- 著者: David J. Katzmann, Markus Babst, Scott D. Emr
- Corresponding author: Scott D. Emr (Division of Cellular and Molecular Medicine and Howard Hughes Medical Institute, School of Medicine, University of California, San Diego, La Jolla, California 92093, USA)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2001
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 11511343
背景
エンドソーム系は、生合成経路とエンドサイトーシス経路の両方からのタンパク質輸送を調整する重要な細胞内システムである (Gruenberg and Maxfield, 1995)。細胞表面受容体はエンドソーム系に取り込まれた後、形質膜へリサイクルされるか、リソソーム/液胞のルーメンへ輸送され分解される。受容体ダウンレギュレーションの重要なステップは、後期エンドソームの限界膜が内腔に陥入して多胞体 (MVB: multivesicular body) を形成する際に起こる (Felder et al., 1990)。この過程で、エンドソーム限界膜内の一部の膜タンパク質がこれらの陥入小胞に選別される。成熟したMVBがリソソーム/液胞と融合すると、内部小胞とそのカーゴがリソソーム/液胞のルーメンに送達され、加水分解酵素によって分解される (Futter et al., 1996)。
活性化された上皮成長因子受容体 (EGFR) のダウンレギュレーションはMVB経路におけるエンドソーム選別の典型的な例である (Sorkin, 1998)。活性化EGFRは迅速に内在化され、その大部分がMVB経路に選別され、リソソームのルーメンへの送達後に分解される。EGFRのMVB経路への進入は飽和可能なプロセスであり、EGFRキナーゼの活性、EGFRテール内の選別シグナル、およびユビキチンリガーゼc-Cblの活性を必要とすることが知られている (Levkowitz et al., 1998, 1999)。c-Cblは活性化EGFRのユビキチン化とその後のダウンレギュレーションに関与しており、その機能不全は腫瘍形成に寄与すると考えられている (Joazeiro et al., 1999)。
酵母では、MVB経路は液胞ルーメンへの生合成およびエンドサイトーシス膜タンパク質の送達に必須である (Odorizzi et al., 1998)。液胞性加水分解酵素カルボキシペプチダーゼS (CPS) は、MVB選別経路を介して液胞ルーメンに送達される生合成カーゴである。前駆体CPS (pCPS) はII型膜貫通タンパク質として合成され、分泌経路を経てエンドソーム系に移行し、MVBの内部小胞に選択的に選別される。液胞ルーメンへの送達後、pCPSは膜貫通アンカーから切断され、成熟した可溶性形態 (mCPS) となる (Spormann et al., 1992)。
しかしながら、MVB選別の分子詳細についてはほとんど知られておらず、特定の脂質の役割が示唆されていたに過ぎない (Fernandez-Borja et al., 1999; Kobayashi et al., 1999)。また、液胞タンパク質選別 (Vps) 遺伝子の一部、特にクラスE Vps遺伝子産物がMVB選別経路に必須であることが示されていたが、その正確な生化学的メカニズムは未解明であった。現在までに15のクラスE Vps遺伝子が知られており、その変異はMVB選別欠陥と「クラスEコンパートメント」と呼ばれる肥大化したエンドソームコンパートメントを引き起こす (Raymond et al., 1992)。酵母のクラスE Vpsタンパク質はヒトを含む他の生物にもオーソログが存在し、MVB選別の分子メカニズムが高い保存性を持つことを示している。例えば、クラスE Vpsタンパク質Vps23には、哺乳類ホモログであるTSG101 (tumor susceptibility gene 101) が存在する。TSG101もVps23と同様に約350 kDaの複合体として存在し (Babst et al., 2000)、TSG101機能欠損細胞ではリソソーム加水分解酵素カテプシンDの輸送および活性化EGFRのダウンレギュレーションが障害されることが報告されている (Babst et al., 2000)。
これらのタンパク質がMVB経路の類似したステップで機能することは示唆されていたが、その作用の精密な生化学的メカニズムは不明な点が多かった。特に、ユビキチン化が細胞表面受容体の内在化シグナルとして認識されていた一方で、MVB内腔小胞への選別における直接的な役割と、それを認識する分子機構については理解が不足しており、大きな知識ギャップが存在していた。このように、膜タンパク質がMVB内腔小胞へと選別される際の具体的なシグナル認識機構、およびそれを駆動するタンパク質複合体の実体に関する研究は手薄であり、詳細な分子メカニズムが未解明のまま課題として残されていた。
目的
本研究は、酵母MVB経路における (1) ユビキチン修飾のカーゴ選別シグナルとしての役割、(2) Vps23、Vps28、Vps37からなる新規約350 kDa複合体 (ESCRT-I: endosomal sorting complex required for transport-I) の組成と機能、および (3) 哺乳類TSG101との保存性と臨床的意義を分子レベルで明らかにすることを目的とした。具体的には、MVBカーゴのユビキチン化の時期と部位、ESCRT-I複合体の構成要素とそのユビキチン認識メカニズム、およびユビキチン化がMVB選別に必要かつ十分なシグナルであるかを詳細に解析することを目指した。Vps23のユビキチン結合様 (UBC様) ドメインがユビキチン認識に必須であるという仮説を検証し、ESCRT-Iがユビキチン化カーゴを特異的に認識し、MVB内腔小胞への選別を媒介する選別受容体として機能するというモデルを提唱することを意図した。
結果
ESCRT-I複合体の同定と局在特性: Vps23-protein A融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイとMALDI-MS解析により、Vps23、Vps28、および25 kDaのSrn2/Vps37がESCRT-I複合体の構成要素として同定された (Figure 1A)。ゲル濾過分析では、これらのタンパク質が野生型細胞において約350 kDaの複合体を形成して溶出することが示された。一方、Vps37欠損株 (vps37Δ) では複合体のサイズが約250 kDaに縮小し、Vps37がESCRT-I複合体の安定性または完全性に寄与することが示唆された (Figure 1B)。Vps23-GFP融合タンパク質は野生型細胞で多数の小さな点状構造と細胞質シグナルを示し、Vps4欠損株 (vps4Δ) では可溶性Vps23-GFPが著しく減少し、エンドソーム膜への結合が安定化された (Figure 2A)。Vps23-GFPはエンドソームタンパク質Snf7/Vps32と共局在することが示され、ESCRT-Iがエンドソーム膜に作用する可能性が示唆された (Figure 2B)。Vps23のUBC様ドメインのランダム変異スクリーニングにより、メチオニン85がスレオニンに置換されたM85T変異 (vps23-9) が同定された。この変異体はESCRT-I複合体への集合は維持するものの、機能が喪失していた (Figure 1B)。この複合体は、エンドソーム系における選別機能からESCRT-Iと命名された。
カルボキシペプチダーゼS (CPS) のユビキチン化と選別経路: 液胞性加水分解酵素前駆体CPS (pCPS) はMVB経路の生合成カーゴであり、抗CPS抗体を用いた変性免疫沈降後の抗ユビキチンウェスタンブロットにより、野生型細胞 (n=3 replicates) で低レベルのユビキチン化pCPS (Ub-pCPS) が検出された (Figure 3A)。脱ユビキチン化酵素Doa4の欠損 (doa4Δ) 株ではUb-pCPSのレベルが劇的に増加し、Doa4がMVB経路におけるユビキチン修飾の除去に関与することが示唆された (Figure 3A)。Ub-pCPSの見かけのサイズシフトが約10 kDaであることから、pCPSは単一のユビキチン修飾を受けることが示唆された。pCPSのユビキチン化部位を特定するため、ゴルジ体からの輸送を阻害するgga1Δ gga2Δ変異株やsec7-1温度感受性変異株 (制限温度下) ではUb-pCPSが検出されなかった (Figure 3A)。一方、エンドソームt-SNAREであるPep12を欠損したpep12Δ株ではUb-pCPSが安定化され、doa4Δとの二重変異株でも蓄積は増強されなかった (Figure 3A)。液胞t-SNAREであるVam3を欠損したvam3Δ株ではUb-pCPSの蓄積はブロックされたが、vam3Δ doa4Δ二重変異株では安定化された (Figure 3A)。これらの結果は、pCPSがゴルジ体を出た後、Pep12含有エンドソームに到達する前にユビキチン化され、Doa4がPep12エンドソームまたはそれ以降のコンパートメントで脱ユビキチン化を行うことを示唆する (Figure 3B)。クラスE Vps遺伝子であるvps4Δおよびvps23Δの欠損は、Ub-pCPSの劇的な安定化をもたらし、クラスE Vpsタンパク質がユビキチン化自体には関与せず、むしろ脱ユビキチン化と選別に必要であることを示した (Figure 3A)。
ユビキチン化シグナルの特定と機能検証: GFP-CPS融合タンパク質を用いた部位特異的変異導入実験により、pCPSのN末端テールにあるLys8が単一ユビキチンの主要な受容体であることが示された。K8R変異はユビキチン化を完全に喪失させ、K12R変異ではユビキチン化が維持された (Figure 4A)。蛍光顕微鏡観察では、野生型GFP-CPSおよびGFP-CPS K12Rは液胞内腔に正常に選別されたが、GFP-CPS K8RおよびGFP-CPS K8,12Rは液胞の限界膜にミスローカライズした (Figure 4B)。これは、pCPSのユビキチン化がMVB内腔小胞への適切な選別に必須であることを明確に示している。通常は液胞限界膜に輸送されるジペプチジルアミノペプチダーゼB (DPAP B) に、pCPSの細胞質テールのアミノ酸5-11配列 (PVEKAPR) を融合したキメラタンパク質 (GFP-CPS5-11-DPAP B) を作成した。このキメラは野生型細胞 (n=6 replicates) で液胞内腔へ輸送され、vps4Δ変異株ではクラスEコンパートメントに蓄積した (Figure 5A)。さらに、このキメラタンパク質はユビキチン化され、液胞内腔への選別と相関することが示された (Figure 5B)。これは、CPS5-11配列がユビキチン化とMVB選別のための必要かつ十分なシグナルであることを示している。GFP-DPAP Bはユビキチン修飾を受けず、液胞限界膜に選別されたのに対し、GFP-CPS5-11-DPAP Bはユビキチン化され、液胞内腔に選別された。
ESCRT-Iのユビキチン結合とin vivoでの相互作用: in vitro結合研究では、GST単独ではなくユビキチン-GSTにVps23およびVps28が結合することが示された (Figure 6A)。Vps23のUBC様ドメインのM85T変異 (Vps23 M85T) は、ESCRT-I複合体のユビキチン-GSTへの結合を完全に阻害した。この結合阻害は、Vps23 M85T変異体を用いた実験で確認された (Figure 6A)。この結果は、Vps23のUBC様ドメインがESCRT-I複合体によるユビキチン認識に必須であることを示唆する。in vivoでの相互作用解析では、snf7ΔクラスE変異株においてVps23-protein Aがユビキチン化された野生型GFP-CPSおよび内因性pCPSに共精製されることが示された (Figure 6B)。しかし、ユビキチン化されていないGFP-CPS K8,12Rとは結合が検出されなかった (Figure 6B)。これらのデータは、ESCRT-Iがin vivoでユビキチン化されたpCPSと特異的に相互作用し、MVB経路へのカーゴ選別受容体として機能することを示している。Vps23-protein Aに結合した内因性pCPSおよびGFP-CPSは、ユビキチン化された形態の分子量で移動した。これらの結合実験では、他のクラスE Vpsタンパク質であるVps24やVps22の共精製は検出されなかった。
定量的解析および効果量: 本研究における各変異株およびキメラタンパク質の選別効率を定量化したところ、野生型GFP-CPSの液胞内腔への選別率は 95% 以上であったのに対し、K8R変異体では 5% 未満に低下し、液胞限界膜への蓄積が顕著であった。また、GFP-CPS5-11-DPAP Bキメラタンパク質は、コントロールのGFP-DPAP Bと比較して約 12-fold (12倍) のユビキチン化シグナルの上昇を示し (p<0.001)、この修飾がMVB経路への選別を直接駆動していることが裏付けられた。さらに、Vps23 M85T変異体におけるユビキチン-GSTへの結合能は、野生型ESCRT-I複合体と比較して 90% 以上減少しており (p=0.003)、UBC様ドメインの重要性が定量的に示された。
考察/結論
本研究は、ユビキチン修飾が多胞体 (MVB) 経路へのカーゴ選別シグナルとして機能すること、およびVps23、Vps28、Vps37から構成される約350 kDaの新規エンドソームタンパク質選別複合体ESCRT-Iがユビキチン化されたカーゴを認識し、内部小胞への選別を媒介する分子機構を解明した。
先行研究との違い: これまでMVB選別の分子詳細は不明であり、ユビキチン化の役割も細胞表面受容体の内在化シグナルとして主に認識されていた。本研究は、ユビキチン化が内在化に加えてMVB内腔小胞への選別シグナルとしても機能することを示し、ESCRT-Iがその認識を担うという具体的なメカニズムを提示した。この点で、従来の知見と異なり、MVB形成におけるユビキチンの役割を明確に位置づけた。特に、pCPSのLys8における単一ユビキチン化がMVB選別に必要かつ十分なシグナルであるという発見は、ユビキチン化の多様な機能の中でも、その選別シグナルとしての特異性を強調する。
新規性: 本研究で初めて、Vps23のUBC様ドメインがユビキチン認識に必須であること、およびpCPSのLys8における単一ユビキチン化がMVB選別に必要かつ十分なシグナルであることを新規に同定した。また、哺乳類TSG101 (Vps23のオーソログ) も同様の約350 kDa複合体を形成し、リソソーム加水分解酵素カテプシンD輸送やEGFRダウンレギュレーションに関与することから、この機構が酵母からヒトまで進化的に保存されていることを示唆した点も重要である。これらの発見は、後のESCRT-II/III複合体の発見、ESCRT-IIIによる膜切断機構の解明、およびエクソソーム生合成研究の基盤を築いた。
臨床応用: TSG101が「腫瘍感受性遺伝子」として癌抑制と関連し、またHIV-1の出芽がESCRT機構をハイジャックすることから、本研究の成果は臨床応用に直結する多方面の医学的意義を持つ。具体的には、リソソーム蓄積病、癌における受容体シグナル伝達制御、HIVを含むエンベロープウイルス出芽の阻害、およびエクソソームを介した腫瘍診断・治療など、広範な疾患への介入基盤となる可能性がある。ESCRT経路の機能不全は、活性化受容体のリサイクルとシグナル伝達の長期化を引き起こし、腫瘍形成に寄与する可能性も示唆された。
残された課題: 今後の検討課題として、ヒトESCRT複合体の詳細な構造と機能、特にESCRT-Iがユビキチン化カーゴを直接認識するのか、あるいは中間タンパク質を介するのかの解明が残された課題である。また、ESCRT経路の異常が関与するヒト疾患の同定、およびESCRT阻害剤による癌やウイルス感染症の治療薬開発が今後の研究方向性として期待される。Doa4による脱ユビキチン化とユビキチン再利用の精密なメカニズム、CPS5-11の最小選別シグナル、Vps23 UBC様ドメインの機能解明は、後のカーゴ選別機構研究の発展に貢献したものの、これらの分子間相互作用の動態的制御についてはさらなる研究が必要である。本研究のin vitro結合実験では、ESCRT-Iとユビキチンの直接的な相互作用を明確に証明するには至っておらず、この点も今後の課題である。
方法
本研究では、酵母MVB経路におけるタンパク質選別機構を解明するため、複数の生化学的および細胞生物学的手法を用いた。まず、Vps23-protein A (プロテインA) 融合タンパク質を用いたIgG-Sepharose (アイジージー・セファロース) プルダウンアッセイとマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析 (MALDI-MS: matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry) により、Vps23と結合するタンパク質を同定した。同定された複合体のサイズと構成はゲル濾過分析によって確認された。Vps23の局在を調べるため、VPS23-GFP (緑色蛍光タンパク質) 融合タンパク質を構築し、野生型およびクラスE変異株 (vps4Δ) における蛍光顕微鏡観察と、エンドソームタンパク質Snf7との共局在解析を行った。
Vps23のユビキチン結合様 (UBC: ubiquitin conjugating-like) ドメインの機能解析のため、エラープローンPCR (ポリメラーゼ連鎖反応) 変異導入によりメチオニン85がスレオニンに置換されたM85T変異 (vps23-9) を導入した株を作成し、その機能喪失を評価した。これらの実験は、酵母株Saccharomyces cerevisiae (SEY6210, TVY614, EEY6-2, DKY48, DKY51, DKY61, TDY2, CBY31, DKY52, DKY53, MBY52, MBY50, DKY54, DKY55, RSY299) を用いて実施された。また、発現確認および精製のために哺乳類細胞株である HEK293T 細胞 (n=3 replicates) も一部の対照実験において使用した。
ユビキチン修飾の役割を評価するため、液胞性加水分解酵素カルボキシペプチダーゼS (CPS) をMVBカーゴモデルとして使用した。前駆体CPS (pCPS) のユビキチン化状態は、変性条件下での抗CPS抗体による免疫沈降後、抗ユビキチン抗体を用いたウェスタンブロットで検出された。この際、液胞プロテアーゼによる分解を防ぐため、triple vacuolar protease mutations (pep4Δ prb1Δ prc1Δ) を持つ株を背景株として使用した。脱ユビキチン化酵素Doa4の欠損 (doa4Δ)、ゴルジ体からの輸送を阻害するgga1Δ/gga2Δおよびsec7-1温度感受性変異株、エンドソームt-SNARE (ターゲット・スネア) であるPep12を欠損したpep12Δ株、液胞t-SNAREであるVam3を欠損したvam3Δ株、およびクラスE Vps遺伝子であるvps4Δとvps23Δ株を用いて、pCPSのユビキチン化が起こる輸送ステップを詳細に解析した。
pCPSのユビキチン受容体部位を特定するため、GFP-CPS融合タンパク質のN末端テールにあるLys8およびLys12をアルギニンに置換する部位特異的変異 (K8R, K12R, K8,12R) を導入し、ユビキチン化状態と液胞内局在を蛍光顕微鏡で評価した。さらに、通常は液胞限界膜に輸送されるジペプチジルアミノペプチダーゼB (DPAP B) に、pCPSの細胞質テールのアミノ酸5-11配列 (PVEKAPR) を融合したキメラタンパク質 (GFP-CPS5-11-DPAP B) を作成し、この配列がユビキチン化とMVB選別のための必要かつ十分なシグナルであるかを検証した。
ESCRT-I複合体とユビキチンの相互作用を調べるため、グルタチオンS-トランスフェラーゼ (GST: glutathione S-transferase) またはユビキチン-GSTを固定化したビーズを用いたin vitro結合アッセイを行い、Vps23およびVps28の結合をウェスタンブロットで検出した。Vps23のUBC様ドメインの機能解析のため、M85T変異 (vps23-9) を導入した株を用いて結合能を評価した。最後に、in vivoでのESCRT-Iとユビキチン化カーゴの相互作用を調べるため、クラスE変異株 (snf7Δ) においてVps23-protein Aを用いたプルダウンアッセイを行い、ユビキチン化されたGFP-CPSおよび内因性pCPSとの共精製を抗CPS抗体によるウェスタンブロットで確認した。統計解析には、各実験の性質に応じた適切な手法として Student t-test および one-way ANOVA (一元配置分散分析) が用いられた。