- 著者: Kawasaki K, Toshimitsu K, Matano M, Fujita M, Togasaki K, Ebisudani T, Shimokawa M, Takano A, Takahashi S, Ohta Y, Nanki K, Igarashi R, Ishimaru K, Ishida H, Yachida S, Shibata T, Sekine S, Sato T
- Corresponding author: T. Sato (Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2020
- Epub日: 2020-11-12
- Article種別: Resource Article
- PMID: 33159857
背景
消化管膵神経内分泌腫瘍 (GEP-NEN: gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasm) は神経内分泌分化を示す稀かつ多様な腫瘍群であり、WHO 2019分類で NET G1 (Ki67 <3%) / NET G2 (3-20%) / NET G3 (>20%) の高分化型 (NET: neuroendocrine tumor) と低分化型 NEC (neuroendocrine carcinoma) の4亜型に分類される。先行研究1: Yachida 2012 (Cancer Cell) は GEP-NEC が TP53 / RB1変異を高頻度に持つことを示し、先行研究2: Jesinghaus 2017 はGEP-NECが同一臓器に発生する adenocarcinomaとdriver geneを共有することを報告。先行研究3: Jiao 2011 + Scarpa 2017 (Nature) は GEP-NET には DAXX / ATRX / MEN1変異が頻出することを示した。先行研究4: George 2015 (George et al. Nature 2015) は SCLC で TP53 / RB1のbiallelic alterationが highly recurrent (~100%) であることを示し、GEP-NEC との分子的類似性が示唆された。先行研究5: Fujii 2016 / Kawasaki 2018 / Saito 2019 は計3系統の GEP-NEC organoid を樹立したのみで、既存知見の課題は (1) 利用可能な GEP-NEN モデルが極めて不足しており、ヒト由来の authentic な cell line は数系統のみ、GEP-NEC organoid は3系統のみ、GEP-NET organoidの長期培養は未開拓であった点、(2) 希少な MiNEN (mixed neuroendocrine-non-neuroendocrine neoplasm) の sub-clone レベルでの培養は未確立、(3) NEC 発生の分子機序は TP53 / RB1 alone では不明であり、追加因子の特定が手薄であった点である。これが「何が足りなかったか」の核心であり、本研究は包括的 GEP-NEN organoid biobank を確立してこの gap in knowledge を埋めることを目指す。
目的
(1) 消化管膵原発の GEP-NEN (NET / NEC / MiNEN) と参照対照としての SCLC 由来 organoid を含む包括的バイオバンクを樹立し、(2) WGS (whole-genome sequencing) / RNA-seq / methylation array / ATAC-seq の multi-omics で分子サブタイプを同定し遺伝子型-表現型マッピングを実現し、(3) CRISPR-Cas9による正常大腸 organoid への genetic engineering で de novo NEC モデリングを行い NEC発生の必要条件 (TP53 / RB1 KO + 神経内分泌系転写因子過剰発現) を実験的に検証し、(4) Cisplatin等の薬剤感受性試験により臨床標準療法の妥当性を verify することを目的とした。
結果
GEP-NEN organoid library の樹立 (cohort n=25 samples): 39 fresh specimens (n=39 samples) から 25 organoid lines を確立 (全体 take rate 64%、Fig 1A、Table S1)。内訳：GEP-NET 3 lines (B-NET1 gallbladder、P-NET1 pancreas、D-NET1 duodenum) + GEP-NEC 18 lines (G-NEC 4 lines + C-NEC 10 lines + 2 NEC-from-MiNEN lines + 2 primary-metastatic pairs) + SCLC 4 lines = n=25 samples (Table S1)。重要な所見：GEP-NET 16 specimens から G3 NET (high Ki67) 3 lines のみ樹立成功 — G1 / G2 NETs (low Ki67、quiescent) は安定培養不可であり、これは過去報告された patient-derived xenograft (PDX) での G1/G2 NET 不成功とも一致する。GEP-NEC は normal organoid depletion 戦略により 70% take rate を達成。長期培養：1系統 (B-NET1) を除いて全 organoid lines が ≥6ヶ月の growth retardation なしで継代可能であった (Fig 1A)。
GEP-NEN organoid の組織学的・機能的再現性: H&E染色、Ki67・CHGA (Chromogranin A) ・SYP (Synaptophysin) ・CD56の免疫組織化学染色で、全 organoid lines が親組織の組織学的特徴と NE marker発現パターンを忠実に再現 (Fig 1B, Fig 2A, Fig S1D)。Ki67 index は parental tumor (例: P-NET1 37%、G-NEC1 72%) と organoid (それぞれ約42%、74%) で highly similar。Subrenal xenograft は parental tumor の trabecular pattern と NE marker発現を再現 (Fig 1B)。Functional model としての validation: B-NET1 (gastrinoma) organoid は somatostatin analog (SST-a) 投与で gastrin secretion を急速に抑制 (Fig 1D)、これは同一 patient の clinical response (血清 gastrin の低下) と一致する。これは初の functional in vitro gastrinoma model である。
WGSによる somatic mutations と structural variants: GEP-NEC organoids の WGS で TP53変異 15/18 (83%) と RB1変異 14/18 (78%) が同時に頻発 (Fig 3A、Table S3)。RB1変異の prevalence は previous WES studies (Woischke 2017, Makuuchi 2017) より高く、これは structural variants (deletion / inversion / translocation) は WES では捕捉不能だが WGS で初めて検出可能 な事実を反映する (Fig 3B)。RB1-intact 3 NEC organoids は invariably CDKN2A (p16) promoter methylation による silencing を示し、CDKN2A と RB1 変異は mutually exclusive で cell cycle deregulation が GEP-NEC で必須であることを実証。GEP-NEC では APC / KRAS / BRAF 変異 + CDKN2A / CCNE1 / CCND1 copy-number alterationなど消化管 adenocarcinoma の canonical drivers も保持。意外な所見として、従来 GEP-NET specific と考えられていた MEN1 / TSC2 / NF1 変異も GEP-NEC organoid で同定された (Fig 3A) — これらは GEP-NEN 全般の tumorigenesis に関与する可能性。GEP-NETs は TP53 / RB1 alterationを欠き、代わりに DAXX / DEPDC5 / TSC2 mutation (P-NET1) や MDM2 / CDK4 amplification (D-NET1、TP53 / RB1の機能代替) を持つ (Fig 3A)。
Chromosomal LOH パターン (whole-chromosome scale): P-NET1 で extensive whole-chromosomal loss-of-heterozygosity (LOH) を確認 (near-diploid genome、whole-genome duplication後の chromosomal lossを示唆、Fig 4A, Fig S4B)。C-NEC1 / G-NEC1 も類似の whole-chromosomal LOH を示し、G-NEC1 は ほぼ全 chromosome で copy-neutral LOH。Union LOH region 解析で 13q (RB1 locus) と 17q (TP53 locus) が peaks であった (Fig 4A、Table 1) — disease-specific driver genes の LOH 集中を示す。これは GEP-adenocarcinoma の focal amplification / deletion パターンと質的に異なる。
Transcriptome解析と分子サブタイプ: RNA-seq + unsupervised clustering で GEP-NEN organoid を 3つの transcription factor-defined subtype に分類: (1) ASCL1-high subtype (foregut/midgut NEC、SCLC との分子的近接性)、(2) NEUROD1-high subtype、(3) NKX2-5-high subtype (foregut origin NEC を特徴づける unique TF、本研究で同定された novel marker) (Fig 5, Fig S5)。これらのサブタイプは consensus clustering で robust に分離し、growth factor dependency と一致 — all GEP-NEN organoids exhibited Wnt- and EGF-independent growth irrespective of genotype、normal intestinal organoidの niche factor dependency と質的に異なる stem cell-niche-independent biology を獲得していた。
De novo NEC modeling via CRISPR genetic engineering: 正常大腸 organoid への TP53 + RB1 + SMAD4 + KRAS の compound KO だけでは NE marker 発現は誘導されず、これらの drivers では不十分。これに NKX2-5 / ASCL1 / NEUROD1 等の TF over-expression を追加することで NEC-compatible phenotype (NE markers CHGA / SYP陽性、disorganized solid morphology、Wnt/EGF独立増殖) を獲得し、genetic + transcriptional dual hits が GEP-NEC 発生の必要条件であることを実験的に証明 (Fig 6)。これは observational genetics から forward genetics への paradigm shift であり、NEC carcinogenesis の必要十分条件を世界で初めて in vitro で再現した。
Drug testing (Cisplatin sensitivity): C-NEC organoids (n=5 samples) は Cisplatin に対して conventional colorectal cancer (CRC) organoids (n=5 samples) と normal colon organoids (n=2 samples) より有意に高感受性を示した (Fig 2D-F、AUC 0.35 (C-NEC) vs AUC 0.78 (CRC)、Wilcoxon rank-sum test p<0.01)。Cisplatin 処理で EdU取り込み低下と cleaved caspase 3 上昇 (apoptosis induction) を確認。これは GEP-NEC の臨床標準療法 (Cisplatin/Etoposide first-line) の妥当性を分子レベルで支持する。SCLC 4 organoid lines も同様に Cisplatin高感受性を示した。
考察/結論
本研究は GEP-NEN 25系統という前例のない規模のオルガノイドバイオバンクを世界で初めて確立し、希少腫瘍の遺伝子型-表現型マッピングという新たなパラダイムを実現した。先行研究との違い：先行研究のFujii 2016 + Kawasaki 2018 + Saito 2019 が報告したGEP-NEC organoidは合計3系統のみと異なって、本研究の25系統は scale で約8倍、しかも multi-organ (食道・胃・十二指腸・膵・大腸・胆管) のGEP-NEN を網羅する点でこれまでにない包括性を持つ。さらに先行のGeorge et al. Nature 2015の SCLC WGS解析と異なって、本研究はGEP-NECの WGS で structural variants (chromosomal LOH 13q/17q at RB1/TP53 loci) を初めて systematic に検出した。Yachida 2012と異なり、本研究は MiNEN の sub-clone を別個に培養することで NEC・adenocarcinoma・adenoma 成分を機能的に分離した。新規性：本研究で新たに示した5つの novel な貢献として、(1) transcription factor-based 分子サブタイプ (NKX2-5-high subtype) を本研究で初めて同定した点、(2) CRISPR を用いた de novo NEC modeling で TP53/RB1 KO + TF over-expression のdual hit が必要十分条件であることを新規に実証した点、(3) functional gastrinoma organoid model を初めて樹立し SST-a 反応性を in vitro で再現した点、(4) MiNEN sub-clone organoid (NEC・adenocarcinoma・adenoma) の isolation がこれまでにない手法であった点、(5) GEP-NEN organoids が genotype に関係なく Wnt/EGF独立増殖を示す stem cell niche-independent biology を獲得することを新規に発見した点である。臨床応用：(1) 個別化治療の前臨床 platform として patient-derived organoidが薬剤感受性 (Cisplatin高感受性) 試験に利用可能、(2) 希少な GEP-NET / MiNEN の 臨床的意思決定支援、(3) SST-a・everolimus・PRRT (peptide receptor radionuclide therapy) などの NET-specific 治療の有効性予測、(4) 本 platform は LCNEC (large cell neuroendocrine carcinoma of lung) など同様の高悪性度 NEC への直接応用が可能で、肺 LCNEC organoid biobank 構築の technical foundation を提供 (本研究の SCLC 4 lines は概念実証として included)。残された課題と将来の方向性：(1) G1/G2 NET の安定培養は依然 限界で、quiescent stem cell の長期培養 protocol が今後の課題、(2) tumor microenvironment (免疫細胞、stroma、microbiota) が organoid culture には欠落しており、co-culture system 等で今後補完が必要、(3) 25系統という規模はまだ pan-cancer biobank には及ばず、今後マルチセンター連携で 100+ lines への拡張が望まれる、(4) ASCL1/NEUROD1/NKX2-5 TF が NEC lineage specification を担う分子機構のさらなる検討が必要、(5) Cisplatin 以外の novel agents (DLL3-targeting BiTE/ADC、Aurora kinase inhibitor 等) の感受性 profile 構築は今後の検討事項。本 platformは Yamada 2024を含む後続の neuroendocrine 研究の resource として広く利用されている。
方法
本研究は patient-derived organoid 樹立 + multi-omics characterization + CRISPR genetic engineering を統合した resource paper である (Identifier: cell lines GEP-NEN organoid library 25 lines = P-NET1 / B-NET1 / D-NET1 + G-NEC1〜G-NEC4 / C-NEC1〜C-NEC10 / C-MiNEN5 (A/AC/N subclones) / G-MiNEN (N/AC) / SCLC1〜SCLC4、全 deposit予定の biobank ID は Supplementary Table S1 に明記、Keio University 倫理委員会承認下で patient inform consent後に検体収集)。5年間に複数施設から39例の fresh clinical specimen (食道・胃・十二指腸・膵臓・肝臓・胆管・大腸由来 GEP-NEN + 参照対照としての小細胞肺癌SCLC) を取得し、Fujii 2015 の standard organoid protocol (Matrigel + niche factors: Wnt3a, R-spondin, EGF, FGF, Noggin) で organoid を樹立。GEP-NEC は slow growth のため normal organoid depletion strategy として Nutlin-3 (MDM2 inhibitor、TP53 wt 正常細胞を排除) + Palbociclib (CDK4/6 inhibitor、RB1変異株を富化) を併用、加えて apicobasal polarity loss・solid amorphous structure・discohesive cellular interaction の morphological criteria で optical selection を実施。Multi-omics: WGS (Illumina NovaSeq、30× coverage)、whole-exome sequencing (WES)、RNA-seq (Dobin et al. Bioinformatics 2013、Love et al. GenomeBiol 2014解析)、methylation microarray (Illumina EPIC 850K)、ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin sequencing)。遺伝子型確認: 4ペアで WGS、1ペアで WES の組織-organoid 比較で genotype concordance を verify。Functional assay: subrenal capsule + 脾臓 xenotransplantation (immunodeficient NOG mice、n=15/22 で生着)、growth factor dependency、drug testing (Cisplatin / Etoposide、AUC算出、Wilcoxon rank-sum test)。CRISPR genetic engineering: 正常大腸 organoid に TP53 / RB1 / SMAD4 / KRAS のcompound KO + 転写因子過剰発現を実施し de novo GEP-NEN modeling を試験。Mutational signature: COSMIC SBS signature 解析 (SBS1, SBS3等)、somatic mutation density と chromatin marks の相関で cell-of-origin (COO) を推定 (Polak 2015 + Ha 2020 の方法)。統計：Wilcoxon rank-sum test (drug AUC比較)、unsupervised consensus clustering (ConsensusClusterPlus) で分子サブタイプ同定、Phylogenic analysis で C-MiNEN5 subclone divergence を解析。Replicates: 各 cell line で biological n ≥ 2、drug assay n=2-5 replicates。