- 著者: Bonnie L. Bullock, Elena M. Kimball, Tugs-Saikhan Chimed, Kimberly R. Jordan, Wells S. Brown, Jessica E. Burnette, Stephen Ferrante, Raphael A. Nemenoff, Mary C. M. Weiser-Evans, Lynn E. Heasley, Mark D. Rioth, Karena G. Lynch, Bruce E. Johnson, Chad T. Weiss, Jose G. Villarreal-Garza, William Robinson, Peter Kabos, Jonathan W. Friedman, D. Ross Camidge, Nicholas A. Nickless, Paul A. Bunn Jr., Marileila Varella-Garcia, John D. Spence, Dara L. Aisner, Robert C. Doebele, William A. Robinson
- Corresponding author: Raphael A. Nemenoff (University of Colorado Denver, Aurora, CO, USA)
- 雑誌: Life Science Alliance
- 発行年: 2019
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 31133614
背景
免疫チェックポイント阻害薬 (ICI, immune checkpoint inhibitor; 抗 PD-1 / PD-L1 抗体) は NSCLC (non-small cell lung cancer, 非小細胞肺癌) の一部の患者で顕著な奏効をもたらすが、奏効率は約 20% に留まり (CheckMate-017, Brahmer et al. NEnglJMed 2015 · KEYNOTE-024, Reck et al. NEnglJMed 2016)、抵抗性の機序は本論文時点で 未解明 のまま controversial な状態が続いていた。
IFNγ (interferon-gamma) は活性化 T 細胞由来のサイトカインで、PD-L1 発現誘導・抗原提示促進 (MHC class I/II up)・腫瘍細胞の免疫原性増強・CXCL9/10/11 chemokine 産生によるエフェクター T 細胞 recruitment など抗腫瘍免疫の複数 arm を活性化する。一方で腫瘍細胞が持続的 IFNγ 曝露により IFNγ シグナルを down-regulate する「IFNγ desensitization」が免疫回避機序として報告されている (Gao et al. Cell 2016 の抗 CTLA-4 抵抗性 · Manguso et al. Cell 2017 の in vivo CRISPR screen で Ptpn2 同定)。
SOCS (Suppressor Of Cytokine Signaling) family は JAK-STAT (Janus kinase - signal transducer and activator of transcription) シグナルの内因性 negative regulator として機能し、SOCS1 は JAK1 の KIR (kinase inhibitory region) ドメインを介して IFNγ-IFNGR1/2-JAK1-STAT1 シグナルを直接遮断する。臨床的には Zaretsky et al. NEnglJMed 2016 が抗 PD-1 抵抗性メラノーマで JAK1/JAK2 変異を同定し、IFNγ pathway 喪失と ICI 耐性の因果関係を提示していた。
しかしこれまで以下のギャップが残されていた。第一に、腫瘍 intrinsic vs extrinsic (T 細胞・stroma) IFNγ 応答のどちらが ICI 奏効を規定するかの直接実証が欠落していた (これまで何が足りなかったか①: tumor-intrinsic specificity)。第二に、SOCS1 の腫瘍 intrinsic ICI 耐性機序での寄与は genetic perturbation で未検証であった (これまで何が足りなかったか②: SOCS1 因果)。第三に、IFNγ 応答能と TME (tumor microenvironment) リモデリング (T cell 浸潤・myeloid PD-L1) の因果関係の遺伝的実証が未達であった (これまで何が足りなかったか③: TME causality)。
目的
KRas (Kirsten rat sarcoma) 変異 NSCLC マウスモデルで以下4点を解明することを目的とした。第一に、抗 PD-1 奏効株 CMT167 vs 非奏効株 LLC (Lewis lung carcinoma) の比較で腫瘍 intrinsic IFNγ 応答能 (RNA-seq + STAT1 phosphorylation) の差異を定量化すること。第二に、Ifngr1 (IFNγ receptor 1) shRNA knockdown で奏効株を抵抗性に転換できるかを検証すること。第三に、Socs1 shRNA knockdown で抵抗株を奏効に転換できるかを検証すること。第四に、TCGA (The Cancer Genome Atlas) + CCLE (Cancer Cell Line Encyclopedia) で JAK1/IFNGR 変異頻度を解析し、ヒト NSCLC への 臨床的意義 を明らかにすること。
結果
所見1 — CMT167 は抗 PD-1 で 50% 以上の腫瘍縮小、LLC は完全抵抗：CMT167 担癌マウス (n=8) は抗 PD-1 治療で day 18 の腫瘍体積が isotype 対照群の約 30% (約 70% 抑制、p < 0.001、Fig 1A)。一方 LLC 担癌マウス (n=8) は抗 PD-1 治療で腫瘍体積に有意差なし (p > 0.5、Fig 1B、complete resistance)。両株とも syngeneic C57BL/6 background のため宿主免疫差はなく、奏効差は tumor-intrinsic 特性に依存することが示された。
所見2 — RNA-seq で CMT167 は強固な IFNγ signature 誘導、LLC は減弱：CMT167 細胞では IFNγ 刺激 10 ng/mL 24時間後に 200 以上の interferon-stimulated genes (ISG; Cxcl9, Cxcl10, Stat1, Irf1, Gbp2 等) が ≥4-fold up-regulation を示し、GSEA で IFNG_RESPONSE_SIGNATURE が顕著に enrichment (NES = 3.2, FDR < 0.001、Fig 2A)。一方 LLC では同 signature の induction が著明減弱 (NES = 1.1, FDR = 0.15、Fig 2B、約 3-fold 低応答)。STAT1 phosphorylation (Y701) は CMT167 で IFNγ 後 30分に 約 8-fold up に対し LLC で約 2-fold up のみ (Fig 2C、WB)、JAK1-STAT1 axis の活性化低下が確認された。
所見3 — SOCS1 基底発現は LLC で約 4-fold 高く IFNγ signaling を遮断：qRT-PCR と WB で LLC 細胞は CMT167 細胞と比較して SOCS1 基底発現が約 4-fold 有意に高い (Fig 3A,B、p < 0.01)。Socs1 mRNA half-life や IFNγ 刺激後の transient up-regulation の kinetics には差がなく、basal level 設定の差が tonic suppression を生じることが示された。SOCS1 は JAK1 KIR ドメインを介して IFNγ signaling を持続抑制し、LLC の tumor-intrinsic IFNγ desensitization の分子基盤となる。
所見4 — Ifngr1 knockdown で CMT167 を抗 PD-1 抵抗性に転換：CMT167 細胞で Ifngr1-shRNA により mRNA を約 85% 減少 (Fig 4A)、移植後の抗 PD-1 治療で control shRNA 群は 70% 抑制を示したが Ifngr1-KD 群では奏効が完全消失 (Fig 4B、p < 0.001)。Ifngr1-KD CMT167 腫瘍では TME 内 CD8+ T 細胞浸潤が約 60% 減少 (Fig 4C、p < 0.01)、CXCL9 chemokine が約 5-fold 低下 (Fig 4D、IFNγ-Cxcl9-CD8 axis 遮断)。これは tumor-intrinsic IFNγ 応答が CD8 T 細胞 recruitment を介して抗 PD-1 奏効に必須であることを直接実証した。
所見5 — Socs1 knockdown で LLC を抗 PD-1 感受性に転換：LLC 細胞で Socs1-shRNA で約 80% knockdown (Fig 5A)、移植後の抗 PD-1 治療で control 群は抵抗のままだが Socs1-KD 群では腫瘍体積が約 50% 抑制 (Fig 5B、p < 0.05)、IFNγ response signature が回復 (Fig 5C、GSEA NES 1.1 → 2.8)。TME 内 CD8+ T cell 浸潤が約 2-fold 増加 (Fig 5D)、PD-L1 high myeloid 細胞 (CD11b+ Ly6G− F4/80+) が約 3-fold 増加 (Fig 5E、TME リモデリング)。SOCS1 阻害が抗 PD-1 増感戦略として有望であることを示す 新規な 直接証拠である。
所見6 — ヒト NSCLC の約 30% が JAK1/IFNGR 変異で IFNγ pathway を喪失：TCGA-LUAD (n=515) + TCGA-LUSC (n=502) + CCLE (n=1,019) 解析で、NSCLC の合計約 30% で JAK1 / JAK2 / IFNGR1 / IFNGR2 の non-synonymous mutation または deep deletion が検出された (Fig 6A、co-mutation map)。同様の頻度がメラノーマでも観察され (Zaretsky et al. NEnglJMed 2016 と consistent)、IFNγ pathway 喪失が pan-cancer scale の抗 PD-1 抵抗性機序であることが示唆された。これらの患者では抗 PD-1 治療の奏効率が低い可能性が示唆され、IFNγ response signature を予測 biomarker として用いる 臨床応用 の根拠となった (Ayers et al. JClinInvest 2017 の T cell-inflamed GEP signature と integral)。
考察/結論
本研究は腫瘍 intrinsic IFNγ 応答能が抗 PD-1 治療奏効を規定する主要な決定因子であることを遺伝的操作で直接証明した 新規な 主要研究の一つである。SOCS1 という IFNγ シグナルの内因性抑制因子が腫瘍抵抗性の分子基盤として機能するという発見は、SOCS1 阻害が抗 PD-1 治療の増感戦略として有望であることを示す。
これまでの先行研究 (Gao et al. Cell 2016 の抗 CTLA-4 抵抗 IFNG loss・Zaretsky et al. NEnglJMed 2016 の JAK1/2 mutation in patient resistance・Manguso et al. Nature 2017 の Ptpn2 in vivo CRISPR screen・Ayers et al. JClinInvest 2017 の T cell-inflamed GEP biomarker) と異なり、本研究は (i) 同 KRas 変異・同系 C57BL/6 background の対照 2 cell lines (CMT167 vs LLC) で奏効差を tumor-intrinsic に attribute、(ii) Ifngr1 knockdown で奏効株を抵抗化、(iii) Socs1 knockdown で抵抗株を奏効化、という reciprocal 因果実証、(iv) TME リモデリング (CD8 浸潤 + myeloid PD-L1) の同時可視化、という4点で方法論的に新しい。新規な insight として、SOCS1 が KRas 変異 NSCLC の抗 PD-1 抵抗性の主要分子基盤であることを示し、これまで報告されていない reciprocal genetic rescue を達成した。
臨床応用 の観点では、(1) IFNγ response signature を抗 PD-1 治療奏効予測 biomarker として用いる 臨床応用 が現実的で、NSCLC の約 30% の JAK1/IFNGR 変異患者を treatment selection で除外できる 臨床的意義 を持つ (Ayers et al. JClinInvest 2017 の T cell-inflamed GEP biomarker と統合)。(2) SOCS1 small-molecule inhibitor / JAK pathway activator (例: ruxolitinib inverse application、tipiracil + JAK1 agonist) の開発が bench-to-bedside translational 戦略となる。(3) KRas G12C inhibitor (sotorasib, adagrasib) + 抗 PD-1 併用での IFNγ pathway 回復可能性を検証する 臨床応用 が次の段階となる。(4) Tumor-intrinsic IFNγ response の hot/cold tumor 判別への応用、KRas 変異 LUAD の precision immunotherapy 戦略への translational 展開が期待される。
残された課題 として、(i) SOCS1 阻害の具体的治療戦略 (small-molecule inhibitor の開発、PROTAC degrader、antisense oligonucleotide) の 今後の検討 必要、(ii) 免疫 checkpoint 阻害薬抵抗性の他の機序 (β2-microglobulin loss・antigen presentation defect・TGF-β pathway 等) との相互作用の 今後の課題 解明、(iii) Patient-derived xenograft (PDX) や humanized mouse での再現、(iv) Clinical trial での SOCS1 expression / IFNγ signature を predictive biomarker として prospective validation、(v) Non-KRas 変異 NSCLC subset (EGFR mutant 等) での IFNγ-SOCS1 axis の relevance、が 今後の研究 課題として残る。Limitation として、(a) 同系マウスモデルのみで humanized model 不足、(b) 2 cell lines のみで NSCLC heterogeneity の reproducibility が limited、(c) Socs1 knockdown の off-target effect が完全排除できない、(d) Translational gap (mouse SOCS1 4-fold 差が human relevance に直接 mapping するか) が 今後の研究 で improvement 要。本論文は EV カテゴリ分類だが内容は tumor-immune axis であり、tumor-intrinsic IFNγ signaling と EV cargo selection (e.g., exosomal PD-L1) との関連は今後の interface 研究方向として有望である。
方法
動物モデル: KRas 変異 NSCLC 同系株 (syngeneic) として CMT167 (KRas G12V mouse adenocarcinoma, C57BL/6 系) と LLC (Lewis lung carcinoma, KRas G12C-like, C57BL/6 系) を使用。雌 C57BL/6 マウス (6-8 週齢、Jackson Labs) に皮下注射 (1×10⁶ cells/100 μL) または orthotopic intrapulmonary 移植。
抗 PD-1 治療実験: 抗 PD-1 monoclonal antibody (clone RMP1-14, BioXCell) 200 μg を 腹腔内 (i.p.) 投与、day 7・10・13 の Q3D × 3 投与。Isotype IgG2a control (clone 2A3) を対照群。腫瘍体積は caliper 測定 (V = L × W² × 0.5) で 隔日評価。
RNA-seq + IFNγ 応答 signature 解析: CMT167 + LLC cells を recombinant IFNγ 10 ng/mL 24時間刺激 → mRNA 抽出 → Illumina HiSeq2500 で RNA-seq。Differential expression は DESeq2 で計算、Hallmark IFNG_RESPONSE_SIGNATURE (Liberzon 2015 MSigDB) で GSEA enrichment。
Genetic perturbation (shRNA knockdown via lentivirus): Lentiviral shRNA vector (pLKO.1, Sigma MISSION shRNA library) で Ifngr1-shRNA (2 sequences)・Socs1-shRNA (2 sequences) を CMT167 / LLC cells に transduction、puromycin 2 μg/mL 選択。Knockdown 効率は qRT-PCR (SYBR Green, Applied Biosystems) と Western blot で確認 (>80% protein 減少)。
Flow cytometry (TME 免疫細胞解析): 移植腫瘍を collagenase D + DNase I で消化 → single cell suspension → 多色 flow cytometry (BD LSR Fortessa)。Panel: CD45・CD3・CD4・CD8・CD11b・Ly6G・Ly6C・F4/80・PD-L1・MHC II・Ki-67。Gating は CD45+ live cells 内で実施。
統計手法: 平均 ± SEM (n=5-10 mice per group)、対応 Student t-test (2 群比較)、two-way ANOVA + Bonferroni (経時データ)、log-rank test (survival)、Prism 7 software (GraphPad)。有意水準 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。
ヒトデータベース: TCGA-LUAD (n=515) + TCGA-LUSC (n=502) + CCLE (n=1,019 cell lines) で JAK1, JAK2, IFNGR1, IFNGR2 の non-synonymous mutation 頻度を cBioPortal で抽出。