- 著者: Mayela Mendt, Sushrut Kamerkar, Hikaru Sugimoto, Kathleen M. McAndrews, Chia-Chin Wu, Mihai Gagea, Sujuan Yang, Elena V. Rodriges Blanko, Qian Peng, Xiaoyan Ma, Joseph R. Marszalek, Anirban Maitra, Cassian Yee, Katayoun Rezvani, Elizabeth Shpall, Valerie S. LeBleu, Raghu Kalluri
- Corresponding author: Raghu Kalluri (Department of Cancer Biology, Metastasis Research Center, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX; rkalluri@mdanderson.org)
- 雑誌: JCI Insight
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-04-19
- Article種別: Original Article
- PMID: 29669940
背景
膵管腺がん (PDAC) は予後不良のがんであり、KRAS G12D 変異が約 90% に存在し、治療標的として重要である。エクソソームは、細胞から放出されるナノサイズの小胞であり、DNA、RNA、タンパク質などの細胞成分の細胞間交換に関与する。その特性から、様々な治療法の送達システムとしての有用性が注目されている (Kalluri 2016, Kowal et al. 2014, Ha et al. 2016, Marcus et al. 2013, van den Boorn et al. 2013, Andaloussi et al. NatRevDrugDiscov 2013, El-Andaloussi et al. 2012, Gilligan et al. 2017, Rezaie et al. 2018, Johnsen et al. 2014)。リポソームや合成ナノ粒子とは異なり、エクソソームの天然の特性は、治療用ペイロードを腫瘍に効率的に送達するための独自の利点を提供する可能性がある。
我々は以前、線維芽細胞 (BJ 細胞) 由来エクソソームに KRAS G12D siRNA をエレクトロポレーションで搭載した「iExosome」が、Kras G12D 変異によるマクロピノサイトーシス亢進を利用して PDAC 細胞に効率的に取り込まれ、腫瘍を抑制することを示した (Kamerkar et al. Nature 2017)。この研究は、iExosome が PDAC 患者の治療に役立つ可能性を強調した。しかし、iExosome 療法を臨床に移行する最大の障壁は、GMP (good manufacturing practice) 準拠の大量製造プロセスの確立であった。臨床試験には数兆個単位の均一品質エクソソームの安定産生、バッチ間変動の排除、長期安定性の保証、および毒性・免疫応答の系統的評価が必要である。既存の方法では研究規模の製造しか対応できず、臨床グレード製品の製造基準 (無菌性・エンドトキシン管理・均一マーカー発現) を満たす大量製造法は未確立であった。また、骨髄由来 MSC (Mesenchymal stem/stromal cell) は既に多様な疾患の患者に安全に投与されている細胞源であり (Lalu et al. 2012)、MSC 由来エクソソームは臨床応用に向けた魅力的なプラットフォームとして注目されていた (Gimona et al. 2017, Pachler et al. 2017)。これらの課題を克服し、臨床グレードのエクソソームを大規模に製造するプロセスは未開拓であり、その安全性と有効性を包括的に評価する必要があった。
目的
本研究の目的は、(1) Quantum バイオリアクターを用いた GMP 準拠の MSC (Mesenchymal stem/stromal cell) 由来 iExosome 大量製造プロセスを確立することである。(2) 確立された GMP iExosome の有効性を、複数の前臨床 PDAC モデル (患者由来異種移植モデル (PDX)、KPC689、Panc-1 正所性、PKS 遺伝子改変マウス) において検証することである。(3) GMP iExosome の生体内分布、毒性プロファイル、および -80°C での長期安定性を評価し、臨床試験への移行準備を整えることである。(4) 標準化学療法であるゲムシタビンとの組み合わせ療法の有効性を検討し、相乗効果の可能性を評価することである。これらの目的を達成することで、ヒト疾患に対する様々な治療法のための臨床グレードエクソソームの生成と実現可能性を示すことを目指した。
結果
GMP 大量製造の達成と品質確保: Quantum バイオリアクターを用いた MSC (Mesenchymal stem/stromal cell) の培養により、1 回のバイオリアクターランで合計 9.8 兆〜15.6 兆個のエクソソームが産生された (n=3 独立実験)。各バイオリアクターランから 6 回の収穫 (各 48 時間) を行い、1 回あたり 9,000 億〜4.5 兆個のエクソソームが得られた (Figure 3A)。全 6 回の収穫にわたって、エクソソームの粒子サイズはモード 165.9 nm、平均 202.2 nm で安定しており (バイオリアクター run 1)、CD9、CD63、CD81 (エクソソームマーカー) および CD47 の一貫した発現が確認された (Figure 3E)。代謝指標 (グルコース・乳酸) も全収穫期間で安定しており、MSC の生存維持が示された。各収穫はエンドトキシン (<1 EU/mL)、無菌、マイコプラズマ陰性を満たした。MSC 由来エクソソームは、BJ 線維芽細胞由来エクソソームと比較して、細胞あたりの産生量が有意に高かった (Figure 2B, C)。
PDX モデルにおける腫瘍退縮と生存期間延長: 患者由来 KRAS G12D 膵がん xenograft (PATX-60) 正所性モデルにおいて、siKras G12D iExo (siKras G12D-1 iExo) 群 (n=7 mice) は対照 siScrbl Exo 群 (n=7 mice) と比較して、MRI による腫瘍体積が経時的に退縮し (day 81 時点で顕著)、生存期間が有意に延長した (p<0.05、Figure 1B-D)。実験終点での膵重量および腫瘍重量も有意に低下した (Figure 1E)。組織病理学的評価では、siKras G12D iExo 群で浸潤の少ない腫瘍が観察され、一部のマウスはヌードマウスの自然寿命に近い生存を達成した (Figure 1D)。
KPC689 モデルでの有効性確認と転移抑制: KPC689 正所性腫瘍マウスモデルにおいて、BJ 線維芽細胞由来および MSC 由来 iExosome (冷凍 45 日後解凍) は、いずれも生存を有意に延長し (p<0.05、Figure 5A)、肺転移を減少させた (Figure 5B, C)。腫瘍内 KRAS G12D 発現レベルは生存と逆相関することが確認された (Pearson 相関、Figure 5G)。治療開始 23 日後 (day 51) の IVIS イメージング解析では、腫瘍負荷の有意な減少が示された (Figure 5D, E)。
ゲムシタビンとの相乗効果: 進行期 KPC689 モデル (腫瘍負荷が大きい設定) では、iExosome 単独では有意な生存延長は認められなかったが、ゲムシタビンとの組み合わせ療法が最も長い生存延長を達成した (p<0.05、Figure 6E)。早期治療開始モデルでは、ゲムシタビンと iExosome の組み合わせでより顕著な相乗効果が得られた (p<0.001、Figure 6F)。この結果は、がん細胞の急速な増殖がゲムシタビンに対する感受性を高め、化学療法による腫瘍縮小効果が iExosome の治療効果を増強するという解釈と整合する。
Panc-1 モデルおよび PKS モデルでの有効性確認: Panc-1 正所性腫瘍モデルでは、BJ 線維芽細胞および MSC 由来の iExosome (RB または CB で電気穿孔) が有意な生存延長を達成した (p<0.05、Figure 5H)。PKS (Ptf1a-Cre;LSL-KRAS G12D;Smad4 lox/lox) 遺伝子改変マウスモデルでは、GMP 製造・冷凍 5 ヶ月後の MSC iExosome が、進行期疾患での治療においても有意な生存延長を示した (p<0.01、Figure 9C)。この実験には n=7 mice が使用された。
大規模エレクトロポレーション (HS) の有効性確認: 低スケール (LS) と高スケール (HS) のエレクトロポレーションを比較した結果、アポトーシス誘導能、KRAS G12D 発現抑制、siRNA 搭載効率に有意差は認められなかった (Figure 6A-C)。2 種類の siRNA ソース (siKras G12D-1・siKras G12D-2) および 2 種類のバッファー (RB・CB) の組み合わせ全てで高効率な siRNA 搭載が確認された (Figure 6D)。エクソソームが搭載 siRNA を RNase から保護することも確認された (Triton X-100 処理で保護が消失)。アポトーシス誘導は LS と HS の間で 82% vs 78% と同等であった (Figure 6B)。
安全性および毒性プロファイル: C57BL/6 免疫正常マウスへのヒト BJ エクソソームの 4 ヶ月間腹腔内投与 (48 時間ごと、計 120 日間、n=8 mice) では、血液学的パラメータ (アルブミン、アルカリフォスファターゼ、ALT、AST、BUN、グロブリン、総タンパク、白血球、赤血球) は PBS 対照と同等であった (Supplemental Figure 10A, Supplemental Table 1)。組織病理学的所見も軽微な自然炎症 (PBS 対照でも同様) のみで、エクソソーム特有の異常は認められなかった (Supplemental Table 1, Supplemental Figure 10B)。免疫表現型解析 (脾臓・骨髄・胸腺) では、T 細胞 (CD3+/CD4+/CD8+)、B 細胞 (CD19+)、骨髄系細胞 (CD11b+/F4/80+) の割合に有意な変化はなかった (Supplemental Figure 11A)。血清 IL-6 は有意な上昇がなく、血清 IFNα は検出限界以下であった (Supplemental Figure 11B)。
長期安定性: -80°C 保存 45 日後および 6 ヶ月後も、NanoSight での粒子数・サイズ分布に変化はなく (Figure 8A, B)、TEM での形態保持が確認された (Figure 8C)。CD9/CD63/CD81/CD47 マーカー発現にも変化はなく (Figure 8D)、Panc-1 アポトーシス誘導能および KRAS G12D 抑制能も保持されていた (Figure 8E-G)。ただし、解凍後に室温または 4°C で 2 日以上放置すると生物活性が低下した (Figure 8F, G)。これは siRNA の経時的分解に起因する可能性が示唆された (Figure 9A)。GMP iExosome は解凍後 48 時間以内の使用が推奨される。
腫瘍集積の確認: DiR 標識 MSC エクソソームの生体内分布解析では、腹腔内投与 6 時間後に正常膵臓および KPC689 腫瘍への蓄積シグナルが肝臓、脾臓、肺よりも高かった (Figure 7A)。24〜48 時間後の時点でも膵臓腫瘍での選択的保持が確認された (Figure 7B)。静脈内投与でも腫瘍への蓄積が確認されたが、腹腔内投与より低度であった (Supplemental Figure 12A, B)。
考察/結論
臨床移行への意義 — 世界初の GMP-grade エクソソーム製造確立: 本研究は、GMP (good manufacturing practice) 準拠のエクソソーム大量製造、品質保証、前臨床安全性評価、および多モデル横断的な有効性確認を包括的に実施した先駆的報告である。Quantum バイオリアクターを用いた GMP iExosome 製造プロセスは、1 ランで 10 兆個規模の均一エクソソーム産生、全収穫にわたる品質マーカーの安定発現、FDA 承認の Plasma-Lyte (CB) を電気穿孔バッファーとして使用することによる製造後の洗浄ステップ省略とエクソソームロス回避、密閉系操作による無菌性保証、および -80°C での長期安定性 (5〜6 ヶ月) を実現した。これらの成果は、治療用エクソソームの臨床応用における主要なボトルネックを克服するものであり、臨床試験への移行の実現可能性を強く示唆する。
MSC 選択の合理性: 骨髄由来 MSC (Mesenchymal stem/stromal cell) は、多様な疾患患者へ安全に投与された実績を持つ (Lalu et al. 2012)。MSC 由来エクソソームは CD47 (ファゴサイトーシス回避シグナル「don’t eat me」) を高発現し、これが in vivo での生物活性に寄与すると考えられる (Rodriguez et al. 2013)。MSC と BJ 線維芽細胞は表面マーカーおよびエクソソームマーカーで類似するが、MSC の方がエクソソーム産生量が高かった点は、大規模製造における MSC 選択の合理性を裏付ける。
先行研究との違い: 本研究は Kamerkar et al. Nature 2017 が確立した iExosome 概念の臨床移行版として、製造スケール、品質管理、安全性の観点で研究グレードから臨床グレードへの「翻訳」を実証した点で、これまでの研究と異なる。EGFR 陽性腫瘍への指向性は、Kras 変異によるマクロピノサイトーシス亢進がエクソソーム取り込みを増強するという既報メカニズムと整合する。
新規性: 本研究で初めて、GMP 準拠の閉鎖系バイオリアクターシステムを用いて、臨床グレードの iExosome を大規模かつ安定的に製造するプロセスを確立した。また、FDA 承認の Plasma-Lyte (CB) を電気穿孔バッファーとして使用することで、洗浄ステップを不要とし、エクソソームの損失を最小限に抑える新規な手法を開発した。これは、これまでのエクソソーム製造プロトコルでは報告されていない新規なアプローチである。
ゲムシタビン組み合わせの戦略的意義: ゲムシタビンは PDAC の標準化学療法であり、それとの相乗効果確認は臨床試験デザインに直結する重要な知見である。腫瘍デバルキング効果が iExosome の有効性を増強するという解釈は、早期治療開始でより顕著な効果が得られた結果と整合する。今後の臨床試験ではゲムシタビン+iExosome の逐次・同時投与スケジュールの最適化が検討課題となる。
安全性の評価: 4 ヶ月間・120 回の腹腔内投与でも毒性・免疫活性化が見られなかったことは、エクソソームが真核細胞由来の天然小胞として免疫原性が低いことを支持する。ウイルスベクターやリポソームで問題となる炎症・免疫応答リスクが低い点はエクソソームの優位性の一つである。
残された課題と今後の方向性: 腫瘍集積の分子機序 (膵臓特異的指向性の決定因子) のさらなる解明、siRNA 修飾 (化学修飾による安定性向上)、さらなる長期安定性の確認 (6 ヶ月超)、KRAS G12D 以外のがんドライバー遺伝子への適用 (肺がん・大腸がん等)、および臨床製品のリリース基準の確定が残された課題として挙げられる。本論文はこれらの課題を認識しつつも、GMP iExosome の臨床第 I 相試験への移行準備が整ったことを強く示す。
方法
細胞・試薬: Panc-1 (KRAS G12D 変異)・BxPC-3 (野生型 KRAS)・KPC689 (Pdx1-Cre;LSL-KRAS G12D;LSL-Trp53 R172H 由来 PDAC、GFP-ルシフェラーゼ安定発現) 膵がん細胞株を使用した。BJ 線維芽細胞 (ATCC) および骨髄由来 MSC (MD Anderson Cancer Center 細胞療法バンク、継代 3、臨床承認ドナー由来) をエクソソーム産生に用いた。siRNA は siKras G12D-1 (Qiagen)・siKras G12D-2 (Nitto Denko Avecia) および AllStars Negative siRNA (scramble 対照) を使用した。
GMP 製造プロセス: Quantum バイオリアクター (Terumo BCT) を用いて、ヒトフィブロネクチンコート後、MSC (n=2×10⁷ 細胞、継代 3) を 9 日間拡大培養した。その後、12 日間 (6 回 × 48 時間ごと) 馴化培地 (250 mL/回) を密閉バッグ系で採取した。エクソソームは、閉鎖系での連続遠心 (Cobe 2991 Cell Processor)・0.2 µm フィルタ濾過・超遠心 (100,000×g、3 時間、Type 45 Ti ロータ) でペレット化された。最終製品は Plasma-Lyte (CB: FDA 承認臨床用希釈液) に再懸濁され、クライオガラスバイアルに分注し -80°C で保存された。品質管理として、NanoSight (粒子数・サイズ)、フローサイトメトリー (CD9/CD63/CD81/CD47)、TEM (透過型電子顕微鏡)、エンドトキシン (<1 EU/mL)、無菌試験、マイコプラズマ PCR を実施した。
siRNA エレクトロポレーション: 低スケール (LS) では Gene Pulser Xcell (Bio-Rad) を用い、4mm キュベットで n=10⁹ エクソソーム + 1 µg siRNA (400 µL CB 中) を電気穿孔した。高スケール (HS) では 4D Nucleofactor LV Unit (Lonza) を用い、20 mL LV Nucleocuvette Cartridge (密閉系) で n=2×10¹² エクソソーム + 2 mg siRNA (プログラム A-14) を電気穿孔した。電気穿孔バッファーとして、従来の研究バッファー (RB) から臨床グレードの Plasma-Lyte (CB) へ移行した。
in vitro 有効性試験: Panc-1・KPC689 細胞でのアポトーシス誘導 (フローサイトメトリー・LIVE/DEAD アッセイ)、KRAS G12D 発現抑制 (qRT-PCR) を評価した。グローバル遺伝子発現プロファイリングは Illumina HumanHT-12 V4.0 ビーズチップを用いて実施した。遺伝子セット濃縮解析 (GSEA) は Subramanian et al. ProcNatlAcadSciUSA 2005 の方法に従い、差次的発現遺伝子の解析には Ritchie et al. NucleicAcidsRes 2015 の Limma パッケージを使用した。
動物モデル:
- PDX モデル: PATX-60 患者由来膵がん xenograft (KRAS G12D) をヌードマウスに正所性移植し、MRI でモニタリングした。siKras G12D iExo (n=7 mice) と siScrbl Exo (n=7 mice) を比較した。
- KPC689 正所性モデル: C57BL/6 マウスに移植し、BJ 線維芽細胞由来および MSC 由来 iExosome の比較 (n=4-6 mice/群) を bioluminescence IVIS imaging で評価した。
- KPC689 進行期モデル: ゲムシタビン (100 mg/kg、3 回/週 × 3 週間) 単独・iExosome 単独・組み合わせ療法 (n=7-8 mice/群) を早期開始と進行期開始で比較した。
- Panc-1 正所性モデル: ヌードマウスに移植し、冷凍 2 ヶ月後 iExosome (LS/HS、RB/CB 比較) の有効性を評価した。
- PKS モデル: Ptf1a-Cre;LSL-KRAS G12D;Smad4 lox/lox 遺伝子改変マウスに GMP 製造・冷凍 5 ヶ月後の MSC iExosome を投与した。
毒性・安定性・生体内分布試験:
- 毒性: C57BL/6 免疫正常マウスにヒト BJ エクソソームを 48 時間ごと × 4 ヶ月腹腔内投与し、血液検査・組織病理解析を行った。
- 免疫応答: 3 週間投与後の免疫表現型 (脾臓・骨髄・胸腺) および IL-6・IFNα 血清測定を行った。
- 安定性: -80°C 保存 45 日・6 ヶ月後の粒子数・サイズ・マーカー・生物活性を新鮮エクソソームと比較した。
- 生体内分布: DiR 標識 MSC エクソソーム (n=8×10⁹) を腹腔内投与し、6・24・48 時間後に各臓器を IVIS imaging (Ex 700 nm/Em 780 nm) で評価した。 統計解析には、GraphPad Prism を用いて 1-way ANOVA、Dunnett’s または Tukey’s 多重比較検定、または 2 tailed Student’s t test を使用した。生存解析には Kaplan-Meier プロットを作成し、ログランク (Mantel-Cox) 検定で統計的差を評価した。p 値が 0.05 未満を統計的に有意と判断した。