- 著者: Francesca Pontis, Patrizia Ghidotti, Nicole Ferrario, Camilla Locatelli, Mattia Boeri, Marco Gentili, Miriam Segale, Massimo Moro, Arianna Di Bernardo, Giulia Bertolini, Paola Suatoni, Michele Ferrari, Ugo Pastorino, Loris De Cecco, Marica Ficorilli, Marta Lucchetta, Silvia Brich, Luca Agnelli, Fabio Maiullari, Roberto Rizzi, Claudia Bearzi, Paola Portararo, Sabina Sangaletti, Rossella Crescitelli, Luca Roz, Gabriella Sozzi, Orazio Fortunato
- Corresponding author: Luca Roz (Unit of Epigenomics and Biomarker of Solid Tumors, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milan, Italy)
- 雑誌: Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
- 発行年: 2026
- Epub日: 2026-05-06
- Article種別: Original Article
- PMID: 42129855
背景
肺がんは極めて高い転移能を持つ悪性腫瘍であり、早期（Stage I-II）に根治的切除術を施行した患者であっても、約30-55%が2年以内に遠隔転移や再発を来して予後不良となる。がん細胞が遠隔臓器に生着し転移を成立させるためには、あらかじめ受け入れ側の臓器微小環境が播種に適した状態へと改変される必要があり、この改変された領域は「前転移ニッチ（PMN: pre-metastatic niche）」と呼ばれる。PMNの形成プロセスにおいては、原発腫瘍から分泌される可溶性因子や細胞外小胞・粒子（EVP: extracellular vesicles and particles）が遠隔臓器に到達し、血管透過性の亢進、細胞外マトリックスのリモデリング、および局所免疫抑制を誘導することが知られている（Théry et al. 2018）。特に、腫瘍由来EVPが特定のインテグリン発現パターンを介して特定の臓器へ選択的に集積し、転移先を決定づける「オルガノトロピズム（臓器指向性）」の機序は、PMN形成における循環EVPの全身的な重要性を示唆してきた（Hoshino et al）。また、PMN微小環境における顆粒球系骨髄由来抑制細胞（G-MDSC: granulocytic myeloid-derived suppressor cell）や腫瘍関連好中球の集積が、免疫回避とがん細胞の生着を強力にサポートすることも報告されている（Coffelt et al）。
しかしながら、これまでの多くの研究は進行がんモデルや腫瘍局所から直接回収されたEVPの解析に依存しており、全身を循環する血中EVPが早期肺がんの段階において能動的に肺PMNを形成し得るか否か、またその詳細な分子機序については依然として「未解明」な部分が多い。さらに、手術前に再発リスクの高い予後不良患者を非侵襲的に識別するためのEVPベースの液体生検バイオマーカーは「未確立」であり、臨床現場で高リスク患者を術前に層別化して予防的治療介入を行うためのエビデンスが著しく「不足」している。本研究は、早期肺がん患者の術前血漿から単離した循環EVPの機能解析を通じて、これら未開拓の課題を解決することを目的として計画された。
目的
本研究の目的は、手術前の早期肺がん（Stage I-II）患者の血漿から単離した循環EVPが、肺における前転移ニッチ（PMN）形成を促進する機能的役割とその分子メカニズムを解明することである。特に、予後不良患者のEVPに特異的に富化されているマイクロRNA（miRNA）であるmiR-29a-3pおよび補体タンパク質C4A（complement protein C4A）を同定し、これらが標的細胞である血管内皮細胞を活性化する相乗的シグナル経路を明らかにするとともに、これら2つの分子を組み合わせた術前リスク層別化バイオマーカーとしての臨床的有用性を検証する。
結果
ESD-EVPの特異的分子プロファイル：miR-29a、C4A、および血小板マーカーの同定: MACSplexを用いたEVP表面マーカー解析において、予後不良群（ESD-EVP）は予後良好群（ESA-EVP）および健常喫煙者（HS-EVP）と比較して、血小板および内皮細胞由来のマーカーであるCD41b、CD42a、およびCD31の有意な発現上昇を示した（Fig. 1A）。発見コホート（n=20 vs n=20）におけるNanoString miRNAプロファイリングにより、4つのmiRNA（miR-1307-3p, miR-451a, miR-29a-3p, miR-199a-3p）に発現差異を認め、dPCRを用いたトレーニングコホート（n=30 vs n=30）での検証により、miR-29a-3pおよびmiR-199a-3pがESD-EVPにおいて有意に富化されていることを確認した（Fig. 1B）。プロテオミクス解析では、ESD-EVPにおいて9種類のタンパク質が有意に過剰発現しており、そのうちSFTPBおよび補体タンパク質C4AがHS群と比較しても有意に富化されていた（Fig. 1C）。ELISAによる検証において、C4AはESD群で最も高値を示し（Fig. 1D）、膜溶解実験および高塩濃度洗浄（high-salt washing）試験により、C4AはEVP膜表面に静電的相互作用を介して受動的に吸着していることが実証された（Fig. 1E）。
術前予後予測バイオマーカーとしての臨床的有用性: 検証コホート（n=89 patients）におけるROC解析の結果、miR-29a単独ではAUC 0.72（95% CI 0.58-0.85）、C4A単独ではAUC 0.73（95% CI 0.58-0.88）の予後予測能を示した。これら2つのマーカーを統合した組み合わせスコア（combined score）を構築したところ、AUC 0.78（95% CI 0.65-0.91）へと診断精度が向上した（Table 1）。Youden’s J indexに基づく最適カットオフ値において、この組み合わせモデルは感度 93.3%、特異度 56.8%、陽性適中率（PPV） 30.4%、および陰性適中率（NPV） 97.7%を達成し、術後の早期再発リスクが極めて低い患者を高い確度で除外診断できることが示された。
ESD-EVPによる血管内皮細胞の炎症性活性化と好中球接着の促進: 蛍光標識EVPを用いたin vitro取り込み実験において、EVPは上皮細胞よりも間質系細胞に優先的に取り込まれ、特にHUVEC内皮細胞が最大の取り込み能を示した（Fig. 2A-B）。ESD-EVPで処理したHUVECのRNA-seq解析では、走化性、細胞遊走、および血管新生に関連する遺伝子群の変動が認められ、qPCRにより炎症性活性化マーカーである VCAM1、CXCR4、CXCL1、CXCL2、および CCL2 の有意な転写上昇が確認された（Fig. 2C-D）。フローサイトメトリーによりVCAM1およびCXCR4のタンパク質発現上昇を確認し（Fig. 2E）、ELISAによりCXCL1の分泌亢進を実証した（Fig. 2F）。in vitro接着実験において、ESD-EVP処理内皮細胞は好中球（neutrophils）の接着を有意に亢進させたが、単球（monocytes）の接着には影響を与えなかった（Fig. 2G）。この好中球接着能の亢進は、内皮細胞における CXCL1 および VCAM1 のsiRNAサイレンシングによって完全に消失し、これら2分子が接着プロセスの鍵であることが証明された（Fig. 2I）。好中球接着のfold changeにおいて、ESD群は対照群に対し約2.5倍の亢進を示した。
内皮-線維芽細胞クロストークによる炎症シグナルの増幅ループ: EVPは正常肺線維芽細胞（CCD19lu）に直接作用して活性化することはなかったが、ESD-EVPで処理した内皮細胞の条件培地（CM: conditioned medium）で線維芽細胞を処理すると、IL6 および CXCL1 のmRNA発現、ならびに細胞表面のIL-6受容体発現が有意に上昇した（Fig. 3A-B）。内皮細胞から分泌される濃度に相当する重合CXCL1（600 pg/ml）の単独投与によっても線維芽細胞の IL6 および CXCL1 発現が強力に誘導され（Fig. 3C）、内皮細胞における CXCL1 のサイレンシングにより、この線維芽細胞活性化作用は消失した（Fig. 3D）。多細胞3Dバイオプリント肺モデル（n=4 replicates）においても、ESD-EVP処理は内皮細胞における VCAM1 の発現上昇と、線維芽細胞における IL-6 および α-SMA（ACTA2）の発現上昇を再現した（Fig. 3E-F）。
In Vivoにおける肺PMN形成、G-MDSC集積、およびがん細胞生着の促進: 蛍光標識EVPをSCIDマウスに静脈内投与したところ、24時間後に肺、肝臓、脾臓への集積が確認され、肺内皮細胞（CD31+）およびマクロファージ（F4/80+）への高い取り込みが示された（Fig. 4A-C）。ESD-EVPを投与したマウス（n=8 mice）の肺組織では、VCAM1、CXCR4、IL6、ならびにマクロファージの免疫抑制フェノタイプを示す CD206、CD163、IL10 の発現が有意に上昇した（Fig. 4D-E）。免疫細胞プロファイリングにより、肺におけるG-MDSC（CD11b+Ly6G+Ly6Clow）の集積亢進、および免疫抑制的かつ血管新生促進的なSiglecF陽性好中球亜集団の濃縮が明らかになった（Fig. 4G）。肺プレコンディショニング実験において、ESD-EVP処置マウスにヒト肺がん細胞株LT73（5×10^5 cells）を尾静脈投与した45日後、ESA-EVP処置群や未処置群と比較して、肺内のがん細胞生着数が有意に増加することがフローサイトメトリーおよびpan-CK染色により実証された（Fig. 5A-B）。さらに、ESD-EVPにmiR-29a阻害剤（LNA-29a）を導入してプレコンディショニングを行うと、肺へのがん細胞定着が著明に抑制され、miR-29aがin vivoにおけるPMN形成の主たる駆動因子であることが証明された（Fig. 5D、p<0.01、n=7 mice）。
miR-29aとC4Aの相乗作用によるSPARC下流シグナルを介した内皮活性化機序: メカニズム解析において、EVPから転移されたmiR-29aは内皮細胞内でその既知の標的遺伝子である SPARC（secreted protein acidic and rich in cysteine）の発現を直接的に抑制した（Fig. 6A-B）。miR-29a mimic単独の導入は CXCR4 や CXCL1 の転写を部分的に誘導したものの、VCAM1 の強力な発現上昇を再現するためには補体C4A（300 nM）との併用が必要であった（Fig. 6C-E）。miR-29a mimicとC4Aの併用処理、あるいは内皮細胞における SPARC のサイレンシングとC4Aの併用処理は、ESD-EVP処理に匹敵する極めて強力な VCAM1/CXCR4 の発現上昇、CXCL1分泌、および好中球接着の亢進を誘導した（Fig. 6F-I）。中和抗体によるC4Aの阻害、またはLNA-29aによるmiR-29aの阻害は、ESD-EVPによる内皮細胞の VCAM1/CXCR4 上昇を有意に抑制し、両者の併用阻害によって相乗的な抑制効果が得られた（Fig. 6J-K）。以上より、EVPに搭載されたmiR-29aによるSPARCの抑制と、表面のC4Aシグナル（PAR4受容体を介する）が相乗的に作用し、内皮細胞の炎症性活性化を介して肺PMNを構築する新規の分子メカニズムが解明された。
考察/結論
先行研究との違い: 本研究は、進行がん患者のEVPやがん細胞株由来のEVPを用いた従来の多くの研究と異なり、Stage I-IIの早期肺がん患者コホートを対象とし、術前の循環EVPが実際にin vivoにおいて肺の血管内皮細胞およびマクロファージを標的として炎症性・免疫抑制的微小環境をプライミングし、がん細胞の生着を促進する機能的活性を有することを明確に証明した。
新規性: 本研究で初めて、EVP由来のmiR-29aによるSPARC発現抑制と、EVP表面に吸着した補体C4Aによる相乗的な内皮活性化ループという、これまで報告されていない全く新しいPMN形成機序を新規に同定した。内皮細胞から分泌されたCXCL1が肺線維芽細胞を刺激し、さらなるIL-6やCXCL1の分泌を促すという「内皮-線維芽細胞クロストーク」による炎症増幅回路の解明は、PMNにおける多細胞ネットワークの重要性を浮き彫りにした。
臨床応用: 本知見は、早期肺がん術後の再発リスク予測および個別化治療の臨床応用に直結する。術前に測定可能な血漿EVPの miR-29a と C4A を組み合わせたスコアリングシステムは、検証コホートにおいてAUC 0.78、陰性適中率（NPV） 97.7%という優れた診断能を示した。臨床現場における臨床的意義として、手術単独で治癒可能な低リスク患者を確実に除外し、術後早期に再発・転移を来す高リスク患者を術前に正確に層別化することが可能となる。
残された課題: 今後の検討課題およびLimitationとして、いくつかの点が残されている。第一に、in vivoの転移実験において適応免疫系を欠損したSCIDマウスモデルを使用しているため、T細胞やB細胞などの獲得免疫系がEVPによるPMN形成やがん細胞生着に与える影響については未解明のままである。第二に、使用したがん細胞株LT73は肺への生着能は高いものの、臨床的に重要な他臓器（脳、骨、肝臓など）への転移を十分に再現できておらず、肺以外の臓器におけるPMN形成能の評価にはさらなる検証が必要である。第三に、miR-29aはSPARC以外にも多数の標的遺伝子を持つ多機能なmiRNAであり、内皮活性化の全容を単一のシグナル経路のみで説明することには限界がある。最後に、miR-29a阻害剤やC4A中和抗体を臨床応用するにあたっては、非腫瘍組織における毒性、オフターゲット効果、および補体抑制に伴う重症感染症リスクなどの課題を克服するための、ドラッグデリバリーシステム（DDS）を含めた安全な投与戦略の確立が今後の重要な研究方向性となる。
方法
患者コホートと血漿サンプル: 手術前に採取された早期非小細胞肺がん（NSCLC）患者の血漿サンプルを使用した。発見コホートとして、術後2年以内に死亡した予後不良群であるESD（Early-Stage Deceased、n=20）および術後5年以上生存した予後良好群であるESA（Early-Stage Alive、n=20）を解析した。さらに、独立したトレーニングコホート（ESD n=30、ESA n=30）および検証コホート（連続症例 n=89、中央値フォローアップ41ヶ月）を用いてバイオマーカーの検証を行った。対照群として、重喫煙者の健常者（HS: Heavy Smokers、n=8、BioMild LDCTスクリーニング試験 NCT02247453より選定）の血漿を用いた。
EVPの単離・精製および特性評価: 血漿1 mlから超遠心分離法（differential ultracentrifugation、120,000×g、90分間、4°C）を用いてEVPを単離し、MISEV2023（Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2023）ガイドラインに準拠して評価した。ナノ粒子トラッキング解析（NTA: nanoparticle tracking analysis）による粒径・粒子数測定、透過電子顕微鏡（TEM）による形態観察、ウェスタンブロット（WB）によるテトラスパニン（CD9, CD81）、TSG101、APOA1（Apolipoprotein A1）、GM130の検出を行った。また、MACSplex（multiplex bead-based flow cytometry assay）キットを用いたフローサイトメトリーにより、EVP表面の37種類のマーカーをプロファイリングした。リポタンパク質などの不純物を排除するため、ショ糖密度勾配遠心分離（sucrose density gradient centrifugation）によるsEV（small extracellular vesicle）画分の純化も実施した。
In Vitroおよび3Dバイオプリントモデル: 2D培養系として、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、正常肺線維芽細胞（CCD19lu）、およびマクロファージ（PMA分化THP-1）を使用した。さらに、生理的微小環境を模倣するため、HUVEC、CCD19lu、およびKRAS変異導入ヒト気管支上皮細胞（HBEC-KRAS[V12high]）をPEG-フィブリノゲンおよびアルギン酸バイオインクに包埋し、押し出し式3Dバイオプリンターを用いて12層の多細胞3D肺PMNモデルを作製した。
In Vivo動物実験: 免疫不全SCID（severe combined immunodeficiency）マウス（7-12週齢、メス）を使用し、DiRまたはPKH26で蛍光標識したEVP（30 µg）を72時間おきに計3回尾静脈投与（i.v.）し、体内分布および肺PMN形成を評価した。肺プレコンディショニング後、ヒト肺がん細胞株LT73（5×10^5 cells）を尾静脈注射し、45日後における肺への転移・生着能をフローサイトメトリーおよび抗パンサイトケラチン（pan-CK）抗体を用いた免疫組織化学（IHC）染色で定量した。
分子生物学的解析および統計解析: NanoString nCounterシステムを用いたEVP-miRNAプロファイリング、dPCR（digital PCR）によるmiRNA定量、LC-MS/MSによるEVPプロテオミクス、HUVECのRNA-seq（QuantSeq 3’ mRNA-Seq）、qPCR、ELISA、およびフローサイトメトリーを実施した。統計解析にはGraphPad Prism 9およびR（version 4.3.1）を使用し、2群間比較にはMann-Whitney U検定、多群比較にはANOVA（Tukey多重比較）などの統計手法を用いた。