- 著者: Jingwei Ma, Ke Tang, Huafeng Zhang, Keke Wei, Bo Huang
- Corresponding author: Bo Huang (Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology; Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing)
- 雑誌: Current Protocols
- 発行年: 2021
- Epub日: N/A
- Article種別: Protocol
- PMID: 34101382
背景
マイクロパーティクル (MPs) は、細胞の活性化やアポトーシスに伴う細胞骨格の変化および膜再編成によって細胞表面から放出される、直径 100〜1000 nm の不均一な膜小胞であると、Cocucci et al. TrendsCellBiol 2009 が報告している。腫瘍微小環境 (TME) において、腫瘍細胞由来マイクロパーティクル (T-MPs) は細胞外空間や血流中に大量に放出され、親細胞のタンパク質、脂質、RNA、DNA断片などの生理活性分子を豊富に含有する。T-MPsは、免疫細胞の表現型や機能、さらには免疫応答を調節する重要な役割を果たすことが示されており、腫瘍免疫において二面的な作用を持つことが知られている (Ma et al. 2020)。例えば、マクロファージに取り込まれるとM2様フェノタイプを誘導し免疫抑制を引き起こす一方、樹状細胞 (DC) に取り込まれるとcyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes (cGAS-STING) 経路を活性化し抗腫瘍免疫を誘導する (Zhang et al. 2015)。さらに、T-MPsは薬物送達キャリアとしても注目されており、悪性胸水 (MPE) や閉塞性胆管癌 (CCA) 患者での臨床応用例も報告されている (Gao et al. 2020; Guo et al. 2019; Xu et al. CancerImmunolRes 2020)。
しかしながら、T-MPsの不均一性や多様な機能のため、その単離、特性化、および機能解析には標準化された包括的なプロトコールが不足している点が課題であった。特に、エクソソームやアポトーシス小体といった他の細胞外小胞 (EVs) との厳密な区別は重要であり、国際細胞外小胞学会 (ISEV) のガイドライン ( Thery et al. JExtracellVesicles 2018 ) に準拠した厳密な手法が求められる。T-MPsの診断および治療応用の可能性を最大限に引き出すためには、高収率かつ高純度のT-MPsを安定的に取得し、その特性を多角的に評価する実践的な手法の確立が不可欠である。これまでの研究では個別の手法に焦点が当てられることが多く、単離から機能解析までを統合的にカバーする包括的なプロトコールは未解明な部分が残されていた。
目的
本研究の目的は、培養腫瘍細胞上清からの多段階遠心分離による腫瘍由来マイクロパーティクル (T-MPs) の効率的な単離、透過型電子顕微鏡 (TEM)、ナノ粒子トラッキング解析 (NTA)、フローサイトメトリー (FCM)、ウェスタンブロット (WB)、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を用いた包括的な特性化と検証、ならびに骨髄由来樹状細胞 (BMDC) および骨髄由来マクロファージ (BMDM) との相互作用解析、抗腫瘍ワクチン機能評価、および薬物送達機能の評価を可能にする実践的なプロトコールを提供することである。
結果
T-MPsの単離と品質管理： 本プロトコールに従い、H22マウス肝癌細胞由来T-MPsは多段階遠心分離により効率的に単離された。透過型電子顕微鏡 (TEM) による観察では、T-MPsは直径100〜1000 nmの不均一な膜小胞として確認された (Fig 2A)。ナノ粒子トラッキング解析 (NTA) により、T-MPsの粒径分布と濃度が定量的に測定され、少なくとも5×10⁸/100 µlの濃度が必要であることが示された (Fig 2B)。T-MPsの単離においては、UVB照射強度と時間 (300 J/m²で1時間) の最適化が重要であり、細胞継代数は25継代以内が推奨された。これらの条件は、T-MPsの安定した高収率および高純度での取得に不可欠である。
T-MPsの特性評価： ウェスタンブロット (WB) では、MHC-IやTLR4などの親細胞由来マーカーがT-MPs内に検出され、T-MPsが親細胞の細胞質成分を保持していることが確認された (Fig 2C)。これは、T-MPsが親細胞の生物学的情報を伝達する能力を持つことを示唆する。薬物搭載T-MPsの品質管理として、ドキソルビシン含有T-MPs中の薬物濃度はHPLCにより定量的に検証された (Fig 2D)。励起波長480 nm、発光波長560 nmで特異的なピークが検出され、薬物の安定的な封入が確認された。フローサイトメトリー (FCM) による表面マーカー検出では、CD44などの腫瘍細胞特異的マーカーがT-MPs表面に発現していることが示され、T-MPsの起源を特定する上で有用な情報となる。
T-MPsの免疫調節機能： T-MPsは免疫細胞に対して二面的な作用を持つことが示された。低酸素腫瘍由来T-MPsはマクロファージに取り込まれることでM2様フェノタイプへの分極化を誘導し、腫瘍微小環境における免疫抑制と転移前ニッチ形成を促進する。一方、放射線照射細胞由来T-MPsは樹状細胞 (DC) に取り込まれるとcGAS-STING経路を活性化し、抗腫瘍免疫応答を誘導することが報告された。PKH67標識T-MPsを用いたフローサイトメトリー解析では、BMDCおよびBMDMへのT-MPsの取り込みが時間依存的および用量依存的に生じることが示された。例えば、MP/細胞比10:1で24時間培養した場合、BMDCの約70%がPKH67陽性となった。
T-MPsのワクチンおよび薬物送達機能： 放射線照射腫瘍細胞由来T-MPsをロードしたBMDCをB16転移モデルマウスに投与した結果、肺転移結節数が有意に減少した。これは、T-MPsが腫瘍抗原と自然免疫シグナルの両方を担持することで、効果的な抗腫瘍ワクチン機能を発揮することを示唆する。さらに、ドキソルビシン含有T-MPsは、悪性胸水および閉塞性胆管癌患者において臨床的成果を改善することが報告されており、腫瘍関連マクロファージのM1分極化や腫瘍浸潤好中球による好中球細胞外トラップ (NETs) 放出促進を介した抗腫瘍作用が示唆された。MTXを搭載したT-MPsを腫瘍担持マウスに静脈内投与した場合、遊離MTXと比較して腫瘍組織への薬物送達効率が約2.5倍向上し、薬物送達キャリアとしての高い可能性が示された。
考察/結論
本プロトコール集は、国際細胞外小胞学会 (ISEV) の推奨する差分遠心法に準拠した標準的な腫瘍由来マイクロパーティクル (T-MPs) 単離法を提供するとともに、透過型電子顕微鏡 (EM)、ナノ粒子トラッキング解析 (NTA)、フローサイトメトリー (FCM)、ウェスタンブロット (WB)、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) といった複数の特性化手法の組み合わせによる包括的評価を可能にする。
① 先行研究との違い: これまでのT-MPs研究は個別の手法に焦点を当てることが多かったのに対し、本プロトコールは単離から特性化、そして免疫学的機能解析、さらには薬物送達機能の評価までを統合的に記述しており、T-MPs研究の標準化と再現性向上に大きく貢献する点で対照的である。特に、異なる誘導条件 (UVB照射、薬剤処理) や親細胞の種類がT-MPsの特性に与える影響を詳細に評価する手法が明示されている点は、これまでの報告と相違する重要な点である。
② 新規性: 本研究で初めて、T-MPsの二面的な免疫調節作用（マクロファージM2誘導による免疫抑制と樹状細胞cGAS-STING活性化による抗腫瘍免疫誘導）を詳細に解析するための実践的なプロトコールが統合的に提示された。また、T-MPsを抗腫瘍ワクチンや薬物送達プラットフォームとして応用する際の機能評価手法も新規に体系化された。これにより、T-MPsの生物学的役割と治療応用の可能性をより深く理解するための基盤が確立された。
③ 臨床応用: T-MPsはバイオマーカー、薬物送達プラットフォーム、および腫瘍ワクチン候補としての臨床応用が期待される。本プロトコールは、高純度かつ機能的なT-MPsを安定的に取得・評価するための基盤を提供し、将来的には悪性胸水や胆管癌といった難治性癌に対する新規治療戦略の開発に貢献する臨床的意義を持つ。特に、薬物搭載T-MPsが悪性胸水や閉塞性胆管癌患者で臨床的成果を改善した報告は、その translational な可能性を強く示唆する。
④ 残された課題: T-MPsの不均一性や他の細胞外小胞 (EVs) との厳密な分離は依然として残された課題である。また、in vivoにおけるT-MPsの動態や長期的な安全性、および特定の腫瘍抗原を効率的に搭載するための最適化条件については、今後の研究でさらなる検討が必要である。特に、臨床応用を見据えた大規模生産と品質管理の標準化も重要な今後の方向性である。これらの課題を克服することで、T-MPsの診断および治療における真のポテンシャルが引き出されると考えられる。
方法
本プロトコールは、T-MPsの単離、特性化、および機能解析の3つの基本プロトコールから構成される。
基本プロトコール1 (T-MPs単離)：H22、B16、A549、HL-60などの腫瘍細胞を培養し、約80%コンフルエンスに達した時点で紫外線B波 (UVB, 300 J/m²) を1時間照射した。その後16〜20時間インキュベートし、上清を回収した。回収した上清は、まず1,000×gで10分間遠心分離し全細胞を除去した。次に14,000×gで2分間遠心分離し細胞破片を除去した。最後に14,000×gで60分間遠心分離することでT-MPsをペレット化した。ペレットは4℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で2回洗浄し、FBS非含有培地またはPBSに再懸濁した。薬物搭載T-MPsの単離には、UVB照射後に薬剤 (例: メトトレキサート (MTX) 2 mg/ml) を培地に添加した。
基本プロトコール2 (特性化)： (a) 形態観察: 透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いて、T-MPsの形態と構造を観察した。サンプルは4%パラホルムアルデヒド (PFA) で固定後、1%四酸化オスミウム (OsO₄) で処理し、ウラニルアセテートで染色した。 (b) 粒径・濃度測定: ナノ粒子トラッキング解析 (NTA) 装置 (Malvern Panalytical NanoSight NS300) を使用し、T-MPsの粒径分布と濃度を測定した。各サンプルは0.1 µmフィルターで濾過した超純水で希釈し、最低200トラックを記録して3回反復測定した。 (c) 表面マーカー検出: フローサイトメトリー (FCM) を用い、APC標識抗ヒトCD44抗体などの表面マーカーの発現を検出した。T-MPsは0.1 µmフィルターで濾過したPBSで洗浄後、抗体と60分間氷上でインキュベートし、FCMで解析した。 (d) タンパク質検出: ウェスタンブロット (WB) により、T-MPs中の親細胞由来タンパク質 (例: MHC-I、TLR4) を検出した。T-MPsは1%ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 含有溶解バッファーで処理し、β-アクチンやNa/K ATPaseをハウスキーピングタンパク質として用いた。 (e) 薬物濃度検出: ドキソルビシン含有T-MPs中の薬物濃度は、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を用いて定量的に分析した。T-MPsを3% Triton X-100とプロテイナーゼKで処理後、多波長蛍光検出器 (励起波長 480 nm、発光波長 560 nm) で測定した。
基本プロトコール3 (機能解析)： (a) 免疫細胞の調製: マウス骨髄から骨髄由来樹状細胞 (BMDC) および骨髄由来マクロファージ (BMDM) を調製した。BMDCは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) とインターロイキン4 (IL-4) で7日間培養し、CD11c+細胞が90%以上であることを確認した。BMDMはマクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) で5日間培養後、M1マクロファージはリポ多糖 (LPS) とインターフェロンγ (IFNγ) で、M2マクロファージはIL-4で24時間刺激した。 (b) T-MPsの取り込み解析: PKH67蛍光色素で標識したT-MPsを、異なるMP/細胞比 (1:1〜10:1) および異なる時間 (4〜24時間) でBMDC、BMDM、または腫瘍細胞と共培養した。その後、FCMによりT-MPsの取り込み率と蛍光強度を時系列で解析した。 (c) 抗腫瘍ワクチン機能評価: 放射線照射腫瘍細胞由来T-MPsをロードしたBMDCをBALB/cマウスに皮下投与 (3回、5日間隔) し、B16転移モデルにおける肺転移結節数を評価した。 (d) マクロファージ分極解析: T-MPsと共培養したBMDMの表面マーカー (CD206/CD301) および細胞内サイトカイン (IL-10/TNFα/IL-12) の発現をFCMで検出し、マクロファージのM2様分極化を評価した。 (e) 薬物送達機能評価: ドキソルビシン含有T-MPsを腫瘍担持マウスに静脈内投与し、脾臓、骨髄、リンパ節、肺、腎臓、肝臓、腫瘍組織におけるT-MPsの分布と薬物濃度をFCMおよびHPLCで評価した。