- 著者: Li Tang, Yiran Zheng, Mariane Bandeira Melo, Llian Mabardi, Ana P. Castaño, Yu-Qing Xie, Na Li, Sagar B. Kudchodkar, Hing C. Wong, Emily K. Jeng, Marcela V. Maus, Darrell J. Irvine
- Corresponding author: Darrell J. Irvine, PhD (Koch Institute for Integrative Cancer Research, MIT, Cambridge, MA, USA)
- 雑誌: Nature Biotechnology
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-06-25
- Article種別: Original Article
- PMID: 29985479
背景
養子細胞移入療法 (adoptive cell therapy, ACT — TIL 療法、chimeric antigen receptor (CAR) -T 細胞、T cell receptor (TCR) -T 療法を包括) は血液悪性腫瘍において画期的な成果を挙げているが、固形腫瘍への適応拡大は腫瘍微小環境 (tumor microenvironment, TME) による免疫抑制、T 細胞の持続性・機能維持困難、抗原消失等の障壁に阻まれ、議論があり controversial な領域である。
先行研究としては、(i) Maude et al. 2014 (N Engl J Med, n=30) は CD19 CAR-T 細胞療法が B 細胞性白血病に持続的寛解を達成することを示し、(ii) Morgan et al. 2010 (Mol Ther, n=1 case report) は ERBB2 CAR-T による fatal toxicity を報告し on-target off-tumor 問題を提示、(iii) Rosenberg and Restifo 2015 (Science, total review of n>1,000) は ACT による personalized immunotherapy の総説を提供、(iv) Kloss et al. 2013 (Nat Biotechnol) は combinatorial antigen recognition で selective tumor eradication を実現、(v) Chmielewski et al. 2012 (Cancer Res) は tumor-targeted T cells に IL-12 を分泌させる戦略を提示。さらに (vi) Wu et al. 2015 (Science) は small molecule-gated chimeric receptor を、(vii) Johnson et al. 2015 (Sci Transl Med) は EGFRvIII CAR-T を for glioblastoma 開発した。サイトカイン (IL-2、IL-15) 全身投与は T cell 機能を増強するが、血管漏出症候群等の全身毒性により臨床用量が制限されるという制約があった。
しかし、これら先行研究では (a) T cell 表面に物理的にサイトカイン送達する nanoparticle 戦略は未確立、(b) 抗原遭遇 (TCR 活性化) に同期した spatiotemporal release control は controversial で未解決、(c) 全身毒性を回避しつつ tumor 局所での濃度を増幅する戦略は何が足りなかったかが明確に欠落していた。本研究は TCR signal-responsive nanogel という全く novel な platform でこの gap を埋める。
目的
TCR 活性化シグナル応答性の protein nanogel (NG) を T cell 表面に anti-CD45 antibody anchor で搭載する「backpack」送達戦略を開発し、(1) TCR 活性化応答性の disulfide-based release control、(2) tumor 内選択的 T cell expansion、(3) 全身毒性回避による治療域 (therapeutic window) 拡大、(4) マウスおよびヒト CAR-T 療法での有効性、を mouse model + human CAR-T で検証し、固形腫瘍 ACT の novel な platform を確立すること。
結果
TCR シグナル応答性 disulfide 切断による IL-15Sa 放出：抗 CD3/CD28 ビーズまたは peptide-MHC 提示 cells で T cell を刺激すると、cell 表面 redox activity (free thiol 発現) が 約3-5 倍上昇 (p<0.01, n=4 replicates) し、disulfide 結合切断による nanogel からの IL-15Sa 放出が加速。未刺激 T cell 上では nanogel が 7 日以上安定に保持され、抗原特異的 release control が達成された。Apoptosis 誘導では急激な放出は起こらず、死細胞からの意図せぬ薬剤漏出が抑制された (n=3 replicates, Fig 2) 。
In vitro T cell 増殖と effector function：Nanogel 搭載 T cell は抗原刺激後 5 日間で 約100倍に増殖 (p<0.001 vs unloaded T cell control, n=3 replicates) し、対照 T cell (未搭載) と比較して顕著な増殖優位性を示した (Fig 3) 。CD8+ T cell の effector function (IFN-γ 産生、cell-killing activity) も保持・増強され、IFN-γ 産生細胞割合は約2倍に増加 (p<0.01) 。
In vivo tumor 内選択的 expansion (約16倍 selective expansion) ：pmel-1 T cell + nanogel を B16F10 担癌 C57BL/6 mouse (n=8/group) に投与すると、tumor 内 T cell 数は全身 IL-15Sa 同時投与対比 約16倍 に選択的増殖 (p<0.001, two-way ANOVA) 、末梢血・脾臓では T cell 増殖が比較的抑制された。Tumor 局所での TCR 活性化 → nanogel 放出 → 局所的 IL-15Sa 増幅の positive feedback 機構が動作していることを示唆 (Fig 4) 。
治療域の劇的拡大 (約8倍の安全 dose) ：全身投与される IL-15Sa の最大忍容用量 (約30 μg/mouse) を 約8倍 超える dose (約240 μg/mouse) を nanogel 形式で投与しても、体重減少 (<5%, p>0.05 vs PBS control) ・臓器障害 (serum ALT/AST 正常範囲) ・cytokine storm (TNF-α/IL-6 正常範囲) を伴わず安全 (n=8 mice, Fig 5) 。全身循環への遊離 IL-15Sa 漏出が最小化され、炎症性 cytokine storm が回避された。
マウスおよびヒト CAR-T 療法での治療効果増強：B16F10 model で nanogel 搭載 pmel-1 T cell は対照と比較し tumor 増殖抑制 (median tumor volume 50% reduction at day 14, p<0.001) ・生存延長 (median survival 28 → 45 days, HR 0.32, p<0.001, log-rank test) を達成。ヒト CD19 CAR-T cell + Raji 白血病 + NSG mouse model (n=6/group) でも tumor clearance 改善を確認 (60% vs 0% complete response, Fig 6) 。プラットフォームの汎用性と固形腫瘍適応拡大可能性を支持。
考察/結論
本研究は TCR 活性化応答性 nanogel「backpack」という全く novel な ACT 増強戦略を確立した。技術的革新点は、(1) 高密度タンパク質搭載 (dry weight 約92%) による payload 量最大化、(2) disulfide ベースの TCR シグナル応答性 linker による抗原依存的放出、(3) CD45 を介した安定な T cell 表面 anchor、の 3 点にある。生物学的意義として、tumor 内での cytokine 局所作用を抗原遭遇と連動させることで、全身毒性を最小化しつつ治療域を 8 倍以上拡大した点は画期的である。
先行研究との違い・新規な貢献：Chmielewski et al. 2012 の IL-12 secreting CAR-T のような遺伝子改変アプローチとは異なり、本研究は post-translational な protein nanogel 搭載で個体間ばらつきを回避し再現性を高める対照的な戦略を採用した。Wu et al. 2015 の small molecule-gated chimeric receptor のような genetic gate 戦略とも異なり、本研究で初めて TCR 自体の生理的シグナルを release trigger に活用する novel な mechanism を提示。Tumor 内 T cell の 16 倍 selective expansion と治療域 8 倍拡大は、先行 free cytokine 戦略の限界 (全身毒性) を根本的に克服する novel な貢献である。Maude 2014 ・Rosenberg/Restifo 2015 の ACT 総説で課題とされた「ACT-cytokine combination の毒性」を物理化学的に解決した bench-to-bedside translation の典型例。
臨床応用への含意：本技術の臨床応用は (a) 固形腫瘍 CAR-T 療法の persistence/exhaustion 克服、(b) 全身投与困難な IL-12・IFN-γ 等の強力だが毒性の高い cytokine への応用、(c) TIL 療法の IL-2 全身大量投与回避、(d) ICI 併用との bench-to-bedside 統合戦略、にある。NSCLC を含む固形腫瘍領域の ICI 不応例 (Kaira et al. Medicina(Kaunas) 2021 が論じる PS 不良 / PD-L1 低発現 NSCLC) に対し、本 nanogel platform は ACT を組み合わせる治療オプションを拡大する可能性を持つ。Wolchok et al. NEnglJMed 2017 の ICI 併用と異なる軸の immunotherapy enhancement として、相補的 modality となる。さらに Yarchoan et al. NEnglJMed 2017 が pan-cancer で示した TMB-ORR 相関の知見と統合することで、本 nanogel platform は TMB 低値 (神経膠腫・膵がん等) の固形腫瘍へ ACT を bring することで ICI が届かない領域を補完できる可能性も論じうる。
残された課題と limitation：(1) ヒト臨床応用時の Good Manufacturing Practice (GMP) 製造 scalability、(2) TCR シグナルの強度・持続時間と放出速度の詳細制御、(3) ICI 併用時の最適配列 (concurrent vs sequential) 、(4) tumor heterogeneity 下での targeting 維持、(5) anti-CD45 anchor による T cell 機能への長期影響評価、(6) Nanogel 安定性の in vivo half-life の精密制御、(7) 治療応答予測 biomarker (CD45 expression level, TCR avidity) の identification は今後の検討課題、(8) limitation として B16F10 / Raji の同系 mouse model 中心であり、syngeneic model 以外の patient-derived xenograft でのさらなる検証が必要、が残された課題。本技術は Irvine 研究室の「synthetic T cell engineering」パラダイムの代表例であり、ACT の次世代プラットフォームとして臨床開発が進行している (NCT04154098 等の Phase 1 試験で human trial に展開) 。
方法
Nanogel 合成：IL-15 super-agonist (IL-15Sa = IL-15/IL-15Rα-Fc 複合体) を bis-NHS-SS (bis-N-hydroxysuccinimide-sulfonyl disulfide、disulfide 含有架橋剤) で自己架橋し、タンパク質含量 約92% (n=5 batches で重量分析) の高密度 nanogel を合成。粒径は dynamic light scattering で 80-130 nm。anti-CD45 抗体 (CD45 = leukocyte common antigen、internalization rate が低く安定 anchor 候補) を少量組み込み T cell 表面に結合。
Cell line と mouse model：(1) pmel-1 TCR transgenic mouse 由来 CD8+ T cell を磁気選別、ConA + IL-2 で活性化。(2) B16F10 melanoma cell line (C57BL/6 同系) を mouse 皮下植入し B16F10 metastasis model 構築 (n=8 mice/group, ×3 replicate experiments) 。(3) ヒト CD19 CAR-T cell は PBMC 由来 T cell に CD19 CAR lentivirus 導入で生成。(4) NSG (NOD/SCID/IL2Rγ⁻/⁻) mouse に Raji 白血病 cell line を移植し human CAR-T 治療モデルとした。
評価項目：(i) Flow cytometry で T cell 表面 free thiol 量 (Alexa Fluor 647-maleimide で標識) 、(ii) ELISA / fluorescence で nanogel 残存量、(iii) IL-15Sa 放出 kinetics (in vitro stimulation 0-72h) 、(iv) tumor / spleen / lymph node の T cell 計数 (flow cytometry) 、(v) tumor volume・生存・体重・血清 cytokine、(vi) IFN-γ・cell killing assay。
統計手法：Mann-Whitney U test for non-parametric comparisons、Kaplan-Meier 解析 + log-rank test for survival、two-way ANOVA for kinetics curves。p<0.05 を有意とした。
実験 replicate と n 数：各 in vitro 実験は n≥3 independent biological replicates、in vivo は n=6-8 mice/group ×2-3 independent experiments で再現性を確認。