- 著者: Camilla Raiborg, Jørgen Wesche, Lene Malerød, Harald Stenmark
- Corresponding author: Harald Stenmark (Department of Biochemistry, Institute for Cancer Research, The Norwegian Radium Hospital and University of Oslo, Oslo, Norway)
- 雑誌: Journal of Cell Science (Vol 119: 2414-2424)
- 発行年: 2006
- Epub日: 2006-05-23
- Article種別: Original Article
- PMID: 16720641
背景
endocytosis (細胞内取込) で取り込まれた膜蛋白の多くは plasma membrane へ recycle されるか、lysosome での分解へ向かう。分解運命の膜蛋白は ubiquitin 化が選別シグナルとなり、multivesicular endosome (MVE) の intraluminal vesicle (ILV) に内包されて分解される (Katzmann et al., 2002; Katzmann et al. Cell 2001)。ubiquitin 結合蛋白 Hrs (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate) は endosomal lipid である PtdIns(3)P に FYVE domain で結合して endosome に局在し (Raiborg et al. JCellSci 2001)、ubiquitin 化 cargo を MVE へ選別するとともに、下流の ESCRT-I (endosomal sorting complex required for transport-I) を endosome へ動員する。
Hrs および ubiquitin 化 cargo は、endosome 膜上の特徴的な flat clathrin coat (平坦クラスリン被覆) に濃縮することが電子顕微鏡で報告されていた (Sachse et al., 2002; Raiborg et al., 2002)。また Hrs は C 末端の clathrin-box motif を介して clathrin heavy chain terminal domain と結合し、clathrin を early endosome へ動員できることも示されていた (Raiborg et al. EMBOJ 2001)。しかしこの coat 内で clathrin が果たす機能 — 単なる marker なのか、scaffold として cargo 選別を能動的に駆動するのか、あるいは膜融合の機械的 barrier なのか — についての検討は手薄で、機能的意義は未検証の gap in knowledge として残されていた。endosome 上の clathrin が運搬小胞を形成せずに働く機構の直接証拠は不足しており、本研究はこの欠落を埋めることを狙った。
目的
endosome 上の flat clathrin coat の機能を解明する。具体的には、(1) Hrs と ubiquitin 化 cargo の microdomain 集積において clathrin が物理的 scaffold として必須か、(2) Hrs の clathrin-box motif による clathrin 結合が Hrs の制限的局在に必要十分か、(3) Hrs/clathrin microdomain が動的構造として下流 ESCRT-I を受け渡す platform たりうるか、(4) clathrin 結合が ubiquitin 化 cargo (EGF とその受容体) の分解選別に必須か、を検証する。
結果
Hrs と clathrin-box motif による endosomal clathrin の動員：full-length Hrswt は固定化 clathrin terminal domain に結合したが、clathrin-box を欠く HrsΔCB は結合せず、この結合は Hrs の tyrosine リン酸化を必要としなかった (50 ng/ml EGF 刺激下でも結合不変, Fig 1B,C)。Hrs siRNA を施した細胞では EEA1 陽性 endosome 上の clathrin がほぼ消失した一方、coated pit/vesicle 由来の微細 punctate 染色は残存した (Fig 2)。siRNA 抵抗性 myc-Hrswt の rescue で endosomal clathrin は回復したが、myc-HrsΔCB では回復せず、Hrs が clathrin-box を介して clathrin を vacuolar endosome へ動員する clathrin adaptor として働くことを示した。
clathrin による Hrs の EEA1 陰性 microdomain への拘束：plasmid-based clathrin siRNA + Rab5(Q79L) 肥大化 endosome において、対照では Hrs は EEA1 とほとんど共局在しなかったが (n=25)、clathrin 枯渇細胞では Hrs と EEA1 の共局在が顕著に増加した (n=27, Fig 3A-C)。clathrin 枯渇でも endosome 形成自体は保たれ、Hrs の側方拡散による EEA1 領域との混合が示唆された。clathrin 結合不全の myc-HrsΔCB は EEA1 と強く共局在した一方 (n=14)、myc-Hrswt は内在性 Hrs 同様 EEA1 とほとんど共局在せず (n=14, Fig 3D-F)、clathrin が scaffold として Hrs を EEA1 を欠く microdomain に拘束することを裏付けた。
clathrin-box motif 単独での microdomain redirect：PtdIns(3)P probe の 2xFYVE は通常 EEA1 に強く共局在するが、Hrs C 末端 (clathrin-box 含む) を融合した 2xFYVE-HrsCT は EEA1 と共局在せず (n=19)、代わりに YFP-Hrs 陽性 microdomain に局在した (n=27, Fig 4)。対照的に clathrin-box を欠失させた 2xFYVE-HrsCTΔCB は通常の 2xFYVE 同様 EEA1 と強く共局在し (n=27)、YFP-Hrs とは共局在しなかった (n=29)。clathrin 結合配列だけで本来非共局在の endosomal 蛋白を制限的 microdomain に隔離するのに十分であることを示した。
Hrs と clathrin の類似した FRAP 動態：GFP-clathrin LC と YFP-Hrs はいずれも肥大化 endosome 限界膜上の microdomain に分布し、whole-endosome photobleach 後、両者ともほぼ同一の microdomain pattern に cytosol から速やかに回復した。回復半減期 t1/2 は両蛋白とも約 17-19 秒と類似し、mobile fraction はいずれも 80-90% と算出された (YFP-Hrs n=12; GFP-clathrin LC n=9, Fig 5)。FLIP 解析では microdomain 内の lateral diffusion はほぼ認められず、各 microdomain が独立した entity として cytosolic pool と動的に交換することを示した。回復が microdomain 全長に沿って一様に起こり、edge から成長するのではない点も dynamic pool 仮説を支持した (Fig 5)。
ESCRT-I (Tsg101) の Hrs microdomain への濃縮：ESCRT-I component の Tsg101 は肥大化 endosome 限界膜上で EEA1/Hrs より低存在だったが、Hrs microdomain に有意に濃縮していた (EEA1 との共局在 n=16 に対し Hrs との共局在 n=19, p=0.008, Fig 6)。Tsg101 は一部 (全部ではない) の Hrs microdomain に検出され、Hrs/clathrin coat が下流 ESCRT cascade を受け渡す起点たりうることを示した (Fig 6)。
clathrin 結合に依存した EGF 分解選別：100 ng/ml Rhodamine-EGF を 15 分取り込ませ 3 時間 chase したところ、Hrs siRNA で EGF 分解が有意に阻害された (control n=33 に対し siRNA n=96 で残存 EGF 増加)。siRNA 抵抗性 myc-Hrswt は分解を rescue した (n=73) が、同程度発現の myc-HrsΔCB は rescue せず (n=89)、EGF は HrsΔCB 陽性 early endosome に蓄積した (Fig 7)。15 分取込時点では EGF 量に差がなく、Hrs と clathrin-box は endocytosis 自体には不要で、clathrin 動員と Hrs の正しい microdomain 局在が lysosomal 分解選別に必須であることを示した。
考察/結論
本研究は、endosome 膜上で Hrs と clathrin の間に相互依存関係が存在すること — Hrs が clathrin を vacuolar endosome へ動員し、その clathrin が Hrs を制限的 microdomain にクラスタリングする — を示し、この足場機構が内在化 EGF の効率的分解に必須であることを実証した。先行研究で clathrin は trans-Golgi network や plasma membrane で運搬小胞を出芽させる coat 蛋白として理解されてきたが、本研究の知見はこの従来モデルとは異なり、endosome 上の Hrs/clathrin coat は curved な clathrin-coated pit とは対照的に flat で二層構造をとり、運搬小胞を形成しない。clathrin がこのような被覆運搬体を作らない trafficking 経路で機能するという本研究で初めて得られた実験的証拠は、clathrin の役割概念を拡張する novel な知見である。
clathrin-box motif は Hrs C 末端のわずか 5 残基で、STAM (signal transducing adaptor molecule) や Eps15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 15)、Tsg101 など他の既知 interactor との結合には影響しないため、clathrin 結合のみを特異的に遮断できる利点がある。FRAP で示された Hrs と clathrin のほぼ同一の交換速度 (t1/2 約 17-19 秒) は、Hrs が endosomal clathrin adaptor として働き、clathrin の交換速度が主に Hrs の交換速度で規定されることと整合する。著者らは、coat の動的な開閉が ESCRT-I を coat 内部へ取り込む space を生み、endosome 成熟に伴い Hrs/clathrin が解離して cargo を ESCRT-I へ受け渡すモデル (Fig 8) を提唱した。
臨床的意義：本研究が確立した「ubiquitin → Hrs → ESCRT → ILV」という classical な MVB 形成経路は、その後の exosome (extracellular vesicle, EV) biogenesis 研究の分子基盤となった。MVE の ILV は plasma membrane と融合すると exosome として放出され、がんの pre-metastatic niche 形成や liquid biopsy バイオマーカーとして注目されており、本論文の機構理解は EV を標的・運搬体とする治療開発への bench-to-bedside 橋渡しの土台を提供している。ESCRT 経路は HIV 出芽など病態とも接続し、臨床応用上の含意も広い。
limitation と今後の検討：本研究は Rab5(Q79L) による endosome 肥大化や myc 標識構築体の overexpression に依存しており、生理的条件下での microdomain dynamics は完全には反映していない可能性がある。clathrin の不完全 knockdown による残存 microdomain の寄与も完全には排除できない。また flat clathrin coat の構造生物学的理解 (curved clathrin lattice との違い) や、clathrin が Hrs 介在の recycling にも必要かは残された課題であり、coat 構造の詳細解析が今後の検討課題として挙げられる。
方法
細胞系・identifier：ヒト HeLa 細胞および HEp-2 (human epithelial type-2) 細胞を使用。recombinant GST-clathrin-TD (clathrin heavy chain の残基 1-579 の GST 融合蛋白) は大腸菌 Escherichia coli 発現株で発現させ glutathione-Sepharose で精製した。endosome を肥大化させるため恒常活性型 GTPase Rab5(Q79L) を発現させ、confocal microscopy で microdomain を分解できる enlarged endosome を作出した。
遺伝子操作：ヒト Hrs 特異的 siRNA で Hrs を knockdown し、siRNA 抵抗性のマウス由来 myc-Hrswt または clathrin-box motif (C 末端 5 アミノ酸残基) を欠く myc-HrsΔCB を rescue 発現させた。clathrin は plasmid-based siRNA で枯渇させた。clathrin-box motif の十分性検証には PtdIns(3)P probe である tandem FYVE 構築体 (2xFYVE) に Hrs C 末端を融合した 2xFYVE-HrsCT および欠失体 2xFYVE-HrsCTΔCB を用いた。
Pull-down assay：GST-clathrin-TD ビーズと myc-Hrs 発現 HeLa lysate を incubate し、Hrs のリン酸化依存性を検証するため 50 ng/ml EGF を 15 分刺激した条件としない条件を比較、anti-myc 免疫沈降後に anti-phosphotyrosine 抗体で検出した。
生細胞 FRAP 解析：GFP (green fluorescent protein)-clathrin light chain (LC) または YFP-Hrs (yellow fluorescent protein-tagged Hrs) を Rab5(Q79L) と共発現させ、25°C で whole-endosome を 2-3 秒 photobleach 後 150 秒の蛍光回復を記録。回復曲線は diffusion model に非線形回帰 (non-linear regression) でフィットし、半減期 t1/2 と mobile fraction を算出した。FLIP (fluorescence loss in photobleaching) は 10 秒ごとに 200 秒 photobleach し lateral diffusion を評価した。
EGF 分解 assay：Hrs 枯渇 HEp-2 細胞に 100 ng/ml Rhodamine 標識 EGF (epidermal growth factor) を 15 分取り込ませ、cycloheximide 10 μg/ml 存在下で 3 時間 chase し、残存 EGF を pixel 強度で定量した (four independent experiments)。共局在は confocal 単一 endosome の overlapping pixel 比率で定量し、Tsg101 と EEA1/Hrs の共局在比較および EGF 残存量の群間比較には両側 Student t 検定 (two-tailed Student’s t-test) を適用し、p<0.05 を有意とした。