- 著者: Alvarez MJ, Subramaniam PS, Tang LH, Grunn A, Aburi M, Rieckhof G, Komissarova EV, Hagan EA, Bodei L, Reidy-Lagunes D, Modlin I, Califano A, et al. (iNET Consortium, 18 institutions)
- Corresponding author: Irvin Modlin (Yale University School of Medicine); Andrea Califano (Columbia University Irving Medical Center, New York, NY)
- 雑誌: Nature Genetics
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-07-23
- Article種別: Original Article
- PMID: 29915428
背景
プレシジョンオンコロジー (precision oncology) の主流アプローチは actionable 変異 (Lynch et al. NEnglJMed 2004 のEGFR / Kwak 2010 の ALK / Davies 2002 の BRAF) の同定に基づく標的療法であるが、複数の限界が存在する。先行研究1: Garraway 2013 等が示したように成人悪性腫瘍の多くは actionable 変異を欠き、または druggable でない oncogene (RAS / MYC family) に変異を持つか治療的価値が不明瞭。先行研究2: 初期奏効後の薬剤耐性出現 (Sequist 2011, Engelman 2010) も普遍的に発生。先行研究3: Garnett 2012 (Nature) は数百の細胞株と化合物の解析で BRAF / ERBB2 / EGFR / ALK 阻害薬を除き「変異は薬剤感受性の poor predictor」であることを示した。先行研究4: Carro 2010 / Lefebvre 2010 等は腫瘍細胞状態が少数の master regulator (MR) タンパク質の協調活性 (tumor checkpoint) によって維持されることを示し、白血病・リンパ腫・glioblastoma・前立腺癌・神経芽腫・乳癌で MR 阻害が tumor viability 喪失を導くことを実証 (Piovan 2013, Aytes 2014)。先行研究5: Alvarez 2016 (Nat Genet) は VIPER (Virtual Proteomics by Enriched Regulon analysis) アルゴリズムを開発し、RNA-seq から個別 sample レベルで タンパク質活性を推論可能とした。既存知見の課題: (1) 多くの GEP-NET (gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor: 胃腸膵神経内分泌腫瘍) は actionable 変異を欠き標的療法選択が不明である、(2) 転移性 GEP-NET の有効治療選択肢は限られており、everolimus / sunitinib / SST-analogs等の効果は不十分、(3) ゲノム変異非依存の薬剤選択法は GEP-NET では未開拓、(4) MR-based OncoTreat methodology を GEP-NET で systematic に検証した先行研究は未確立であった。これが「何が足りなかったか」の核心で、本研究は18施設 iNET consortium + 212 patients という前例のない規模で gap in knowledge を埋めることを目指す。
目的
(1) 18施設 international NET Consortium (iNET) からの212例 GEP-NET (P-NET 113例: pancreas / SI-NET 81例: small intestine / RE-NET 18例: rectum、原発+転移) を RNA-seq で解析し、GEP-NET 特異的な転写制御ネットワーク (interactome) を構築する、(2) VIPER アルゴリズムで master regulator (MR) タンパク質を同定する、(3) OncoTreat methodology により107化合物 (Broad Institute 504化合物から GEP-NET cell line で 102 + literature 由来 MR inhibitor 5 = 107) を MR 活性反転能で優先順位付けする、(4) 最優先候補化合物の有効性を patient-derived xenograft で in vivo 検証することを目的とした。
結果
GEP-NET 分子サブタイプの同定 (n=212 RNA-seq): PAM-based consensus clustering により、gene expression で4 cluster (E1-E4) が同定された。これらは tissue-of-origin (SI-NET / P-NET / RE-NET / mixed) を反映する (Fig 1a)。一方、VIPER 推論 protein activity ベースの clustering では5 cluster (A1-A5) が識別され、metastatic state をより正確に反映した。Gene expression vs. protein activity の cluster reliability score 比較では、protein activity が有意に優位であった (p<10⁻¹⁵、one-sided paired U-test、Fig 1b)。A1 は SI-NET-specific、A3 は P-NET-specific、A4 は RE-NET、A2 と A5 は heterogeneous (mainly P-NET + SI-NET) であった。Gene expression と protein activity の cluster 構造は Spearman r=0.88 (Adjusted Rand index、p<10⁻⁸⁰、permutation test) で一致した。
Metastatic progression MR の同定: n=69 (hepatic metastases) の MET-GES (gene expression signatures of metastatic transition) を VIPER 解析した。4 metastatic progression clusters (M1-M4) が同定され、各 sample の top 25 positive + 25 negative MR が他 metastatic samples でも highly enriched であった (1,416 / 2,346 = 60.4% pairs で FDR<0.01 の MR overlap、Fig 1c)。これは、GEP-NET が tissue-of-origin に横断的な common metastatic progression mechanism を持つことを示唆する。Cluster A1-A5 と M1-M4 の関連性は minimal であり、metastatic progression は lineage-related confounding factors と decouple される。共通 MR には developmental proteins (GDF2、CUX2、BMP10) と immune-related markers が含まれる (Fig 1d、Supplementary Table 4a-e)。
Master regulator の experimental validation (shRNA silencing): H-STS の cell viability assay で34 candidate MR を試験した。16 MR が ≥40% knockdown を達成し (qRT-PCR confirmed)、そのうち15/16 (94%) が ≥20% growth / viability reduction を誘導した (one-tailed p<0.01、ANOVA、Fig 4)。KRJ-I cells でも同様の結果が得られ、negative control NCI-H716 では効果なしであった。これは patient-specific MR dependencies が mutation-independent な universal 性を持つことを実証している。Validated MR は次の3群に分類される。early neuroendocrine lineage factors (IKZF1、IKZF3、SPI-1、GFI-1、POU2F2)、EMT (epithelial-mesenchymal transition) drivers (Notch2、EOMES、GATA3)、immunomodulatory factors (CD45/PTPRC、IL2RB1、CD53、CD86、RUNX3、CIITA、IL10) であり (Fig 4c)、いずれも aggressive NET の key hallmarks を recapitulate する。
OncoTreat 薬剤優先順位付け (107化合物): 504 compounds から H-STS / P-STS / KRJ-I の AUC を用いて 107 化合物を選択し、Broad Institute との Spearman r=0.71 で reproducibility を確認した。次に n=32 samples (H-STS xenograft で MR が significantly recapitulated される subset、one-tailed p<10⁻¹⁰ Bonferroni-corrected) で drug-induced MR activity inversion を評価した。Patient 0 では 6 compounds が tumor-checkpoint collapse を誘導した (Bonferroni-adjusted p<10⁻¹⁰)。内訳は entinostat (HDAC class I inhibitor、HDAC1/3-selective)、I-BET151 (bromodomain inhibitor)、bardoxolone methyl (Nrf2 activator / NFκB inhibitor)、PHA-665752 (c-Met inhibitor)、flavopiridol (CDK1/2/4/6 inhibitor)、FK866 (NMPRTase inhibitor) である (Fig 5a)。全 cohort 解析では entinostat と I-BET151 が highly significant な tumor-checkpoint collapse を転移性 GEP-NET 患者の47%および42%で予測した。Entinostat は metastatic GEP-NET の42%で MR activity profile を反転する最有力候補である。
In vivo 検証 (Xenograft pharmacology): 各患者の MR activity profile に match した H-STS xenograft model (NSG mice) で entinostat の効果を試験した (Fig 6)。Entinostat 投与により xenograft tumor growth が有意に抑制され、MR-matched tumors では非 match tumors より効果が大きかった (n=8 mice/arm、HR 0.42 for tumor regression、p<0.01)。これは patient-MR-matched precision oncology の妥当性を支持する。Monte Carlo simulation 10,000 iterations で MR correlation の chance level <0.01 を確認した。
Reproducibility と external validation: n=33 samples (TCGA tumor cohorts) との reproducibility 比較で GEP-NET 内 reproducibility は average level (Supplementary Fig 1a)、n=25 samples (既存 tumor-specific models) との交差検証で GEP-NET interactome の distinct nature を確認した。さらに H-STS が 923 cell lines 中 top 0.43% (=4位、Spearman r=0.85)、KRJ-I が top 0.65% (=6位、Spearman r=0.82) で metastatic MR signature を recapitulate (Fig 2)。これらは GEP-NET interactome の robustness と GEP-NET 特異性の両方を示す independent validation である。
考察/結論
本研究は、GEP-NET (gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor) という稀少・難治・heterogeneous な悪性腫瘍群において、ゲノム変異非依存の精密医療フレームワーク OncoTreat を初めて systematic に検証した。precision oncology 領域における主要な前進である。
先行研究との違い：従来の Garraway 2013 や Cancer Genome Atlas に代表される mutation-driven precision oncology と異なり、本研究はゲノム変異ではなく腫瘍の transcriptional checkpoint (master regulator (MR) protein activity) を標的とする paradigm shift を提示した。先行の Alvarez 2016 VIPER paper と比較すると、本研究は VIPER を large patient cohort (n=212) に scale up し、xenograft validation まで通した end-to-end の枠組みを構築した点で異なる。HDAC inhibitor の先行臨床試験 (Ramalingam 2014 等) が unselected な集団を対象にしていたのに対し、本研究は HDAC class I subtype (HDAC1/3-selective な entinostat) を MR-based mechanism で patient sub-population (42%) に narrow した点が大きな違いである。
新規性：本研究の novel な貢献は以下の5点である。①18施設・212例という前例のない規模で GEP-NET interactome (571,499 interactions、5,631 proteins) を構築した。②Protein activity-based clustering (A1-A5) が gene expression-based (E1-E4) より p<10⁻¹⁵ で優位な分子サブタイプ識別を示した。③HDAC class I 阻害薬 entinostat が GEP-NET 転移患者の42%で MR activity 反転を予測することを示した。④15/16 MR が shRNA silencing で viability reduction (94% hit rate) を示し、robust な MR dependency 検証を達成した。⑤Lineage-determined developmental proteins (GDF2、CUX2、BMP10) が GEP-NET 転移進行で universal MR として機能することを発見した。
臨床応用：①OncoTreat methodology は patient-specific な MR profile を用いた薬剤選択を可能にし、現行ゲノム panel 検査 (FoundationOne 等) で actionable 変異が見つからない患者にも適用可能となる。②Entinostat を transcriptome-defined precision GEP-NET treatment とする臨床試験 (NCT03211988 等) が既に進行している。③本フレームワークは肺 LCNEC (large cell neuroendocrine carcinoma) や SCLC への直接応用が可能で、肺神経内分泌腫瘍の actionable variant 不在問題への解決策となりうる。④MR-based companion diagnostic の開発も in-flight である。
残された課題と今後の方向性：以下6点が limitation である。①本研究は GEP-NET 特化のため、肺 NET (LCNEC / SCLC) への外挿は未検証である。②Entinostat 臨床試験 (METNET) の results は本論文出版時点で limited であり、より大規模 phase II/III が必要。③Clinical sample annotation が sparse (rare malignancy のため) で long-term outcome との correlation 解析は今後の課題。④MR-targeted drugs と genome-targeted drugs の rational combination strategy 開発が待たれる。⑤Patient-derived organoid (PDO) との integration が望ましい (Kawasaki et al. Cell 2020 の NEN organoid biobank が relevant platform を提供する)。⑥Immune microenvironment と MR の interaction (validated immune MR: CD45、CD86、IL10) は tumor-immune dynamics の precision intervention 標的として興味深い領域である。本研究は precision oncology の新展開として広く引用され (>200 citations as of 2024)、後続の OncoTreat 他癌種展開 (前立腺癌、prostatic small cell carcinoma 等) の foundation を確立した。
方法
本研究は 18施設国際 NET Consortium (iNET、Identifier: Supplementary Table 1 に participating institutions 一覧) から fresh-frozen GEP-NET 検体 212例 (P-NET: 83 primary + 30 metastatic、SI-NET: 44 primary + 37 metastatic、RE-NET: 3 primary + 15 metastatic) を収集し RNA-seq 解析した systems biology + precision oncology の統合研究である。Cell lines (basic ID): H-STS (SI-NET-derived metastatic、Pfragner 2008)、KRJ-I (SI-NET-derived primary)、P-STS (primary control)、NCI-H716 (negative control、colorectal carcinoid)。Mouse model: NOD/SCID gamma mice (NSG) for xenograft engraftment。Sample selection criteria: 板認定病理医による review、腫瘍細胞率 ≥ 70%、quality control で 2.3% 除外。Computational pipeline: (1) ARACNe (Accurate Reconstruction of Cellular Networks) アルゴリズムで GEP-NET interactome を構築 (571,499 transcriptional interactions / 5,631 proteins (1,785 TF + 3,846 signaling) / 20,136 target genes) — pan-GEP-NET 全 212例使用が subtype-specific より prediction quality 最大化 (FDR < 0.05 で metastases 99% conservation、primaries 98.9%)、(2) VIPER で 212 transcriptional profiles → 5,578 proteins の activity profile に変換、(3) PAM (Partitioning Around Medoids) consensus clustering + t-SNE で分子サブタイプ E1-E4 (gene expression) および A1-A5 (protein activity) を識別、(4) MR identification: 各 metastatic sample (n=69) vs. cluster-matched primaries の MET-GES signatureを VIPER 解析、(5) shRNA validation: 34 候補 MR を lentivirus-mediated shRNAで H-STSに silencing (qRT-PCR ≥ 40% knockdown を criterion)、viability assay (ANOVA、one-tailed p<0.01)、(6) Compound screening: 504化合物の AUC (area under dose-response curve)-based prioritization、107化合物を H-STS で 24h treatment 後 RNA-seq → VIPER で drug-induced MR activity inversion を測定、(7) Statistical aggregation: Stouffer’s method で multiple replicates 統合、Bonferroni correction で multiple testing 補正。Monte Carlo simulation 10,000 iterations で MR correlation の chance level 評価。Statistics: ANOVA / one-sided paired U-test / Spearman correlation / aREA enrichment test (Bonferroni-corrected)。