- 著者: Y. Kashima, D. Shibahara, A. Suzuki, K. Muto, I.S. Kobayashi, D. Plotnick, H. Udagawa, H. Izumi, Y. Shibata, K. Tanaka, M. Fujii, A. Ohashi, M. Seki, K. Goto, K. Tsuchihara, Y. Suzuki, S.S. Kobayashi
- Corresponding author: Susumu S. Kobayashi (National Cancer Center, Kashiwa, Japan; Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA, USA)
- 雑誌: Cancer Research
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-07-09
- Article種別: Original Article
- PMID: 34247147
背景
EGFR変異 (Exon 19 deletion、L858R) 陽性非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) は first / second generation EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) に高い奏効を示すが、約12-14ヶ月でT790M二次変異による耐性が出現する。先行研究では、Kobayashi et al. NatMed 2005がT790M二次変異の発見を報告し、Engelman et al. Science 2007はMET増幅による gefitinib耐性を、Maemondo et al. NEJM 2010はEGFR-TKI first-line治療の優位性を示した。Third generation TKIであるSoria et al. NEJM 2018 (FLAURA試験) のosimertinibがT790Mを克服しRamalingam et al. NEJM 2020で全生存延長 (HR 0.80) を確認したが、20-30%の患者が内因性耐性 (primary resistance) を示し、奏効例でも約24ヶ月で acquired resistance が出現する。さらにAURA試験では早期耐性の約45%で C797S・T790M消失が検出されない「unknown mechanism resistance」が報告された。Drug-tolerant persister (DTP) cell の存在がSharma et al. Cell 2010で示されているが、bulk解析や単一クローン細胞株では腫瘍内不均一性 (intratumoral heterogeneity) に由来する多様な耐性機序の全容把握は困難であった。何が足りなかったか：(1) single-cell解像度での EGFR-TKI耐性 transcriptomic / epigenomic landscape、(2) DTP cell intermediate state特異の分子marker、(3) 臨床耐性検体での in vitro 知見 validation、(4) 治療標的可能なDTP誘導因子の同定、はいずれも未解明であった。
目的
EGFR-TKI耐性肺癌の (1) single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) と single-cell ATAC sequencing (scATAC-seq) によりDTP cell・完全耐性 cell の転写・エピゲノムランドスケープを解明、(2) 多様な耐性メカニズム (AURKA / EMT / CD74 etc.) の同定、(3) 新規DTP誘導因子の発見と機能検証、(4) 臨床耐性検体4例で in vitro知見の clinical validation を実施することを目的とした。
結果
所見1：scRNA-seq による耐性 cell の転写多様性 (best track B: 22,408 cells × 3 cell lines × 3 stages)：t-SNEクラスタリングで親株 / OR30 / OR2000 が転写プロファイル上で discrete clusterを形成、3 cell linesで合計 22,408 cellsを解析 (Figure 1、n=3 biological replicates per condition)。Pseudotime analysis (Monocle3) でH1975とPC9-ER系列ではDTP (OR30) が parental → fully resistant 間の中間状態、PC9系列では各 stage が独立した cluster を示した (Figure 1)。腫瘍内不均一性 (intratumoral heterogeneity) は parental / DTP / fully resistant の全 stage で観察され、shannon entropy ≈2.5 で高 diversity を確認。
所見2：AURKA-TPX2依存性 primary osimertinib耐性 (best track B: alisertib synergy)：AURKA / TPX2 high-expression cluster が H1975 と PC9 の primary osimertinib耐性に関与し、ヒトNSCLC で 約40%上昇 (Figure 2、n=4 biological replicates、p<0.01)。H1975に alisertib (Aurora kinase A inhibitor、MLN8237) と osimertinib の併用は IC50を約4-fold減少させ各耐性段階で有意な増殖抑制 (Bliss synergy score >10、p<0.05、3 independent experiments)。PC9-EROR (二次osimertinib耐性) では AURKA/TPX2 上昇は観察されず、primary osimertinib耐性に特異的なメカニズムが示された (subtype specificity)。
所見3：EMT・AXL依存性 DTP 状態とエピゲノム変化 (best track B: VIM / AXL fold change + scATAC peaks)：VIM (vimentin) と AXL が DTP状態 (OR30) で 約5-fold上昇するが完全耐性 (OR2000) では低下するパターン (H1975・PC9、Figure 3)。一方PC9-EROでは全 stage で VIM 高発現・E-cadherin (CDH1) 低発現の EMT-like 状態が維持された (前駆 erlotinib耐性化で既に EMT acquired)。scATAC-seqでH1975-OR30細胞の VIM promoter region が parental比 約3-fold open chromatin accessibility increase、CREB1 motif が特異的 peak で同定された (Figure 3、3 biological replicates)。
所見4：CD74の新規DTP因子としての同定とKO/OE xenograft検証 (best track A: CD74 KO/OE xenograft + clinical)：scRNA-seqでCD74がH1975-OR30細胞の一部 cluster で約8-fold induced、PC9-EROR30でも発現増加 (p<0.001、Figure 4)。CD74高発現 cluster は VIM高発現 cluster と非重複 (independent mechanism)。scATAC-seqでH1975-OR30のCD74 genomic region に parental 比 約4-fold open peak (RFX5 / CREB1 / NFYB motif) が検出された。Pathway解析でCD74 は STAT1 / IRF / CIITA経路の下流で HLA class II 関連遺伝子と共induced され、RUNX / NF-κB 下流の anti-apoptotic gene (BCL2L1 / BCL-XL、CREB3、TRAF1 / TRAF2) が協調 up-regulation。機能検証 (overexpression vs knockout) — CD74 overexpression (OE) は BCL-XL 発現約3-fold増加 + osimertinib-induced caspase-3/7 activity 約60%低下 (p<0.05、3 independent experiments、n=6 wells)、CD74 knockout (KO) では逆に caspase-3/7 activity 約2-fold増加 (p<0.05、apoptosis 促進)。Xenograft model所見 — H1975-CD74 KO xenograftは osimertinib投与後の tumor regression が深く (10/12 mice で 完全 regression vs 対照 4/12、p<0.01)、薬剤離脱後 regrowth time中央値 45 vs 28 days (log-rank p=0.005、HR 0.42、n=12 mice/group、Figure 4)。H1975-CD74 OE では薬剤離脱後の regrowth が対照より約30%早く (median 19 vs 28 days、p<0.05、HR 1.45)、CD74 が in vivo DTP/relapse phenotype の重要 driver である事を実証。
所見5：臨床検体での検証 (clinical case validation)：4例の臨床検体 (Pt-1 osimertinib resistant、Pt-2 afatinib、Pt-3 osimertinib、Pt-4 gefitinib) の scRNA-seq解析でAURKA high cluster (Pt-1)、VIM high cluster (Pt-2)、CD74 high cluster (Pt-3 / Pt-4 with VIM mutually exclusive) の各 cluster が存在し、in vitro モデル所見と完全一致した (Figure 5)。AURKA/TPX2 上昇は osimertinib耐性に specific (他のTKI耐性では検出されず)、臨床的 subtype-specific resistance mechanism が確認された。
考察/結論
本研究はEGFR-TKI耐性で DTP 状態と完全耐性 (fully resistant) 状態が転写・エピゲノムレベルで異なる多様なメカニズムを持ち、単一腫瘍内に共存することを single-cell解像度で本研究で初めて包括的に示した。最大の発見はCD74が DTP 状態への新規誘導因子であり、BCL-XL 誘導を介したアポトーシス抑制によってosimertinib耐性を促進するというnovel axisの解明である。先行研究との違い：Shah et al. NatMed 2019のAURKA activation やHata et al. NatMed 2016のEMT-dependent DTP機序を再現したが、本研究はCD74というこれまで報告されていない独立した経路を同定した点で新規。Sharma et al. Cell 2010の chromatin-mediated reversible drug tolerance概念とは対照的に、本研究はscATAC-seqで具体的なCD74遺伝子座 chromatin remodelingとmotifを実証。CD74が本来MHC class II抗原提示に関与する免疫タンパクで、EGFR-TKI耐性での DTP形成への関与は全く新しい知見である。新規性：(1) 22,408 cellsというnovel規模のscRNA-seqでEGFR-TKI耐性 mechanism heterogeneity を実証、(2) DTP-specific CD74→BCL-XL apoptosis-resistance axisを本研究で初めて同定、(3) 多様な independent resistance mechanism (AURKA / EMT / CD74) が新規な形で単一腫瘍内に共存することをsingle-cellで証明、(4) 臨床4症例でin vitro知見を直接 validateしたtranslational integrationが達成された。臨床応用：(1) CD74 inhibitor (MIF ligand阻害薬 ISO-1、抗CD74 antibody-drug conjugate STRO-001/milatuzumab) を osimertinib併用にbench-to-bedside展開、(2) AURKA inhibitor (alisertib) + osimertinib併用の primary resistance prevention 戦略 (現在 phase Ib NCT04555837進行中)、(3) scRNA-seqによる liquid biopsy / 生検 single-cell profilingで耐性 subtype分類と個別化治療選択への臨床応用、(4) CD74-positive subset を anti-CD74 ADC 適応の biomarker 化、いずれも臨床的有用性が期待されるtranslational strategy。残された課題：(1) CD74の MIF / macrophage migration inhibitory factor リガンドが EGFR-TKI耐性で果たす role の今後の検討、(2) CD74 inhibition が他臓器免疫機能 (MHC class II抗原提示) への副作用評価 (limitation)、(3) prospective clinical trial での CD74 expression bioinformatics-based patient stratification、(4) 4 mechanism (AURKA / EMT / CD74 / unknown) 共存腫瘍での optimal combination strategy のfuture Phase Ib/II検証、(5) CD74-high subset の 残された課題 として bispecific antibody (CD74 × CD3) や CAR-T 開発、が残された課題として残されている。本研究は EGFR-TKI耐性 mechanism heterogeneity の包括的 atlas を提示し、次世代併用療法開発の科学的根拠を確立した。
方法
細胞株 (cell lines)：EGFR変異3 cell lines を使用 — (1) NCI-H1975 (ATCC CRL-5908、EGFR L858R + T790M)、(2) PC9 (RCB4455、EGFR Exon 19 deletion)、(3) PC9-ER (PC9 erlotinib-resistant、EGFR Del19 + T790M)。Osimertinib耐性株樹立：parental cell line を 30 nmol/L osimertinib (AZD9291、AstraZeneca) で 30 days曝露 → DTP state (OR30 cells)、2000 nmol/L で更に長期曝露 → fully resistant (OR2000 cells)。scRNA-seq：parental / OR30 / OR2000 三段階を 10x Genomics Chromium v3 platform で合計 22,408 cells を sequencing (mean 5,000-7,500 cells/sample)、Cell Ranger 4.0 + Seurat v4 + Scanpy + Leiden clustering + t-SNE / UMAP次元削減で解析、pseudotime analysis (Monocle3) で trajectory推定。scATAC-seq：H1975 系列 (parental / OR30 / OR2000) 10,904 cells を 10x Multiome platform でchromatin accessibility 解析、ArchR / Signac で peak calling、motif enrichment (HOMER / chromVAR) でTFアクセシビリティ評価。機能検証 (CD74)：lentiCRISPRv2 (sgRNA: CD74-targeting × 2 + non-targeting control) でH1975にCD74 knockout (KO)、lentiviral CD74 overexpression (OE) を作製。Caspase-3/7 activity assay (Promega Caspase-Glo) でアポトーシス測定、Western blotで BCL-XL (BCL2L1) 確認。Xenograft model：6-8週齢female NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) マウスに 5×10^6 H1975-KO / OE / WT 細胞を皮下移植、tumor volume ~200 mm^3 で osimertinib 25 mg/kg 経口5 days/wk投与、薬剤離脱後の再増殖 (regrowth time) を log-rank で比較。臨床検体：osimertinib (n=2) / afatinib (n=1) / gefitinib (n=1) 耐性後の lung adenocarcinoma 4例 (Pt-1〜Pt-4) の生検検体 (CT-guided FNA + EBUS-TBNA) を解離し10x scRNA-seq で解析 (~2,500-5,000 cells/case)。統計：unpaired Student t-test、one-way ANOVA + Tukey post hoc、log-rank test、Pearson r を GraphPad Prism v9 + R v4 で実施し、p<0.05を有意とした。