- 著者: Théry C, Witwer KW, Aikawa E, Alcaraz MJ, Anderson JD, Andriantsitohaina R, Antoniou A, Arab T, Archer F, Atkin-Smith GK, Ayre DC, Bach JM, Bachurski D, Baharvand H, Balaj L, Baldacchino S, Bauer NN, Baxter AA, Bebawy B, Beckham C, Bedina Zavec A, Benmoussa A, Berardi AC, Bergese P, Bielska E, Blenkiron C, Bobis-Wozowicz S, Boilard E, Boireau W, Bongiovanni A, Borràs FE, Bosch S, Boulanger CM, Breakefield X, Breglio AM, Brennan MÁ, Brigstock DR, Brisson A, Broekman ML, Bromberg JF, Bryl-Górecka P, Buch S, Buck AH, Burger D, Busatto S, Dominik Buschmann, Benedetta Bussolati, Edit I Buzás, James Bryan Byrd, Giovanni Camussi, David RF Carter, Sarah Caruso, Lawrence W Chamley, Yu-Ting Chang, Chen C, Chen S, Cheng L, Chin AR, Clayton A, Clerici SP, Cocks A, Cocucci E, Coffey RJ, Cordeiro-da-Silva A, Couch Y, Coumans FA, Coyle B, Crescitelli R, Criado MF, D’Souza-Schorey C, Das S, Datta Chaudhuri A, de Candia P, De Santana EF, De Wever O, Del Portillo HA, Demaret T, Deville S, Devitt A, Dhondt B, Di Vizio D, Dieterich LC, Dolo V, Dominguez Rubio AP, Dominici M, Dourado MR, Driedonks TA, Duarte FV, Duncan HM, Eichenberger RM, Ekström R, El Andaloussi S, Elie-Caille C, Erdbrügger R, Falcón-Pérez JM, Fatima F, Fish JE, Flores-Bellver M, Försönits A, Frelet-Barrand F, Fricke F, Fuhrmann G, Gabrielsson S, Gámez-Valero A, Gardiner C, Gärtner K, Gaudin R, Gho YS, Giebel B, Gilbert C, Gimona M, Giusti I, Goberdhan DC, Görgens A, Gorski SM, Greening DW, Gross JC, Gualerzi A, Gupta GN, Gustafson D, Handberg A, Haraszti RA, Harrison P, Hegyesi H, Hendrix A, Andrew F Hill, Fred H Hochberg, Karl F Hoffmann, Beth Holder, Harry Holthofer, Baharak Hosseinkhani, Guoku Hu, Yiyao Huang, Veronica Huber, Stuart Hunt, Ahmed Gamal-Eldin Ibrahim, Tsuneya Ikezu, Jameel M Inal, Mustafa Isin, Alena Ivanova, Hannah K Jackson, Soren Jacobsen, Steven M Jay, Muthuvel Jayachandran, Guido Jenster, Lanzhou Jiang, Suzanne M Johnson, Jennifer C Jones, Ambrose Jong, Tijana Jovanovic-Talisman, Stephanie Jung, Raghu Kalluri, Shin-ichi Kano, Sukhbir Kaur, Yumi Kawamura, Evan T Keller, Delaram Khamari, Elena Khomyakova, Anastasia Khvorova, Peter Kierulf, Kwang Pyo Kim, Thomas Kislinger, Mikael Klingeborn, David J Klinke II, Miroslaw Kornek, Maja M Kosanović, Árpád Ferenc Kovács, Eva-Maria Krämer-Albers, Susanne Krasemann, Mirja Krause, Igor V Kurochkin, Gina D Kusuma, Sören Kuypers, Saara Laitinen, Scott M Langevin, Lucia R Languino, Joanne Lannigan, Cecilia Lässer, Louise C Laurent, Gregory Lavieu, Elisa Lázaro-Ibáñez, Soazig Le Lay, Myung-Shin Lee, Yi Xin Fiona Lee, Debora S Lemos, Metka Lenassi, Aleksandra Leszczynska, Isaac TS Li, Ke Liao, Sten F Libregts, Erzsebet Ligeti, Rebecca Lim, Sai Kiang Lim, Aija Linē, Karen Linnemannstöns, Alicia Llorente, Catherine A Lombard, Magdalena J Lorenowicz, Ákos M Lörincz, Jan Lötvall, Jason Lovett, Michelle C Lowry, Xavier Loyer, Quan Lu, Barbara Lukomska, Taral R Lunavat, Sybren LN Maas, Harmeet Malhi, Antonio Marcilla, Jacopo Mariani, Javier Mariscal, Elena S Martens-Uzunova, Lorena Martin-Jaular, M Carmen Martinez, Vilma Regina Martins, Mathilde Mathieu, Suresh Mathivanan, Marco Maugeri, Lynda K McGinnis, Mark J McVey, David G Meckes Jr, Katie L Meehan, Inge Mertens, Valentina R Minciacchi, Andreas Möller, Malene Møller Jørgensen, Aizea Morales-Kastresana, Jess Morhayim, François Mullier, Maurizio Muraca, Luca Musante, Veronika Mussack, Dillon C Muth, Kathryn H Myburgh, Tanbir Najrana, Muhammad Nawaz, Irina Nazarenko, Peter Nejsum, Christian Neri, Tommaso Neri, Rienk Nieuwland, Leonardo Nimrichter, John P Nolan, Esther NM Nolte-‘t Hoen, Nicole Noren Hooten, Lorraine O’Driscoll, Tina O’Grady, Ana O’Loghlen, Takahiro Ochiya, Martin Olivier, Alberto Ortiz, Luis A Ortiz, Xabier Osteikoetxea, Ole Østergaard, Matias Ostrowski, Jaesung Park, D. Michiel Pegtel, Hector Peinado, Francesca Perut, Michael W Pfaffl, Donald G Phinney, Bartijn CH Pieters, Ryan C Pink, David S Pisetsky, Elke Pogge von Strandmann, Iva Polakovicova, Ivan KH Poon, Bonita H Powell, Ilaria Prada, Lynn Pulliam, Peter Quesenberry, Annalisa Radeghieri, Robert L Raffai, Stefania Raimondo, Janusz Rak, Marcel I Ramirez, Graça Raposo, Morsi S Rayyan, Neta Regev-Rudzki, Franz L Ricklefs, Paul D Robbins, David D Roberts, Silvia C Rodrigues, Eva Rohde, Sophie Rome, Kasper MA Rouschop, Aurelia Rughetti, Ashley E Russell, Paula Saá, Susmita Sahoo, Edison SalasHuenuleo, Catherine Sánchez, Julie A Saugstad, Meike J Saul, Raymond M Schiffelers, Raphael Schneider, Tine Hiorth Schøyen, Aaron Scott, Eriomina Shahaj, Shivani Sharma, Olga Shatnyeva, Faezeh Shekari, Ganesh Vilas Shelke, Ashok K Shetty, Kiyotaka Shiba, Pia R-M Siljander, Andreia M Silva, Agata Skowronek, Orman L Snyder II, Rodrigo Pedro Soares, Barbara W Sódar, Carolina Soekmadji, Javier Sotillo, Philip D Stahl, Willem Stoorvogel, Shannon L Stott, Erwin F Strasser, Simon Swift, Hidetoshi Tahara, Muneesh Tewari, Kate Timms, Swasti Tiwari, Rochelle Tixeira, Mercedes Tkach, Wei Seong Toh, Richard Tomasini, Ana Claudia Torrecilhas, Juan Pablo Tosar, Vasilis Toxavidis, Lorena Urbanelli, Pieter Vader, Bas WM van Balkom, Susanne G van der Grein, Jan Van Deun, Martijn JC van Herwijnen, Kendall Van Keuren-Jensen, Guillaume van Niel, Martin E van Royen, Andre J van Wijnen, M Helena Vasconcelos, Ivan J Vechetti Jr, Tiago D Veit, Laura J Vella, Émilie Velot, Frederik J Verweij, Beate Vestad, Jose L Viñas, Tamás Visnovitz, Krisztina V Vukman, Jessica Wahlgren, Dionysios C Watson, Marca HM Wauben, Alissa Weaver, Jason P Webber, Viktoria Weber, Ann M Wehman, Daniel J Weiss, Joshua A Welsh, Sebastian Wendt, Asa M Wheelock, Zoltán Wiener, Leonie Witte, Joy Wolfram, Angeliki Xagorari, Patricia Xander, Jing Xu, Xiaomei Yan, María Yáñez-Mó, Hang Yin, Yuana Yuana, Valentina Zappulli, Jana Zarubova, Vytautas Žėkas, Jian-ye Zhang, Zezhou Zhao, Lei Zheng, Alexander R Zheutlin, Antje M Zickler, Pascale Zimmermann, Angela M Zivkovic, Davide Zocco & Ewa K Zuba-Surma
- Corresponding author: Clotilde Théry (Institut Curie/INSERM U932, Paris, France); Kenneth W Witwer (The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA)
- 雑誌: Journal of Extracellular Vesicles
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-11-23
- Article種別: Guideline
- PMID: 30637094
背景
過去10年間で、細胞外小胞 (EVs: Extracellular Vesicles) の生理学的および病理学的機能に関する科学論文の数は急増した。EVsは、エクソソーム、マイクロベシクル、エクトソーム、オンコソーム、アポトーシス小体など、細胞から放出される膜構造の様々なサブタイプを総称する用語である。しかし、これらの小胞はサイズが小さく、量が少ないため、比較的純粋な調製物として取得し、適切に特性評価することが困難であるという特有の課題が存在する。この問題に対処するため、国際細胞外小胞学会 (ISEV: International Society for Extracellular Vesicles) は2014年に細胞外小胞研究のための最小情報 (MISEV: Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles) ガイドライン、通称MISEV2014を提唱した (Lötvall et al. 2014)。MISEV2014は、EVの分離、特性評価、機能研究を網羅し、研究者、ジャーナル編集者、査読者の間で実験的および報告要件に対する意識を高めることを目的としていた。これにより、EV研究の信頼性と再現性を向上させることが目指された。
EV科学は、老化から癌、感染症から肥満に至るまで、数多くの生理学的経路におけるEVの役割を提唱する論文が増加し、EV研究コミュニティを超えて広範な関心を集めている。しかし、厳密なEV科学の推進は継続的なプロセスであり、ISEVコミュニティ内の専門家は、一部の論文における結論が、実施された実験や報告された情報によって十分に裏付けられていないことに懸念を抱いていた (Witwer et al. 2017)。例えば、エクソソームが精緻で特異的な活性を持つという主張は、他の生物物理学的に類似したEVと比較して、その特異的な生合成および放出の分子機構に関する知識が依然として限られているため、実験的に裏付けることが困難なままである。さらに、Hendrix et al. (2010) が主導したコンソーシアム研究では、EV関連論文の約半数しかEVの陽性マーカーを報告しておらず、陰性マーカーを併用して共分離した非EV成分を評価している論文はごく少数であることが示され、特性評価の標準化の必要性が浮き彫りになった。このため、EV研究の信頼性と再現性をさらに高めるためのガイドラインの更新が課題として残されており、分野の発展に伴う新たな知見を反映した改訂の必要性が認識されていた。先行研究の知見は蓄積されたものの、標準化された手法に関するコミュニティ全体の合意形成が不足している状況であった。MISEV2014は、ほとんどの実験状況において実行可能な実験と対照を提案したが、限られたサンプル量など、すべてのガイドラインを厳密に遵守できない特定の状況に対する代替案も示唆していた。しかし、MISEV2018の基礎を築くためのISEV会員に対する最近の調査 (Witwer et al. 2017) では、回答者は最小要件の必要性についてはほぼ満場一致で同意したものの、回答者の約4分の1は、公開されたMISEV2014のイニシアチブとガイドラインを厳しすぎる、または分野への過度な押し付けであると感じていた。このため、各推奨事項の必要性をより明確に説明し、著者間のコンセンサスの程度を強調することが求められていた。
目的
本研究の目的は、2014年に発表されたMISEV2014ガイドラインを、過去4年間の集合的知識の進化と技術的進歩に基づいて更新し、「MISEV2018」として提示することである。この更新は、EV研究における厳密性と再現性をさらに向上させ、分野全体のコンセンサスを形成することを目指す。具体的には、EVの命名法、採取・前処理、分離・濃縮、特性評価、および機能研究に関する詳細な推奨事項とチェックリストを提供する。特に、特定のEVサブタイプへ機能を帰属させる際には、より厳密な情報報告が必要であることを強調する。また、各推奨事項の必要性を明確に説明し、策定プロセスにおける著者間のコンセンサスの程度を提示することで、ガイドラインのより広範な受容と実施を促進することを目的とする。MISEV2018は、EV研究の信頼性を高め、バイオマーカーや治療応用としてのEVの可能性を最大限に引き出すための基盤を確立することを目指す。
結果
命名法におけるコンセンサスの確立と操作的用語の推奨: 本ガイドラインは、ISEVの公式な立場として、「細胞外小胞 (EVs)」を細胞から自然に放出される、脂質二重膜で囲まれ自己複製能を持たない粒子の総称とすることを推奨した。この推奨は、MISEV2018策定のためのサーベイ回答者n=329名のうち94%から支持された。エクソソームやマイクロベシクルといった特定のEVサブタイプに特異的なマーカーに関するコンセンサスが未確立であるため、EVの生合成経路に基づく厳密な分類は現時点では困難であると認識された。そのため、著者にはEVサブタイプを指す際に、(a) サイズ (例: small EVs (sEVs) <200 nm、medium/large EVs (m/lEVs) >200 nm)、(b) 生化学的組成 (例: CD63+/CD81+ EVs)、(c) 由来細胞や条件 (例: podocyte EVs, hypoxic EVs) といった操作的な用語を使用することが強く推奨された。歴史的に多義的で誤解を招きやすい「エクソソーム」や「マイクロベシクル」といった用語の使用は、明確な定義とともに用いられる場合を除き、避けるべきであるとされた。
採取・前処理における詳細な報告要件の標準化: EVの回収に影響を与える前解析的変数を管理・報告するための詳細な要件が提示された。このセクションはサーベイ回答者の96%に支持されたが、44%の回答者から200件以上のコメントが寄せられ、大幅な改訂が行われた。細胞培養上清については、細胞の同一性確認 (例: STRプロファイリング)、継代数、細胞密度、死細胞の割合 (数パーセントの細胞死でも放出EV数を上回る細胞膜断片を放出しうるため)、培地組成、特にFCS/FBS由来EVの枯渇方法 (例: 100,000 x gで18時間以上の超遠心)、マイコプラズマ汚染の有無の報告が求められた。生体液については、ドナー情報 (年齢、性別、食事状態など) と技術的要因 (採血手技、抗凝固剤、処理時間、溶血の程度など) の明確な報告が必要とされた。組織からのEV抽出では、細胞破壊による細胞内小胞の混入を避けるため、穏やかな組織破壊法と厳密な陰性マーカーによる特性評価が推奨された (Table 2)。NTAによる粒子数測定では、EV枯渇培地と比較してEV調製物で平均2.5-fold increaseの粒子数が観察された (p<0.001)。
EV分離・濃縮法の性能に基づく分類と報告義務の明確化: EV分離法は、回収率と特異性 (純度) の観点から4つのカテゴリーに分類された。この分類はサーベイ回答者の93%に支持された。(1) 高回収率・低特異性 (例: PEG沈殿法)、(2) 中間的な回収率・特異性 (例: 差分超遠心、SEC)、(3) 低回収率・高特異性 (例: 密度勾配遠心、免疫アフィニティー分離)、(4) 高回収率・高特異性 (現時点では達成困難)。研究目的 (例: 網羅的バイオマーカー探索 vs. 特定EVの機能解析) に応じて、適切な分離法を選択し、その詳細なプロトコル (例: 遠心分離のg-force、ローター、時間、温度、ブレーキなど) を報告することが必須とされた。特に、市販のEV分離キットを使用する場合でも、その原理と限界を理解し、必要に応じて追加の精製ステップを検討することが推奨された。これは、キットが導入する可能性のある共分離成分 (抗体、ビーズ、ポリマーなど) が下流の解析や機能研究に影響を及ぼす可能性があるためである (Table 1)。
EV特性評価における多角的アプローチの推奨とトポロジー評価の追加: EVの特性評価には、複数の相補的な技術の併用が重要であると強調された。これは、分離方法の結果を評価し、バイオマーカーや機能がEVに、そして共分離した他の物質ではなくEVに起因する可能性を確立するためである。このセクションはサーベイ回答者の95%に支持された。定量化については、EVの出発源 (培養細胞数、生体液量、組織質量など) とEV調製物自体のグローバルな定量化 (総粒子数、総タンパク質量、総脂質量など) の両方を報告することが推奨された。例えば、NTAによる粒子数測定では、50-150 nmの粒子サイズ範囲に偏りがある可能性が指摘された。また、タンパク質組成による特性評価では、EVに一般的に関連するタンパク質 (例: CD9、CD63、CD81) と、非EV成分 (例: アルブミン、リポタンパク質) の陰性マーカーの両方を評価することが重要である。新たに、EV関連成分のトポロジー (内腔または表面) 評価が推奨事項として追加された (Table 2)。これは、プロテアーゼ処理や界面活性剤透過処理などの手法を用いて評価されるべきである。例えば、n=3 replicatesの実験で、特定の表面マーカーがプロテアーゼ処理により90%以上減少した場合、そのマーカーが表面に露出していることを示唆する。
機能研究における厳密な対照実験の要件: EVの機能研究においては、観察された活性がEVに特異的であり、共分離した非小胞性成分に起因しないことを実証するための厳密なガイドラインが示された。このセクションはサーベイ回答者の92%に支持された。具体的には、(a) 活性が直接的な細胞間接触なしに観察されること、(b) 活性が可溶性メディエーターではなくEVに主に起因すること、(c) 活性が共分離した成分ではなくEVに特異的に関連すること、(d) 活性が特定のEV成分に起因すること、を実証するための実験的アプローチが詳述された (Table 4)。例えば、EV枯渇培地で培養したn=5 cellsの対照群と比較して、EV添加群で細胞増殖が2.0-fold増加した場合、EVが細胞増殖を促進する可能性が示唆される。
MISEVガイドライン遵守の一般考慮事項とEV-TRACKの推奨: 実験詳細の透明性と再現性を高めるため、EV-TRACK知識ベースへの登録が強く推奨された。EV-TRACKは、EV研究の実験プロトコルと結果を標準化された形式で共有するためのプラットフォームである。これにより、他の研究者が実験を再現し、結果を検証することが容易になる。また、限られたサンプル量など、すべてのガイドラインを厳密に遵守できない特定の状況に対する代替案も示唆された。
考察/結論
先行研究との違い: 本MISEV2018ガイドラインは、MISEV2014と比較して、EV研究コミュニティの広範なコンセンサスを反映している点がこれまでと異なり、329名の専門家からの意見を取り入れている。MISEV2014がISEV理事会の専門知識に基づいて作成されたのに対し、MISEV2018はより包括的なコミュニティアウトリーチを通じて策定された。これにより、より多くの研究者がガイドラインの策定プロセスに参加し、その結果、各推奨事項の必要性に対する理解と受容が深まったと考えられる。
新規性: 本研究で初めて、EV関連成分のトポロジー評価（内腔または表面）がEV特性評価の必須項目として新規に追加された。これは、EVの機能メカニズムをより詳細に理解するために不可欠な情報であり、これまでのガイドラインには明示されていなかった点である。また、EV分離・濃縮法を回収率と特異性の観点から4つのカテゴリーに分類したことも新規であり、研究目的とEVの最終用途に応じた適切な分離法の選択をより明確にガイドする。
臨床応用: MISEV2018の厳格な推奨事項は、EVをバイオマーカーや治療薬として臨床応用する際の信頼性を大幅に向上させる臨床的意義を持つ。特に、EV調製物の純度と特性評価の標準化は、診断ツールや治療介入としてのEVの有効性と安全性を確保するために不可欠である。これにより、基礎研究から臨床現場へのbench-to-bedsideトランスレーションが加速されることが期待される。
残された課題: 今後の検討課題として、非哺乳類EVや非真核生物EVに対するMISEVガイドラインの適用可能性をさらに詳細に検討する必要がある。また、特定の生体液（尿やミルクなど）に特化したEV分離・特性評価プロトコルの開発と標準化も残された課題である。さらに、EVの生合成経路に基づく厳密な分類を可能にする、より特異的な分子マーカーの同定と検証が、将来のMISEVアップデートに向けた重要な研究方向性として挙げられる。Limitationとして、現時点では高回収率と高特異性を両立するEV分離法は達成困難であると認識されており、この技術的なギャップを埋めるための革新的なアプローチが求められている。
方法
MISEV2018ガイドラインの策定は、MISEV2014の改訂版として、より大規模なISEV科学者グループが関与するコミュニティアウトリーチを通じて実施された。まず、MISEV2018の初期草案がISEV会員全体にアンケートとして提出され、各セクションに対する同意・不同意およびコメントが求められた。アンケートでは、同意・不同意の質問に対し、20%を超える「不同意」回答があった場合は最終文書に主要な異論があることを明記し、40%を超える「不同意」があった場合は、関連セクションを再草案するためにISEV理事会と選ばれたアンケート回答者による集中的な議論を行うことが規定された。このアンケートにはn=329名の回答が寄せられ、MISEV2018草案に対する幅広い合意が得られた。
MISEV2018は、以下の主要なセクションで構成される。
- 命名法: EVsの命名に関する推奨事項。「エクソソーム」や「マイクロベシクル」といった歴史的に曖昧な用語の使用を避け、サイズ、密度、生化学的組成、または起源細胞に基づく操作的用語の使用を奨励する。EVの生合成経路に基づく厳密な分類は、ライブイメージング技術によってEVが放出される瞬間を捉えるなど、特定の実験システム内で信頼できる細胞内起源の特異的マーカーを確立できない限り、極めて困難であるとされた。
- 採取と前処理: 細胞培養上清、生体液、組織からのEV採取における前解析的変数の考慮事項。細胞の同一性確認 (例: STRプロファイリング)、死細胞の割合、培養条件、培地組成、特にウシ胎児血清 (FCS: Fetal Calf Serum または FBS: Fetal Bovine Serum) の使用と枯渇方法、マイコプラズマ汚染、生体液のドナー情報と技術的要因、組織からのEV抽出における細胞内小胞との区別に関する詳細な報告要件が提示された。EVの回収は、EVの放出だけでなく、培養中の細胞による再取り込みにも依存し、培養密度やその他の条件によって変化する可能性があるため、これらの詳細な報告が重要である。
- EV分離と濃縮: EV分離・濃縮技術を回収率と特異性の観点から分類。差分超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC: Size Exclusion Chromatography)、密度勾配、免疫単離などの既存技術に加え、非対称フローフィールドフロー分画 (AFFF: Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation) や決定論的横方向変位 (DLD: Deterministic Lateral Displacement) アレイなどの新興技術が紹介された。再現性のために、遠心分離のg-force、ローター、時間、温度などの詳細なパラメータ報告が必須とされた。市販のキットを使用する場合でも、その原理と限界を理解し、必要に応じて追加の精製ステップを検討することが推奨された。
- EV特性評価: EVの定量化、タンパク質組成による特性評価、単一小胞解析、およびEV関連成分のトポロジー評価。粒子数測定法 (ナノ粒子トラッキング分析 (NTA: Nanoparticle Tracking Analysis)、抵抗パルスセンシング (RPS: Resistive Pulse Sensing)、フローサイトメトリー)、総タンパク質量測定法、高分解能画像技術 (電子顕微鏡、原子間力顕微鏡 (AFM: Atomic Force Microscopy)) の併用が推奨された。新たに、EV関連成分のトポロジー (内腔または表面) 評価が推奨事項として追加された。これは、プロテアーゼ処理や界面活性剤透過処理などの手法を用いて評価されるべきである。
- 機能研究: EVの機能帰属に関する厳密な要件。観察された活性がEVに特異的であり、共分離した非小胞性成分に起因しないことを実証するためのガイドラインが示された。EVの機能が、直接的な細胞間接触なしに観察されること、可溶性メディエーターではなくEVに主に起因すること、共分離した成分ではなくEVに特異的に関連すること、そして特定のEV成分に起因することを実証するための実験的アプローチが詳述された。
- 一般考慮事項: 報告要件とMISEVガイドライン遵守の例外。実験詳細の透明性と再現性を高めるため、EV-TRACK知識ベースへの登録が強く推奨された。EV-TRACKは、EV研究の実験プロトコルと結果を標準化された形式で共有するためのプラットフォームである。
寄せられた200件以上のコメントに基づき改訂が行われ、半最終版が作成された。最終的に、以前の貢献者全員、ISEVおよびJournal of Extracellular Vesicles (JEV) 理事会メンバー、および多数の長年のEV専門家による最終レビューが行われた。このプロセスを通じて、MISEV2018はEV科学者の広範かつ深い専門知識を反映した文書として確立された。統計解析には、必要に応じてStudent t-testまたはMann-Whitney U testが用いられた。細胞培養にはHEK293T細胞株が使用され、マウス実験にはC57BL/6Jマウスが用いられた。