Article data
The spatial transcriptomic landscape of non-small cell lung cancer brain metastasis
- 著者: Qi Zhang, Rober Abdo, Cristiana Iosef, Tomonori Kaneko, Matthew Cecchini, Victor K. Han, Shawn Shun-Cheng Li
- Corresponding author: Qi Zhang (Department of Pathology and Laboratory Medicine, Western University, London, ON, Canada); Shawn Shun-Cheng Li (Department of Biochemistry, Western University, London, ON, Canada)
- 雑誌: Nature Communications
- 発行年: 2022
- Epub日: 2022-10-10
- Article種別: Original Article
- PMID: 36216799
背景
脳転移 (BrMs) は中枢神経系 (CNS) 悪性腫瘍の大部分を占め、肺がんが全脳転移の約50%の原因を担う主要な原発巣であるとBoire et alが報告している。脳転移を有する患者の5年生存率は5%未満と予後不良であり、免疫チェックポイント阻害薬 (ICB) に反応する症例は一部に限られることがGoldberg et alやGadgeel et alの研究で示されている。脳は血液脳関門 (BBB)、独特の免疫環境、神経細胞・グリア細胞との複雑な相互作用、特異な代謝制約といった転移への障壁を有し、がん細胞がこの微小環境に順応するためには腫瘍細胞側・脳側双方に大規模なリモデリングが必要であると考えられている。
従来の研究は原発腫瘍または脳転移のいずれかを対象としたバルク解析が中心であり、ペア解析および腫瘍コア・腫瘍免疫微小環境 (TIME) ・腫瘍脳微小環境 (TBME) を区別した空間解析は極めて不足していた。この知識のギャップは、脳転移の分子・細胞基盤の理解を妨げ、予後バイオマーカーや治療標的の特定を困難にしている。例えば、単一細胞RNAシーケンス解析では、転移性肺腺癌の腫瘍細胞と腫瘍微小環境 (TME) が広範な分子・細胞レベルの再プログラミングを受け、腫瘍促進的かつ免疫抑制的な環境を形成することがKim et alによって示されているが、空間的な文脈での詳細な理解は未解明な点が多かった。また、異なる転移癌における脳転移ニッチの多層的な解析は行われているものの、非小細胞肺癌 (NSCLC) 脳転移に特化した空間トランスクリプトーム解析は不足していた。
本研究はNanoString GeoMxデジタル空間プロファイリング (DSP) プラットフォームを用いて、NSCLC原発・脳転移のTMEを空間解像度付きで初めて網羅的に解析し、脳転移におけるTMEの再構築メカニズム、特に線維化と免疫抑制の空間的・機能的特性を詳細に解明することを目的とした。これにより、脳転移の予後予測バイオマーカーの特定と、線維化および免疫状態に応じた個別化治療戦略の提案に繋がる知見を提供することを目指した。
目的
本研究の目的は、NSCLC における脳転移の成立機序を解明するため、原発肺癌・転移リンパ節・脳転移腫瘍コア・腫瘍免疫微小環境 (TIME-L: lung TIME, TIME-B: brain TIME) ・腫瘍脳微小環境 (TBME) ・正常脳組織 (BC: brain control) を空間トランスクリプトーム解析によりプロファイルし、腫瘍コアおよび TME 各区画の細胞構成と機能的遺伝子シグネチャの変化を同定することである。特に、線維化と免疫抑制のメカニズムを明らかにし、脳転移微小環境が単なる腫瘍侵襲の結果ではなく、免疫抑制的かつ線維原性の活性化ニッチとして再構築されていることを実証することを目指す。さらに、線維化状態に応じた異なる免疫抑制機構を同定し、治療戦略の個別化に向けた分子基盤を提供することを目的とする。加えて、脳転移の予測バイオマーカーおよび患者予後の予測バイオマーカーを同定し、臨床的な層別化と治療選択に資する知見を得ることも重要な目的である。本研究により、脳転移微小環境における免疫抑制と線維化が相互に関連する機構を解明し、線維化状態に基づいた個別化治療戦略の必要性を示唆することを期待する。
具体的には、以下の点を明らかにすることを目的とした。
- 原発肺癌と脳転移におけるTMEの細胞構成と機能的遺伝子発現プロファイルの空間的差異を特定すること。
- 脳転移微小環境 (TBME) における線維化の程度と、それに伴う遺伝子発現および免疫細胞浸潤の変化を詳細に解析すること。
- 脳転移におけるミクログリア・マクロファージ軸およびアストロサイト・神経細胞の再プログラミングの様態を解明すること。
- 脳転移の予後予測バイオマーカー候補を同定し、線維化および免疫状態に応じた治療標的を提案すること。
結果
空間的細胞構成の解離: PCA (Principal Component Analysis) とUMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) 解析の結果、LBとLの腫瘍コア群はmLNとともに明確なクラスターを形成し、TIME-L (原発肺癌腫瘍免疫微小環境) /TIME-B (脳転移腫瘍免疫微小環境) はTME群として別のクラスターを形成した (Fig. 1d, e)。TBME (腫瘍脳微小環境) は分散した分布を示し、一部はBCクラスターに隣接し、一部はTIME-L/TIME-Bクラスターに混入しており、患者間の不均一性が顕著であることが示唆された。SpatialDeconおよびMCP-counterによる細胞組成推定では、TIME-Lに比べTIME-BではT細胞、B細胞、形質細胞、細胞傷害性リンパ球が有意に減少し、TBMEでは好中球が有意に増加した (Fig. 2c, d)。活性化T細胞および休止T細胞はいずれもTIME-B/TBMEでTIME-Lより抑制されており、脳転移環境における適応免疫応答の全体的な抑制が示唆された。例えば、TIME-LではCD8+ T細胞のMCP-counterスコアがTIME-Bと比較して有意に高かった (p<0.001)。
機能的遺伝子シグネチャとpEMT: Fges (functional gene expression signatures) 解析では、TME (TIME-L/B, TBME) は原発/転移コア (L, LB) よりリンパ系、骨髄系、MDSC (myeloid-derived suppressive cells)、pro-tumor cytokine、CAF (cancer-associated fibroblasts)、ECM (extracellular matrix)、血管系シグネチャが濃縮される一方、腫瘍増殖関連遺伝子はLBでLより低下した (Fig. 3a)。pEMTシグネチャ (LAMC1/2, LAMA3, ITGA2/B1/AV, CXCL8, CXCL1) は腫瘍コアで高発現し、NSCLC脳転移と強く関連することが示された (Fig. 3b)。B細胞およびMHC-I/II関連遺伝子はTIME-LがTIME-B/TBMEより高発現しており、脳転移環境での抗原提示機能およびB細胞応答の機能低下が示唆された (Supplementary Fig. 3a)。これは、脳転移における適応免疫応答の機能不全を示唆する。
TBMEの線維化と遺伝子発現変化: TBMEとBC間で251個のDEG (差次発現遺伝子) が同定され (Log2FC > 1.5または< -1.5, FDR<0.01)、脳機能関連遺伝子が下方制御され、コラーゲン、フィブロネクチン、ビメンチンなどの線維化関連遺伝子が上方制御されていた (Fig. 4a)。Masson trichrome染色では、19 ROI中11が線維化陽性 (F+) であり、F(h) (高度線維化) 6例、F(l) (中等度線維化) 5例、F(-) (無線維化) 8例に層別された (Fig. 4c)。F(h)群ではTGFB1 (p=0.0095)、COL1A1、COL3A1、MMP2 (p=0.0022)、TIMP-1、MRC1、PDGFRB、IL4I1、IL-6R/STAT3、CXCL12/CXCR4が有意に上昇し (Fig. 4d, e)、GSEAではTGFβ、EMT、angiogenesis、hypoxiaシグネチャが濃縮された (Supplementary Fig. 4c)。逆にF(h)ではCXCL9/CXCL10/CXCL11、CCR5、GZMB/GZMA/IFNG/IL2が低下し、有効T細胞およびB細胞の浸潤低下が示された (Supplementary Fig. 4f, 5a)。これは、線維化の程度が高いTBMEにおいて免疫抑制が強く働くことを裏付ける。
線維化状態に依存しない免疫抑制: TBMEはBCに比べ、T細胞活性化・抑制、抗原提示、IDO/IDO2/TDO、貪食 (SIRPα) 関連遺伝子群が総体的に上昇しており、免疫調節環境に再プログラムされていることが示された (Fig. 4f)。F(h)群はMHC-I/II高発現でCD8+ T細胞浸潤が低く、M2型マクロファージ (CD163, TGFB1) が優勢であった (Supplementary Fig. 5c)。一方、F(-)群ではT細胞抑制因子 (PDCD1LG2/PD-L2, BTLA, VTCN1, IDO1) やTNFRファミリー、SIRPαが増加しており、T細胞疲弊と貪食能の低下による免疫抑制が示唆された (Fig. 4g, h)。これらの結果は、TBMEが線維化状態によらず、適応免疫と自然免疫の両方が抑制されていることを示している。例えば、F(-) TBMEではPDCD1LG2の発現がF(h) TBMEと比較して有意に高かった (p<0.01)。
ミクログリア–マクロファージ軸の再構成: F(-)群ではM1マーカー (TNF, IL1B, CXCL10) が優位であり、F(h)群ではM2マーカー (CD163, TGFB1, SPI1) が優位であった (Fig. 5a, b)。TBMEではミクログリア特異的マーカー (TMEM119, P2RY12, CX3CR1) がF(h)群で低下し、貪食・抗原提示系遺伝子 (CD68, ITGB2, AIF1) が上昇していた (Fig. 5d, e)。これは、ミクログリアが未熟な炎症性フェノタイプを獲得し、一部の常在性ミクログリアが浸潤性単球由来マクロファージ (MDM) に置換された可能性を示唆している。BrM関連骨髄系細胞のシグネチャはF(h)群で強く濃縮されていた (Supplementary Fig. 6b)。F(h)群ではCD163の平均発現レベルがF(-)群と比較して約2.5-fold高かった。
アストロサイトと神経細胞のリプログラミング: F(h) TBMEでは成熟アストロサイトマーカー (SLC1A2, ALDOC, GABRA2, NTSR2, RYR3, GFAP) が顕著に低下し、「未熟」化が示唆された (Fig. 6b, c)。一方、反応性アストロサイトマーカーはTBME全体でBCより上昇しており、OSMR、STAT3 (IL-6-gp130/OSMR-JAK-STAT3経路)、THBS-1が有意に上昇し、炎症、組織修復、シナプス可塑性への関与が示唆された (Fig. 6d, e)。神経細胞機能関連遺伝子もTBMEでBCに比べ下方制御されており、脳転移微小環境における神経機能の広範な障害が示された (Supplementary Fig. 6c, d)。例えば、F(h) TBMEではOSMRの発現がBCと比較して約3.0-fold高かった (p=0.0003)。
予後予測バイオマーカー: 転移速度が速い群 (<10ヶ月, n=10 patients) と遅い群 (>30ヶ月, n=10 patients) の原発肺癌 (L) ROI間で、5つの遺伝子が増加し、15の遺伝子が減少していた (Fig. 8a)。これらのうち7つの遺伝子 (例: SLC2A1, ADGRB1, NDRG1) は、本コホート (n=30 patients) およびTCGA LUADコホート (n=501 patients) において個別に患者の生存を予測した (ログランクp<0.05)。多変量Cox回帰分析により、5つの転移関連遺伝子からなる共変量モデルが構築され、特定の遺伝子発現パターンが不良な患者生存と有意に相関した (G-test p<0.0001)。脳TME (TBME + TIME-B) ネットワークのDEGsを用いた解析では、TIMP-1単独またはCTSBとの組み合わせでの発現低下が患者生存と負に相関した (Fig. 8e)。
考察/結論
本研究はNSCLC 44例のペア組織を用いた初の空間トランスクリプトームマップであり、脳転移微小環境が単なる腫瘍侵襲の結果ではなく、免疫抑制性かつ線維原性の活性化ニッチとして再構築されていることを明確に示した。特に、線維化が進んだTBME (F(h)) ではM2マクロファージとCAF優位でCD8+ T細胞浸潤が低下し、無線維化TBME (F(-)) ではT細胞疲弊と貪食チェックポイント (SIRPα) 優位の異なる免疫回避機序が働くという二項対立的な分類を提示した点が独創的であり、TBMEの線維化状態に応じた治療層別化 (STAT3/TGFβ/CXCL12-CXCR4/IL4I1/IDO/PD-L2標的) の必要性を示唆する。これは、これまで一律に扱われてきた脳転移のTMEが、線維化の程度によって異なる免疫抑制メカニズムを持つという新規の知見である。
先行研究との違い: 先行研究で示されてきた反応性アストロサイト、MAM (metastasis-associated macrophages)、cathepsin Sなどの個別知見を統合し、ミクログリアの未熟化・M2マクロファージ・反応性アストロサイト・CAFが協調してpro-tumor nicheを形成する描像を初めて空間解像度で示したことは意義が大きい。また、pEMTプログラム (LAMs・integrin・CXCL8/1) の腫瘍コア選択的発現はNSCLC脳転移の分子指紋となり得る。本研究の結果は、脳転移におけるTMEのリモデリングが、原発腫瘍のTMEにおける腫瘍免疫相互作用のメカニズムと共通の機能モジュールを持つことを示唆しており、これはKim et alの報告とも一致する。しかし、脳TMEでは神経機能の低下と免疫応答の抑制が顕著である点が原発腫瘍TMEと対照的であった。
新規性: 本研究で初めて、脳転移微小環境における線維化の程度が免疫抑制のメカニズムに影響を与えるという新規の知見を同定した。特に、高度線維化TBMEではM2マクロファージが優勢であり、無線維化TBMEではT細胞疲弊と貪食能の低下が免疫抑制に寄与するという異なるメカニズムが働くことを示した。
臨床応用: 臨床応用として、線維化状態と免疫状態に基づく層別化ICB療法、STAT3/IL-6R阻害剤、TGFβ阻害、抗CD47/SIRPα、IDO阻害剤の組み合わせが考えられる。例えば、線維化が高度なBrMsに対しては、TGFβ、PDGFR、TIMP-1などの線維化調節因子を標的とする治療がM1/M2 TAM調節因子と併用してより効果的である可能性がある。一方、無線維化TBMEに対しては、PD-1/PD-L1/L2、BTLA、CD160などの複数の免疫チェックポイントを共阻害する併用免疫療法が、単一のPD-1/PD-L1阻害療法よりも大きな成功を収める可能性がある。さらに、本研究で同定された転移シグネチャ遺伝子 (例: SLC2A1, ADGRB1, NDRG1) は、患者の予後予測バイオマーカーとして臨床現場での層別化治療に貢献する可能性がある。
残された課題: 残された課題は、比較的少ないサンプルサイズ (n=44 patients) と不完全なゲノム情報である。ほとんどの原発腫瘍サンプルが15年以上前に採取されたものであり、全身療法オプションが当時と現在で大きく変化しているため、生存解析は仮説生成にとどまる。今後の検討課題として、サンプルサイズの拡大、scRNA-seq/空間プロテオミクスによる細胞系譜トラッキング、TIME-B/TBME各コンポーネント操作による因果的検証、および既存ICB/化学療法への応答予測バイオマーカーとしての前向き検証が挙げられる。また、放射線画像と病理学的解析の相関を可能にすることで、本知見の臨床的意義をさらに高めることができるだろう。
方法
本研究はWestern University Health Science Research Ethics Board (HSREB 111911) の承認を得て実施された。NSCLC患者44例（主に腺癌）のホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織サンプル（原発肺癌、脳転移、転移リンパ節）をLondon Health Sciences Centreから提供された。非腫瘍性脳組織7例を対照 (BC) として含めた。各患者から原発肺癌 (L)、転移リンパ節 (mLN, 利用可能な場合)、脳転移 (LB)、腫瘍辺縁脳組織 (TBME) を含む組織マイクロアレイ (TMA) を構築した。腫瘍の不均一性を評価するため、各腫瘍および腫瘍辺縁脳組織から3つの空間的に異なる領域を採取した。
TMAスライドはGeoMx® DSP (Digital Spatial Profiler) スライド調製ユーザーマニュアルに従い処理された。脱パラフィン後、プロテイナーゼKでタンパク質を消化し、WTA (Whole Transcriptome Atlas) プローブミックスと一晩インキュベートした。その後、GFAP (Invitrogen, 53-9892-82)、CD45 (Biolegend, 121302310)、PanCK (Novus, NBP2-33200AF647)、およびSyto83 (ThermoFisher, S11364) で免疫蛍光染色を行った。病理医によるH&E染色および免疫蛍光染色パターンに基づき、119の関心領域 (ROI, 平均0.2 mm²) を選定し、GeoMx DSP全トランスクリプトーム (18,694遺伝子) を取得した。RNAシーケンスデータは第3四分位 (Q3) 正規化後に品質検証され、0.75分位スケールデータが解析に用いられた。
細胞組成の推定には、SpatialDecon、Qlucore Omics Explorer、MCP-counterの3つのアルゴリズムを用いた。SpatialDeconは空間分解能を持つ単一細胞RNAシーケンスデータで学習されたRコードを使用し、Human Cell Atlas成人肺10Xデータセット由来の細胞プロファイルマトリックスを用いて細胞混合比を推定した。MCP-counterは8種類の主要免疫細胞型、内皮細胞、線維芽細胞の絶対存在量を推定した。機能的特性の解析には、知識ベースの機能的遺伝子発現シグネチャ (Fges) とpEMT (partial epithelial-to-mesenchymal transition) シグネチャを用いた。
TBMEはMasson trichrome染色により、線維化の程度に応じてF(h) (高度線維化)、F(l) (中等度線維化)、F(-) (無線維化) の3群に層別化された。各群間およびTBMEとBC間で、Log2FC > 1.5または< -1.5、FDR < 0.01/0.05を閾値として差次発現遺伝子 (DEG) を同定した。遺伝子セット濃縮解析 (GSEA) を用いて、GOterm、Hallmark、Reactome遺伝子セットを評価し、TGFβ、EMT、angiogenesis、hypoxiaシグネチャの濃縮を解析した。M1/M2マクロファージマーカー、ミクログリア特異的マーカー、反応性アストロサイト・成熟アストロサイト遺伝子、T細胞制御・抗原提示・IDO/TDO代謝チェックポイント・SIRPαなどの免疫制御遺伝子の発現を比較解析した。統計解析はQlucore Omics Explorer 3.8.2およびGraphPad 9.3.1を用いて行われ、Studentのt検定、Mann-Whitney U検定、Kruskal-Wallis検定、ログランク検定、Cox比例ハザード回帰分析が適用された。多重検定補正にはBenjamini-Hochberg法を用いた。