- 著者: Guangjian Fan, Juan Jin, Jie Wang, Jingxuan Xu, Weiyu Ge, Suling Liu, Lei Tang, Reziya Wumaier, et al., Hongxia Wang
- Corresponding author: Yiqun Cao, Zhonghua Tao, Wenting Liu, Hongxia Wang (Fudan University Shanghai Cancer Center / Shanghai Jiao Tong University)
- 雑誌: Cancer Cell
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-05-07
- Article種別: Original Article
- PMID: 42102811
背景
がん幹細胞 (CSC: cancer stem cells) は、自己複製能と治療抵抗性を持つ細胞亜集団であり、強力な免疫回避特性を有することが知られている (Miao et al., 2019)。しかし、CSCが腫瘍免疫細胞の動態を空間的に再プログラムし、腫瘍促進的なニッチを確立する分子回路については、依然として重要な知識の空白が残されていた (Angelova et al., 2018)。三重陰性乳がん (TNBC: triple-negative breast cancer) は、エストロゲン受容体 (ER)、プロゲステロン受容体 (PR)、HER2の発現を欠く最も侵攻性の高い乳がんサブタイプであり、限られた治療選択肢と不良な臨床転帰を特徴とする (Cazet et al., 2018)。PD-1/PD-L1軸を標的とした免疫チェックポイント阻害剤 (ICI) はTNBCに承認されているが、一次・二次耐性が主要な臨床的障壁となっている (Sharma et al., 2017)。TNBCは他の分子サブタイプと比較してCSCの富化が著しく、腫瘍の不均一性、転移播種、免疫回避を駆動するベーサルライク特性を示すことから、CSCと腫瘍微小環境 (TME: tumor microenvironment) の双方向性クロストークを研究する上で理想的なモデルであると考えられていた (Prager et al., 2019)。
細胞外小胞 (EV: extracellular vesicles) は、全ての細胞から放出されるナノスケールの脂質二重層小胞であり、細胞間クロストークの重要なメディエーターとして注目されている (van Niel et al., 2018)。EVは、前転移ニッチ形成、血液脳関門破壊、血管新生、免疫調節、治療抵抗性など、TME内の病理学的プロセスを調節する上で極めて重要な役割を果たす (Dong et al., 2023; Khalyfa et al., 2019; Cao et al., 2019; Szajnik et al., 2010; Lee et al., 2023)。EVを介した免疫抑制には、CD73陽性EVによって駆動される古典的なアデノシン経路など、複数の機序が関与することが報告されている (Whiteside et al., 225; Ohta and Sitkovsky, 2014)。しかし、EVはその細胞起源に基づいて著しい不均一性を示し、CSC由来EVがTNBCの進行、微小環境のリモデリング、治療抵抗性をどのように調節するかについては、これまで十分に解明されていなかった。この領域には重要な知識のギャップが残されている。
Tetraspanin-8 (TSPAN8) は、複数の悪性腫瘍で発現が上昇するテトラスパニンスーパーファミリーのメンバーであり、CSCの機能マーカーとして機能することが知られている (Wang et al., 2013; Zhu et al., 2019)。EVは主に内容物のエンドサイトーシスによる受容細胞への移送を通じて機能すると理解されてきたが (Kalluri, 2016; Valadi et al., 2007)、近年ではEV表面上のバイオアクティブ分子を介した細胞運命や行動への影響も示されつつあった (Chen et al., 2018; Muller et al., 2017)。本研究では、CSCが制御性T細胞 (Treg: regulatory T cell) を誘導する分子回路の解明において、EVを介した細胞間コミュニケーションが果たす役割、特にEV表面分子の重要性に焦点を当てた。CSCがTregの分化と増殖を促進する具体的な分子メカニズムについては、依然として未解明な点が多かった。
目的
本研究は、TNBC組織の高次元単細胞サーフェソームプロファイリングを用いてCSCとTMEの免疫抑制ニッチとの関連を解析し、CSC由来EVを介したTreg誘導の分子機序を同定すること、およびその機序がカノニカルなEV内容物の取り込みに依存しないことを示すことを目的とした。特に、EV表面のTSPAN8がT細胞上のCD103と結合し、LKB1-AMPK-FOXP3経路を活性化することで、CD103+FOXP3+Tregの分化・増殖を促進する非カノニカルなメカニズムを明らかにすることを主要な目的とした。さらに、EV表面のTSPAN8を標的とする抗体 (T8-Ab) が、抗PD-1療法と併用することで前臨床モデルにおいて相乗的な抗腫瘍効果を示すかを検証し、特にTSPAN8陽性CSCが高発現するTNBCサブタイプにおいて、CSCとTMEの免疫抑制を同時に標的とする新たな治療戦略の可能性を評価することを目的とした。
結果
CSC近傍におけるTreg富化と免疫抑制: 高次元単細胞プロテオミクス解析により、CSCHi腫瘍では免疫抑制性CD4+CD25+CD127-Tregが顕著に富化され、CD8+T細胞の浸潤が減少することが示された (Figure 1C)。特に組織常在性CD103 (integrin αEβ7)+FOXP3+Treg亜集団がCSCHi腫瘍で有意に増加した。241例のTNBC検体を用いた空間解析では、TSPAN8HiとTSPAN8Lo腫瘍の比較で、CD4+FOXP3+TregがCSCの100 μm半径内に有意に多く存在することが確認された (Figure 1G)。in vivoでは、TS+CSCを移植したBALB/cマウス (n=5 mice) がTS-群と比較してFoxp3+およびFoxp3+CD103+Tregの増加とCD8+T細胞の減少、加速した腫瘍増殖と肺転移増加を示した (Figure 1I-1L)。TS+CSC移植群では、腫瘍体積が有意に増加し (p<0.01)、肺転移巣の数もTS-群と比較して約3倍に増加した (Figure 1N, 1O)。これらの結果は、CSCがTMEにおいてTregの蓄積と免疫抑制を促進し、腫瘍の増殖と転移を助長することを示唆している。
CSC由来EVによるCD4+Treg富化の誘導: TSPAN8+CSCの条件培地 (CM-TS+) がCD4+FOXP3+Tregを増加させ、CD8+T細胞を減少させた (Figure 2B-2E)。EVと残存液 (EV除去対照) の比較により、EVがこの効果の主要因であることが示された。3種のEV単離法 (dUC, MSP, SEC) で得られたEVs-TS+はいずれもTregを増加させ、TGFβ、GZMB、CXCR3、IL-10、CTLA-4の産生増加と、IL-2、IFNγの分泌抑制を誘導した (Figure 3I, 3J)。TSPAN8ノックダウンEV (EVs-TS+[kd]) はこれらの効果を有さなかった。EVs-TS+処理により、ナイーブCD4+T細胞からFOXP3+Tregへの分化が有意に増加し (p<0.01)、CD4+CD25+T細胞の割合も増加した (Figure 3B-3D)。また、EVs-TS+はiTregの増殖を促進したが、アポトーシスには影響しなかった (Figure 3E-3H)。これらのin vitro実験は、n=3 independent experimentsで実施された。
TSPAN8がEV内容物ではなく膜面に存在することが決定的: 質量分析およびRNA-seqによるEVプロテオーム・トランスクリプトーム解析では、EVs-TS+とEVs-TS+(kd)の差異はTSPAN8の発現量のみであり、TGFβやCTLA-4などのTreg誘導に重要な分子は差を認めなかった (Figure S4A, S4B)。PKH26標識実験では、EVs-TS+がEVs-TS+(kd)より高い蛍光強度でT細胞に会合した (Figure 4B, 4C)。TSPAN8の大細胞外ループ (LEL: large extracellular loop) に対するモノクローナル抗体 (T8-Ab) はFOXP3+Treg頻度の上昇を打ち消し、TSPAN8-LEL組み換えポリペプチド (TS-LEL RP) はEVs-TS+(kd)上でTreg分化を増強した (Figure 4E)。さらに、TSPAN8を膜に組み込んだ模倣リポソーム (Lipo-TS+) が同様の効果を再現した (Figure 4H, 4I)。これらの結果から、EVに内包された他の内容物ではなく、EV膜上のTSPAN8がTreg誘導に決定的な役割を果たすことが証明された。
CD103がTSPAN8の高親和性受容体として機能: 質量分析による免疫沈降解析から、T細胞上でTSPAN8と相互作用する候補膜タンパク質としてCD103、CTLA4、OX40、GITRが同定された (Figure 5A)。GST pulldownではHis-CD103のみがGST-TSPAN8と効果的に相互作用した (Figure 5D)。Colabdockによる分子ドッキング解析で、TSPAN8のaa 188-204 (LEL内) とCD103のaa 1112-1121が結合領域として同定された (Figure 5J, 5K)。shRNAによるCD103ノックダウンはLipo-TS+誘導のFOXP3上昇とTreg分化を消失させた (Figure 5F)。TSPAN8の188-204欠失はCD103との結合を失い、CD103の1112-1121欠失はTSPAN8によるFOXP3上昇を阻害した (Figure 5L-5N)。これらの結果は、CD103がT細胞上のTSPAN8特異的受容体として機能し、この直接的な膜面相互作用がTregの分化を媒介することを示している。
TSPAN8-CD103相互作用によるLKB1/AMPKシグナル軸の活性化: RNA-seq解析ではEVs-TS+処置T細胞でAMPKシグナルの有意な富化が認められた (Figure 6C, 6D)。Lipo-TS+またはEVs-TS+処置によりLKB1のSer428リン酸化とAMPKのThr172リン酸化が増加した一方、CD103枯渇はLKB1・AMPK活性化を消失させた (Figure 6E, 6F)。LKB1 S428A変異はFOXP3上昇を阻害し、活性型模倣変異S428DはFOXP3発現をさらに促進した (Figure 6G)。Lipo-TS+の濃度依存的増加に伴いLKB1-STRAD-MO25複合体の形成が増加し、CD103ノックダウンはこの複合体形成を阻止した (Figure 6H, 6I)。MAP4K4がLKB1のSer428をリン酸化するキナーゼとして同定され、MAP4K4阻害剤 (MAP4K4-IN) のみがLipo-TS+誘導のLKB1 Ser428リン酸化を阻害した (Figure 6K)。これらのデータは、TSPAN8-CD103相互作用がMAP4K4を介してLKB1/AMPK経路を活性化し、FOXP3の発現を誘導する非カノニカルなシグナル伝達経路を確立することを示している。
CD103+FOXP3+Tregが独自の免疫抑制サブセットとして腫瘍進行を駆動: 703例の乳がん組織でmIHCを実施し、CD103+TILs (tumor-infiltrating lymphocytes) をCD103+FOXP3+TregとCD103+FOXP3-T細胞に分類した (Figure 7A)。CD103+FOXP3+TregはTNBCで有意に富化されており (Figure 7B)、TNBC患者 (n=241) の解析でCD103+FOXP3+Tregの増加はOS・DFS不良と関連し (HR 2.15, 95% CI 1.48-3.13, p<0.001)、CD103+FOXP3-T細胞は良好な転帰と関連した (Figure 7C, 7D)。多変量解析でCD103+FOXP3+TregはTNBCの独立予後因子として確認された (Table S6)。また、FOXP3がCD103プロモーターに結合してCD103発現をトランス活性化するというフィードバックループが存在し、Tregの腫瘍組織への保持を促進することが示された (Figure S7K-S7O)。
EVs-TSPAN8+の臨床的関連性: 80例のTNBC患者の血漿EVは60例の健常対照と比較してTSPAN8が有意に増加し (p<0.001)、進行ステージおよび短い生存期間と正の相関を示した (Figure 7E-7G)。ネオアジュバント免疫療法を受けた28例のTNBC患者のコホートでは、TSPAN8/CD44高発現腫瘍はCD103+FOXP3+Tregの富化と関連し、治療応答率の低下 (pCR率14% vs 51%, p<0.01) と有意に関連していた (Figure 8M-8P)。
TSPAN8と免疫チェックポイントの複合標的化: PY8119 TNBCモデルおよび4T1モデルでの抗TSPAN8抗体 (T8-Ab) と抗PD-1抗体の組み合わせは、抗PD-1単剤と比較して顕著な相乗的抗腫瘍活性を示し、腫瘍縮小・肺転移減少を達成した (Figure 8C-8F)。併用療法群では、腫瘍体積が単剤療法群と比較して約50%減少し、肺転移巣の数も有意に減少した (p<0.01)。フローサイトメトリーとmIHC解析で、併用療法群ではCD8+細胞傷害性T細胞の割合が有意に増加し、免疫抑制性CD103+Foxp3+Tregが有意に減少した (Figure 8G-8J)。T8-Ab単独でもCSCおよびTregの頻度を減少させ、LKB1/AMPK経路の活性化を抑制し、mTOR経路を活性化することが示された (Figure S9A, S9B)。これらの結果は、TSPAN8を標的とすることが、免疫チェックポイント阻害剤に対する耐性を克服し、抗腫瘍免疫を強化する有効な戦略であることを示唆している。
考察/結論
新規性: 本研究は、TNBCのがん幹細胞 (CSC) が産生するTSPAN8陽性細胞外小胞 (EV) が、T細胞上のCD103と膜面で直接相互作用し、MAP4K4を介したLKB1-AMPK-FOXP3経路を活性化することで、免疫抑制性CD103+FOXP3+制御性T細胞 (Treg) の分化・増殖を促進し、免疫回避を誘導する非カノニカルなメカニズムを初めて解明した。これは、EVが主に内容物のエンドサイトーシスを通じて機能するというこれまでの理解 (Kalluri, 2016) とは異なり、EV表面の分子が直接受容体と結合してシグナルを伝達するという新規のパラダイムを提示するものである。
先行研究との違い: これまで、腫瘍細胞がTGFβやCTLA-4などの分泌因子やEV内包分子を介してTregを誘導することが報告されていた (Mondal et al., 2023)。しかし、本研究のプロテオームおよびRNAシーケンス解析では、TSPAN8陽性EVとTSPAN8ノックダウンEVの間でTGFβやCTLA-4レベルに有意な差は認められず、TSPAN8-CD103シグナル軸がこれらの代替免疫抑制分子とは独立してTreg誘導を媒介することを示した。また、PD-1/PD-L1軸が免疫抑制に寄与することは広く認識されているが、本研究のEVs-TS+による免疫抑制はPD-1/PD-L1軸とは独立したメカニズムであることが示唆された点で、これまでの知見と対照的である。
臨床応用: 本研究の知見は、特にTSPAN8+CSCが高発現するTNBCサブタイプにおいて、CSCとTMEの免疫抑制を同時に標的とする新たな治療戦略の臨床応用可能性を示唆する。TSPAN8を標的とする抗体は、抗PD-1療法と併用することで前臨床モデルにおいて相乗的な抗腫瘍効果を示し、Tregの減少と細胞傷害性T細胞の増加を誘導した。血漿EV中のTSPAN8レベルがTNBC患者の予後不良と相関すること (p<0.001)、およびTSPAN8/CD44高発現腫瘍が免疫療法抵抗性 (pCR率14% vs 51%) と関連することは、TSPAN8が臨床的バイオマーカーおよび治療標的として有用であることを強く示唆している。これらの結果は、bench-to-bedsideの橋渡し研究として重要な意義を持つ。
残された課題: 今後の検討課題として、TSPAN8-CD103相互作用がLKB1-AMPK経路を活性化する詳細な分子メカニズム、特にMAP4K4がどのようにリクルートされ、LKB1をリン酸化するのかについて、さらなる構造生物学的および生化学的解析が必要である。また、本研究は前臨床モデルでの有効性を示したが、ヒトTNBC患者を対象とした臨床試験において、抗TSPAN8抗体と免疫チェックポイント阻害剤の併用療法の安全性と有効性を検証することが重要である。さらに、TSPAN8高発現TNBCサブタイプを特定するための診断ツールの開発も今後の課題である。
方法
患者コホートおよび単細胞解析: 65例の治療未施行TNBC患者から採取した161検体を対象に、BD FACSymphony (スペクトル型フローサイトメーター) を用いて50種類のTME関連タンパク質を同時測定する高次元単細胞プロテオミクスマッピングを実施した。この抗体パネルには、主要リネージマーカー、免疫チェックポイント分子、およびCSCマーカー (TSPAN8、CD44、CD24) が含まれる。CSCHi群とCSCLo群は、CD45-FAP-CD24-集団におけるTSPAN8/CD44共発現閾値の中央値で分類した (Figure 1A)。
空間解析: 241例の治療未施行TNBC検体を用いたmultiplex immunohistochemistry (mIHC) により、CSCとTregの空間的相互依存関係を解析した。TSPAN8HiとTSPAN8Lo腫瘍の比較を行い、CSC近傍 (100 μm半径内) におけるTregの頻度を定量化した (Figure 1D-1G)。
in vitro Treg誘導系: FACS分取したTSPAN8陽性ヒトTNBC細胞 (MDA-MB-231またはMCF-7細胞株) の条件培地 (CM-TS+) と健常ドナー由来PBMC (末梢血単核細胞) を用いた間接共培養システムを確立した (Figure 2A)。EVは差次的超遠心分離 (dUC)、膜感知ペプチドコンジュゲートビーズ (MSP)、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) の3種独立法で単離し、NanoFCM、BCA、TEM、WB、MS、RNA-seqにより特性評価した。Treg分化および機能はフローサイトメトリーで評価した。
in vivoモデル: TSPAN8陽性 (TS+) CSCとTSPAN8陰性 (TS-) non-CSCをBALB/cマウスの乳腺脂肪体に移植する同系移植モデル (4T1細胞株を使用、n=5 mice/group)、およびC57BL/6マウスにおけるPY8119 TNBC正所移植モデルを使用した (Figure 1H)。腫瘍増殖、肺転移、TME内の免疫細胞浸潤を評価した。
機序解析: 免疫沈降、Co-IP (共免疫沈降)、GST pulldown、化学架橋アッセイ、Colabdockによる分子ドッキング、RNA-seq、KEGG/GSEA解析、TSPAN8模倣リポソーム (Lipo-TS+) を用いて、TSPAN8-CD103相互作用、LKB1-AMPKシグナル経路、およびFOXP3の役割を詳細に解析した。LKB1のSer428リン酸化に関与するキナーゼとしてMAP4K4を同定し、その阻害剤 (MAP4K4-IN) を用いて検証した。統計解析にはStudent’s t-test、Mann-Whitney U test、Log-rank testを用いた。
臨床的バリデーション: 703例の乳がん組織マイクロアレイ (TMA) でのmIHC解析により、CD103+FOXP3+Tregの予後因子としての意義を評価した (Figure 7A-7D)。80例のTNBC患者と60例の健常対照からの血漿EV ELISAにより、血漿EV中のTSPAN8レベルの臨床的関連性を評価した (Figure 7E-7G)。ネオアジュバント免疫療法を受けた28例のTNBCコホートでの応答評価を実施し、TSPAN8/CD44高発現腫瘍と治療応答率の関連を解析した (Figure 8M-8P)。
複合標的化療法: PY8119 TNBCモデルおよび4T1モデルにおいて、抗TSPAN8抗体 (キメラIgG1) と抗PD-1抗体 (マウスIgG1) の併用療法効果を評価した (Figure 8A)。腫瘍増殖、肺転移、TME内のCD8+T細胞およびCD103+Foxp3+Tregの頻度をフローサイトメトリーとmIHCで解析した。