- 著者: Chunhong Hu, Lishu Zhao, Wenliang Liu, Songqing Fan, Junqi Liu, Yuxuan Liu, Xiaohan Liu, Long Shu, Xianling Liu, Ping Liu, Chao Deng, Zhenhua Qiu, Chen Chen, Yi Jiang, Qingchun Liang, Lingling Yang, Yang Shao, Qiongzhi He, Danlei Yu, Yue Zeng, Yizheng Li, Yue Pan, Sujuan Zhang, Shenghao Shi, Yurong Peng, Fang Wu
- Corresponding author: Fang Wu, MD, PhD (Department of Oncology, The Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, China)
- 雑誌: Journal for ImmunoTherapy of Cancer
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-07-01
- Article種別: Original Article
- PMID: 34887263
背景
肺癌は世界で最も致死的な悪性腫瘍であり、その診断と治療は依然として大きな課題を伴う。多発原発性肺癌 (MPLC: multiple primary lung cancers) は、同時性または異時性に2つ以上の原発性肺癌を有する状態と定義され、CTの普及によりその検出頻度が増加している。MPLCは肺内転移とは区別されるべき疾患概念であるが、その鑑別には組織学的および分子遺伝学的診断基準が必要であり、臨床的な挑戦を伴う。従来の診断基準では不十分な場合が多く、次世代シーケンシング (NGS: next-generation sequencing) の発展により、米国胸部疾患学会 (ACCP: American College of Chest Physicians) ガイドラインや米国癌合同委員会 (AJCC: American Joint Committee on Cancer) の癌病期分類第8版では、異なる分子遺伝学的特性が診断基準に追加されたものの、具体的な遺伝子変異パターンについては言及されていなかった。したがって、MPLCにおけるゲノム変異パターンを特定することは、正確な診断を達成するために不可欠である。
治療面においても、MPLCは特有の課題を抱えている。切除後の残存すりガラス陰影 (GGO: ground-glass opacities) に対するEGFR-TKIの効果は限定的であり、客観的奏効率 (ORR: objective response rate) は約15%と報告されているに過ぎない (Cheng et al. 2021)。また、免疫チェックポイント阻害薬 (ICI: immune checkpoint inhibitors) への応答も、小規模研究では不満足な結果が得られていた (Wu et al. 2020)。これらの治療効果の低さは、MPLCの腫瘍生物学的特性が単発性肺癌とは異なる可能性を示唆している。
ICIの感受性を予測するバイオマーカーとして、EGFR変異、腫瘍変異量 (TMB: Tumor Mutational Burden)、PD-L1 (programmed death-ligand 1) 発現、腫瘍浸潤リンパ球 (TIL: Tumor-Infiltrating Lymphocytes) などが知られているが、MPLCにおけるこれらのバイオマーカーの分布は未解明のままであった。特に、複数病変間でのバイオマーカーの不均一性 (heterogeneity) は、単一生検からMPLC患者全体のICI感受性を推定することの妥当性に根本的な疑問を提起する。過去の小規模研究では、MPLCにおけるPD-L1発現レベルとその不均一性が調査されたが、コンセンサスは得られていない (Haratake et al. 2018, Mansfield et al. 2016)。TMBは複数の固形腫瘍においてICIの予測バイオマーカーとして確立されているが Sha et al. CancerDiscov 2020、MPLCにおけるその発現パターンはほとんど知られていなかった。さらに、CD3+/CD8+ TILやCD68+/CD163+腫瘍関連マクロファージ (TAM: Tumor-Associated Macrophages) などの免疫細胞浸潤の様相も、MPLCにおいては十分に解明されていなかった。これらの知識のギャップは、MPLC患者に対する個別化された治療戦略を確立する上で大きな課題が残されており、この点がこれまで不足していた。
目的
本研究の目的は、外科的切除を受けた同期性MPLC患者において、各病変のゲノム変異プロファイル、TMB、PD-L1発現、および免疫細胞浸潤パターンを詳細に解析することである。これにより、MPLCの免疫療法感受性に関わる腫瘍生物学的特性、特に病変間の不均一性を明らかにすることを目的とした。具体的には、ゲノム変異とTMB、PD-L1発現、および免疫細胞浸潤の関連性を評価し、各バイオマーカーの病変間不均一性を定量的に評価することを目指した。最終的には、これらの知見がMPLCの正確な診断と、免疫療法および分子標的療法における患者選択の指針となることを目指した。
結果
患者および腫瘍の基本特性: 対象患者112例のうち、73.2%が女性、88.4%が非喫煙者、76.8%が60歳未満であった。全例が同期性MPLCであり、最多腫瘍数は2個 (60.7%) であった。腫瘍の89.8%がGGO形態を示し、99.0%が腺癌 (adenocarcinoma) であった。病理組織学的には、腺癌in situ (AIS: adenocarcinoma in situ) が12.2%、微小浸潤性腺癌 (MIA: minimally invasive adenocarcinoma) が18.4%、浸潤性腺癌が68.4%を占めた。TNM病期はT1a/b/c病変が86.5%、N0が99.0%、病期I期が98.7%と、早期病変が主体であることが示された。腫瘍径は1cm以下が67.3%と微小腫瘍が多数を占めていた。これらの特徴は、MPLCが非喫煙者の女性に多く、早期のGGO形態として発見される傾向があるという近年の報告と一致する。
ゲノム変異プロファイル: 255病変のNGS解析により、248病変で833個の体細胞変異が検出された。最も頻繁に検出された変異はミスセンス変異であり、SNV (single nucleotide variation) ではC>T置換が最も多かった。上位10位の変異遺伝子は、EGFR (56%)、ERBB2 (12%)、TP53 (12%)、BRAF (11%)、RBM10 (11%)、KRAS (9%)、MAP2K1 (7%)、LRP1B (5%)、MED12 (5%)、PIK3CA (4%) であった (Figure 2D)。EGFR変異はERBB2、BRAF、KRAS、MAP2K1変異とは相互排他的であり、TP53およびRBM10変異とは有意に共変異していた (p<0.05)。EGFR変異サブタイプでは、L858Rが38.46%、exon 19delが21.89%を占めた。BRAF変異ではclass II変異が50.00%と最多であり、V600E (class I) は6.25%と少数であった。KRAS変異ではG12C (27.27%) とG12V (22.73%) が主体であった。 患者112例中87例 (77.7%) で各腫瘍間のゲノム変異プロファイルが異なり、多クローン起源であることが示唆された。一方、61例 (54.5%) の患者では、少なくとも2つの腫瘍間で1つ以上のドライバー遺伝子変異を共有しており、これらの患者はより進行したT stage (≥T1c; p=0.027) およびpTNM stage (≥IA3; p=0.039) を有する傾向があった。
TMBと遺伝子変異の関連: MPLC病変全体のTMB中央値は1.92 muts/Mb (範囲: 0-26.88) と低値であった。25パーセンタイルは0.96 muts/Mb、75パーセンタイルは3.00 muts/Mbであった。高TMB (≥3 muts/Mb) 病変は、患者の27.7% (n=31) および病変の25.9% (n=66) で認められた。TMBは浸潤性腺癌、高T stage、高TNM stageの腫瘍で高値を示した (Figure 3)。 遺伝子変異との関連では、EGFR L858R変異腫瘍はEGFR野生型腫瘍よりもTMBが高値であった (2.88 muts/Mb vs. 1.92 muts/Mb; p=0.003)。また、sensitive EGFR変異 (L858R/exon 19del) 腫瘍はEGFR野生型よりも有意に高いTMBを示した (p<0.001)。対照的に、ERBB2変異腫瘍は野生型よりも低いTMBを示した (1.00 muts/Mb vs. 1.92 muts/Mb; p=0.033)。KRAS G12C変異腫瘍はKRAS G12D/F変異腫瘍 (8.32 muts/Mb vs. 0.96 muts/Mb; p=0.004) およびKRAS野生型腫瘍 (8.32 muts/Mb vs. 1.92 muts/Mb; p=0.010) よりも高TMBであった。TP53、RBM10、LRP1B変異腫瘍も野生型よりも高TMBを示した (LRP1B変異: 7.00 muts/Mb vs. 1.92 muts/Mb; いずれもp<0.05)。BRAF V600E変異の2腫瘍では、TMB中央値が17.6 muts/Mbと高値であった。EGFR変異腫瘍におけるTMBの上昇は、TP53/RBM10/LRP1B共変異に起因する部分が大きいが、これらの共変異がない193腫瘍においても、sensitive EGFR変異 (特にL858R) はEGFR野生型よりも高TMBであった (Figure S4)。
PD-L1発現と遺伝子変異の関連: PD-L1解析は75患者157病変で実施された。PD-L1 TPS中央値は0、CPS中央値は1であった。PD-L1 TPS陽性 (≥1%) は患者で6/75例 (8.0%)、病変で6/157 (3.8%) のみと極めて低かった。同一患者で2病変以上がPD-L1 TPS陽性となった例はゼロであった。PD-L1 CPS陽性は患者で53/75例 (70.7%)、病変で83/157 (52.9%) であった。 LRP1B変異腫瘍ではPD-L1 TPS陽性率が有意に高く (28.6% vs. 2.9%; p=0.001)、TP53変異腫瘍でも陽性傾向が認められた (12.5% vs. 3.1%; p=0.079) (Figure 4A)。ERBB2野生型腫瘍ではERBB2変異腫瘍よりもPD-L1 CPS陽性率が高かった (56.6% vs. 28.6%; p=0.046) (Figure 4B)。PD-L1 TPS陽性は、solid腫瘍、浸潤性腺癌、腫瘍径2cm以上、高stage腫瘍で有意に多く認められた (p<0.05)。
免疫細胞浸潤パターンと遺伝子変異の関連: EGFR変異 (特にL858R) 腫瘍は、CD3+ TIL密度が中心腫瘍部 (CT) および浸潤辺縁部 (IM) ともに高かった (p<0.05) (Figure 4C-D)。ERBB2変異腫瘍では、CD3-CT、CD3-IM、CD68-CTが有意に低く、CD8-CT (p=0.061) およびCD8-IM (p=0.058) も低い傾向が認められた (Figure 4E-I)。TP53変異腫瘍はCD3-CT、CD8-CT、CD8-IMが高値を示し (p<0.05) (Figure 4J-L)、RBM10変異腫瘍はCD3-CT、CD3-IMが高値であった (p<0.05) (Figure 4M-N)。MAP2K1変異腫瘍はCD3-CT、CD3-IM、CD163-CTが低値を示した (Figure 4O-Q)。 クラスター解析により分類された3つの免疫タイプ (inflamed: 高浸潤、mixed、deserted: 低浸潤) との関連では、RBM10変異腫瘍でinflamed immunotypeの比率が高く (p=0.024)、ERBB2変異腫瘍でinflamed immunotypeの比率が低かった (p=0.002) (Figure 5B)。Sensitive EGFR変異 (特にL858R) 腫瘍では、RBM10/TP53野生型腫瘍においてもinflamed immunotypeの比率が高い傾向が認められた (p=0.050) (Figure 5C)。
病変間バイオマーカーの不均一性 (heterogeneity): 178腫瘍ペアでTMBの一致率は68.5% (kappa=0.141, p=0.059) であり、有意な不均一性が示された (Figure 6A)。PD-L1 TPS陽性の一致率は94.3% (両方陰性) であったが、kappa値は-0.026と臨床的意義のある一致は認められなかった (Figure 6B)。PD-L1 CPSの一致率は60% (kappa=0.200, p=0.041) であった (Figure 6C)。Bland-Altman解析では、PD-L1 TPSおよびCPSの95% LoA (limits of agreement) は比較的狭く、明らかな不均一性は示されなかった (Figure 6M-N)。 免疫細胞に関しては、CD8+ TILs (CT: kappa=0.235, p=0.016; IM: kappa=0.204, p=0.034) およびCD68-IM (kappa=0.218, p=0.025) は有意な不均一性を示さなかった (kappa≥0.2) (Figure 6F-G, I)。しかし、CD3-CT (kappa=0.124, p=0.201)、CD3-IM (kappa=0.066, p=0.499)、CD68-CT (kappa=0.066, p=0.498)、CD163-CT (kappa=-0.027)、CD163-IM (kappa=0.008, p=0.925) は、いずれもkappa<0.2であり、有意な不均一性を示した (Figure 6D-E, H, J-K)。全体として、TMB、CD3+ TILs、CD68-CT、およびCD163+ TAMsは腫瘍ペア間で有意な不均一性を示したが (すべてkappa<0.2)、PD-L1、CD8+ TILs、およびCD68-IMはそうではなかった。
考察/結論
本研究は、同期性MPLC患者112例294病変という当時最大規模のコホートにおいて、MPLC病変が低TMB (中央値1.92 muts/Mb)、低PD-L1 TPS陽性率 (3.8%)、および不均一な免疫細胞浸潤パターンという、免疫療法感受性に乏しいバイオマーカープロファイルを持つことを初めて実証した。
先行研究との違い: スポラジックNSCLC全体ではTMB中央値が通常5〜10 muts/Mb程度であるのに対し、本研究のMPLCでの1.92 muts/Mbは著明に低い。また、PD-L1 TPS陽性率3.8%は、扁平上皮癌 (約30〜60%) や腺癌 (約20〜30%) と比較して極めて低値である Yu et al. JThoracOncol 2016。これは、MPLCが非喫煙者、女性、早期GGO形態を主体とする腫瘍生物学的特性を反映していると考えられる。スポラジックNSCLCのEGFR変異腫瘍では低TMBが典型的であるが Singal et al. JAMA 2019、本研究ではEGFR L858R変異腫瘍はTP53/RBM10/LRP1B共変異を介してTMBが上昇しており (例: EGFR L858R群のTMB中央値2.88 muts/Mb vs. EGFR野生型1.92 muts/Mb; p=0.003)、スポラジックEGFR変異NSCLCとは異なる共変異パターンが示唆される。
新規性: 本研究で初めて、MPLCにおけるBRAF変異ではclass II変異 (50.00%) が主体でV600E (class I) は6.25%のみであることが示された。これは、単発性肺癌ではV600Eが優勢であるというこれまでの報告 Planchard et al. LancetOncol 2017 とは異なり、V600E標的のBRAF/MEK阻害療法がMPLC患者に奏効する可能性が低いことを示唆する新規の知見である。また、複数の腫瘍ペア間でのTMB (kappa=0.141) やCD3+ TIL (CT kappa=0.124) の不均一性解析を大規模に実施したことは、MPLCにおける単一生検戦略の限界を定量的に示す初めての試みである。77.7%の患者で多クローン起源の変異プロファイルが確認されたことは、MPLCが単一の腫瘍生物学的実体として捉えるべきではなく、複数の独立した原発巣として個別治療アルゴリズムが必要であることを支持する。
臨床応用: 本知見は、MPLCの診断と治療選択に重要な臨床的意義を持つ。特に、低TMBおよび低PD-L1発現は、MPLC患者がICI治療から恩恵を受けにくい可能性を示唆する。しかし、EGFR L858R変異腫瘍、特にRBM10/TP53共変異を伴う場合、高TMBと炎症性免疫タイプに関連することが示されたため、これらの患者群ではICIが有効である可能性があり、さらなる検証が必要である。ERBB2変異腫瘍は低TMBと非炎症性免疫タイプに関連しており、ICIの有効性が低いことが示唆される。また、MPLC患者の半数以上 (54.5%) が少なくとも1つのドライバー遺伝子変異を共有しており、これらの患者はより浸潤性の高い腫瘍を有していたことから、共有ドライバー変異の検出がMPLCの診断と予後予測に役立つ可能性がある。さらに、切除後のEGFR変異陽性MPLC患者における残存GGO病変に対するオシメルチニブなどのEGFR-TKIの有効性も検討されるべきである Wu et al. NEnglJMed 2020。
残された課題と今後の方向性: 本研究は単一施設の後向きコホート研究であり、選択バイアスが存在する可能性があることがlimitationである。また、ICI治療効果との直接的な関連を示したものではないため、PD-L1 TPS陽性率が極めて低い群 (3.8%) やTMBが低い群における実際のICI奏効率を前向き試験で検証することが今後の課題である。TMBの算出に1021遺伝子パネルNGSを用いたが、全エクソームシーケンシング (WES: whole-exome sequencing) に比べて精度が劣る可能性があり、WESを用いたさらなる研究が求められる。免疫細胞浸潤の評価において、免疫組織化学染色で2つの代表的な視野を選択したため、完全な免疫微小環境を反映していない可能性がある。最後に、本研究の患者は3年以内に手術を受けており、無病生存期間 (DFS: disease-free survival) や全生存期間 (OS: overall survival) のデータが利用できなかったため、予後因子を分析できなかった点が残された課題として挙げられる。今後は、MPLCを独立した疾患概念として設計した前向き試験や、バイオマーカーの不均一性を考慮した複数生検プロトコルが求められる。
方法
本研究は、2018年1月から2020年3月までに根治切除を受けた同期性MPLC患者112例（計294病変）を対象とした後向き観察研究である。MPLCの診断はACCPガイドラインに基づき、異なる組織型、異なる分子遺伝学的特性、または同一組織型でも異なる肺葉に位置しN2/N3リンパ節転移や全身転移がないことなどの基準を用いて実施された。本研究は中央南大学湘雅第二病院倫理委員会（No.2021002）の承認を得ており、全ての患者からインフォームドコンセントを得た。
分子解析には、255腫瘍に対して1021遺伝子パネルNGS (Geneplus-Beijing Institute) を用いてゲノム変異プロファイルとTMBを算出した。TMBは、腫瘍組織で検出された体細胞変異および挿入欠失 (InDel: insertions and deletions) の数をメガベースあたりの変異数 (muts/Mb) として定義し、上位25パーセンタイル (>3 muts/Mb) を高TMBとした。DNA抽出はQIAamp DNA FFPE Tissue & Blood Mini Kitを使用し、ライブラリ構築にはKAPA DNA Library Preparation Kitを用いた。シーケンシングはHiSeq3000 Sequencing Systemで実施された。
免疫組織化学 (IHC: immunohistochemistry) 染色により、PD-L1発現および腫瘍浸潤免疫細胞の密度を評価した。PD-L1はDako 22C3抗体を用いて、腫瘍細胞における膜染色陽性率としてTPS (tumor proportion score) を、また腫瘍細胞、リンパ球、マクロファージの陽性細胞総数と腫瘍細胞総数の比率としてCPS (combined positive score) を評価した。PD-L1 TPSの陽性カットオフ値は1%以上、CPSは中央値の1以上とした。CD3、CD8、CD68、CD163に対する多重IHC染色を用いて、中心腫瘍部 (CT: central tumor) および浸潤辺縁部 (IM: invasive margin) における腫瘍浸潤リンパ球 (CD3+、CD8+) および腫瘍関連マクロファージ (CD68+、CD163+) の密度を定量した。免疫細胞密度の定量は、Image Pro Plus V.6.0ソフトウェアを用いて行われた。これらの免疫細胞密度の分布に基づき、クラスター解析により免疫タイプ (inflamed、mixed、deserted) を分類した。
病変間の不均一性 (heterogeneity) の評価には、カテゴリ変数に対してはkappa検定を、連続変数に対してはBland-Altman解析を使用した。3つ以上の腫瘍を有する患者では、全ての腫瘍病変をペアとして不均一性を比較した。統計解析はIBM SPSS Statistics V.22.0を使用し、両側α値が0.05未満を統計的に有意と判断した。