を上回る)：PDOX ヌードマウスを NS 対照・PTX・PTX-Lip・PTX-Lip2N・nab-PTX の 5 群に無作為化し、5 mg/kg PTX を週 2 回 4 週間 i.v. 投与した。腫瘍体積は PTX (0.221±0.036 cm³) と PTX-Lip (0.184±0.036 cm³) がともに対照群 (0.331±0.043 cm³、p<0.01) より有意に小さく、修飾 PTX-Lip2N (0.129±0.022 cm³) は PTX-Lip より有意に強く腫瘍増殖を抑制し (p<0.05)、nab-PTX (0.157±0.023 cm³、p=0.08) よりも数値的に優れた (有意差なし、Fig 7)。免疫組織化学の Ki-67 増殖指数では、4 介入群すべてが対照群 (78.3±8.75%) より有意に低く、PTX-Lip2N (24.2±6.65%) は PTX (56.7±8.16%、p<0.001) と PTX-Lip (43.3±9.31%、p<0.05) より効果的で、nab-PTX 群 (31.7±10.8%、p=0.178) よりも低い陽性率を示した (Fig 8)。H&E 染色では PTX-Lip2N 群で腫瘍細胞の壊死・apoptosis と炎症細胞浸潤が他群より顕著であった。
考察/結論
本研究は、膵親和性を持つ N,N-ジメチル三級アミン修飾により、PTX 内封 PEG 化リポソーム PTX-Lip2N が PDAC 間質バリアを克服して膵・腫瘍組織へ効率的に集積し、in vivo で優れた抗腫瘍効果を発揮することを示した。先行研究との違いとして、albumin 結合を介して間質を標的とする臨床標準の nab-PTX と異なり、本製剤は膵の酸性微小環境と血漿の pH 勾配を利用した三級アミンの膵上皮バリア (blood-pancreas barrier, BPB) 通過という別機構で膵標的化を達成する点が対照的であり、これまで膵標的リポソームの腫瘍浸透能が直接検証されていなかった点で従来研究と異なる。新規性として、本研究で初めて DSPE-PEG2000-2N 修飾リポソームを PDOX モデルという臨床再現性の高い系で評価し、その腫瘍浸透能と抗腫瘍効果が nab-PTX を数値的に上回ることを実証した点が挙げられる。PDOX モデルは原発腫瘍の分子微小環境と形態を再現し PDAC の化学療法効果評価に有用で、患者由来オルガノイドが消化器癌の治療応答を再現するという知見とも整合する。臨床応用の観点では、この膵標的化プラットフォームは異なる化学療法薬を封入して膵癌治療の抗腫瘍効果を高める橋渡し (bench-to-bedside) の基盤となりうる。PTX は Cremophor-EL 基剤による重篤な過敏反応が問題であり、リポソーム化は毒性軽減と治療効果向上の両面で臨床的意義を持つ。既存の nab-PTX 製剤 (Socinski et al. JClinOncol 2012) や nab-PTX の組織別安全性 (Socinski et al. AnnOncol 2013) の知見は、本製剤を既存標準と比較する臨床文脈を与える。PDAC の緻密間質を克服する送達戦略は、間質標的化と併せて治療応答を高めうる (Langer et al. JClinOncol 2012)。残された課題としては、① PTX-Lip2N と nab-PTX の差が有意水準に達しなかったこと (p=0.08) からより大規模な検証が必要であること、② gemcitabine 等との併用効果の評価、③ 三級アミン修飾の膵標的機構 (pH 勾配依存性) の定量的解明、④ 薬物動態・全身毒性・免疫微小環境への影響の検討、が今後の検討として求められる。これらを通じ、膵標的リポソームが難治性膵癌の治療成績を改善しうるかの臨床的意義がさらに検証されるべきである。
方法
PTX 内封 PEG 化リポソームは film dispersion-ultrasonic 法で作製した。LipoidS100・cholesterol・mDSPE-PEG2000 (methoxy-PEG 化 DSPE = 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)・膵標的リガンド DSPE-PEG2000-2N (N,N-ジメチル propanediamine 修飾体)・PTX をクロロホルム溶液で調製し、体積比 1:1:0.8:0.5:1 で混合、rotary evaporator で 37°C・薄膜形成後、PBS で水和し ultrasonic cell crasher で 8 分間・100 W 超音波処理して修飾リポソーム PTX-Lip2N を得た。未修飾 PTX-Lip は DSPE-PEG2000-2N を除き体積比 1:1:1:1 で同法により作製した。形態は透過型電子顕微鏡 (TEM, Hitachi H-600)、粒径・多分散指数 (PDI) は動的光散乱 (Malvern Zetasizer NanoZS90) で測定した。封入率 (EE) と薬物担持率 (DL) は membrane filter 法で算出した。細胞取り込みは BxPC-3 ヒト膵腺癌細胞株 (ATCC 由来、RPMI-1640 + 10% FBS で培養) に DiD 蛍光プローブを用い、共焦点レーザー顕微鏡 (Nikon A1RMP) と flow cytometry (BD FACSVerse) で評価した。細胞傷害性は MTT assay (96-well、1×10^4 cells/well、48 h 処理) で IC50 を算出した。PDOX モデルは West China Hospital で膵切除患者から得た PDAC 腫瘍を NOD/SCID マウス (第 1 世代) 経由で athymic BALB/c-nu/nu ヌードマウス (4-6 週齢、雄) の膵尾部に同所移植して樹立し (Institutional Animal Care and Ethics Committee 承認 no. 2019198A)、micro-PET/CT で 18F-FDG (120±10 μCi) を用いて確立を確認した。in vivo 分布は DiD 標識リポソームを尾静脈注入 (200 μg/kg) し IVIS で臓器・腫瘍蛍光を測定した。抗腫瘍実験は腫瘍が 100 mm³ に達した時点で 5 群 (NS/PTX/PTX-Lip/PTX-Lip2N/nab-PTX、5 mg/kg、週 2 回、4 週) に無作為化し、腫瘍体積 (= 0.5 × 長径 × 短径^2) と H&E・Ki-67 免疫組織化学 (5 ランダム 20× 視野の陽性率) を評価した。統計は GraphPad Prism 8.0 で mean ± SD、Student t 検定または one-way ANOVA + Tukey 検定を用い p<0.05 を有意とした。