- 著者: Yuhan Qiu, Andrew Chen, Rebecca Yu, Pablo Llevenes, Michael Seen, Naomi Y. Ko, Stefano Monti, Gerald V. Denis
- Corresponding author: Gerald V. Denis (Boston University Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston, MA, USA)
- 雑誌: Molecular Cancer Research
- 発行年: 2025
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 40047645
背景
トリプルネガティブ乳がん（TNBC）は、全乳がんの11%から20%を占めるサブタイプであり、エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）のいずれも発現しないため、これらの受容体を標的とした治療法が適用できない。このため、TNBCは他の乳がんサブタイプと比較して予後不良であり、進行期患者の45%が脳や遠隔臓器に転移することが報告されている (Lin et al. 2008)。TNBC細胞は高い転写可塑性を示し、上皮間葉転換（EMT）を容易に誘導するため、細胞の移動、浸潤、および早期の遠隔転移を促進する (Karihtala et al. 2013, Nieto et al. 2016)。特に脳転移はTNBC患者において高頻度で発生し、高い死亡率と関連している (Lin et al. 2004)。
疫学研究では、TNBC患者において肥満や2型糖尿病（T2D）の頻度が高いことが示されている。例えば、ある後方視的コホート研究では、TNBC患者の49.6%が肥満であったのに対し、非TNBC患者では35.8%であった (P=0.0098) (Vona-Davis et al. 2008)。また、メタ解析では、肥満女性は非肥満女性と比較してTNBC発症リスクが20%高いことが報告されている (Pierobon et al. 2013)。Black Women’s Health Studyでは、5年以上のT2D罹病期間がER陰性乳がんの発症および遠隔転移と有意に関連することが示された (Palmer et al. 2017)。肥満患者の多くはインスリン抵抗性（IR）を伴い、脂肪組織は乳がんの腫瘍微小環境（TME）における主要な非腫瘍細胞である。しかし、代謝異常を呈する脂肪細胞がTNBCの悪性度にどのように寄与するのか、その分子機構はこれまで未解明であった。
先行研究では、著者らはER陽性乳がんにおいて、IR状態の成熟脂肪細胞由来エクソソームがインスリン感受性（IS）脂肪細胞由来エクソソームと比較してEMTを促進することを示している (Jafari et al. SciSignal 2021)。エクソソームは、細胞から分泌される直径50〜150 nmの小胞であり、RNA、タンパク質、脂質などを内包し、標的細胞の転写ネットワークや細胞運命を劇的に変化させる能力を持つことが知られている (Kalluri et al. Science 2020)。Mullerらは、メラノーマ細胞が脂肪細胞由来エクソソームによって脂肪酸代謝を亢進させ、悪性度を増すことを報告している (Lazar et al. 2016)。これらの知見は、TMEにおける脂肪細胞の代謝状態ががんの進展に影響を与える可能性を示唆するが、TNBC、特に脳転移におけるIR脂肪細胞由来エクソソームの具体的な作用機序については、依然として知識ギャップが残されており、詳細な分子機構の解明が不足していた。
目的
本研究の目的は、インスリン抵抗性（IR）状態の脂肪細胞から分泌されるエクソソームが、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）の悪性度、特に上皮間葉転換（EMT）、細胞増殖、血管新生、および遠隔転移（特に脳転移）に与える影響をin vitroおよびin vivoモデルを用いて詳細に検証することである。具体的には、IR脂肪細胞由来エクソソームが4T1 TNBC細胞の表現型をどのように変化させるかを評価し、その効果を媒介するmiRNAや関連する遺伝子経路を同定する。さらに、これらのエクソソームによって誘導される遺伝子シグネチャが、臨床サンプル（METABRICおよびTCGAデータセット）における患者の予後予測能とどのように関連するかを評価することも目的とする。最終的に、代謝異常がTNBCの進展に与える影響の分子基盤を解明し、新たな診断バイオマーカーや治療介入の可能性を探索することを目指す。
結果
エクソソーム特性とEMT関連遺伝子の誘導: 3T3-L1脂肪細胞をTNFαで処理し、IR状態を誘導した。精製されたIRおよびISエクソソームは、NanoSight NS300システムにより、同等のサイズ分布と濃度を示し、4T1細胞に効率的に取り込まれることが確認された（Supplementary Fig. S1B-S1D）。4T1細胞に72時間エクソソームを曝露した後、RT2 Profiler EMT PCR arrayを用いてEMT関連遺伝子の発現を解析したところ、IRエクソソーム処理群では、コントロール群およびISエクソソーム処理群と比較して、EMT関連遺伝子群（Snai1, Snai2, Twist1, Jag1, Gsk3b, Smad2, Vim, Mmp3, Mmp9, Zeb2など）が有意に上昇した（Fig. 1A）。ISエクソソーム処理群でも軽度の上昇が認められたが、IR群ほど顕著ではなかった。IPA解析では、IR群でEMT、WNTシグナル伝達、HIF1αシグナル伝達経路が上方制御され、腫瘍抑制経路であるPTENシグナル伝達が下方制御されると予測された（Supplementary Fig. S1F）。興味深いことに、細胞老化（senescence）経路はIS群で最も亢進していた。疾患および機能解析では、IRおよびISエクソソーム処理群の両方で、がんの進行、浸潤、転移、血管新生が上昇し、アポトーシスおよび壊死が低下すると予測された（Fig. 1B）。
タンパク質発現と細胞移動能の亢進: 免疫組織化学（IHC）染色により、間葉系マーカーであるオステオポンチン（osteopontin）の発現がIR群でコントロール群およびIS群と比較して有意に増加し、一方、上皮マーカーであるE-カドヘリン（E-cadherin）の発現はIR群で減少した（Fig. 1C）。Transwell migration assayでは、IRエクソソーム処理群の4T1細胞において有意な移動能の亢進が認められたが（p<0.05）、ISエクソソーム処理群ではコントロール群との間に有意差は認められなかった（Fig. 1D, E）。これらの結果は、IRエクソソームがin vitroで4T1細胞のEMT関連遺伝子発現と移動能を増加させることを示している。RNA-seqによる非バイアス解析でも同様の傾向が確認され、IR対IS/コントロール群でEMT関連遺伝子が差次的に上方制御された（Supplementary Fig. S1G）。経路濃縮解析では、IR群でMYCおよびE2Fパスウェイ、ならびに有糸分裂紡錘体関連経路が濃縮されており、IRエクソソームが細胞増殖を促進することを示唆した（Fig. 1F）。METABRICデータセットへの遺伝子シグネチャ投影解析では、IR対ISの遺伝子セットは乳がん患者の生存期間短縮と相関した（log-rank P=0.025）（Fig. 1G）。
in vivo原発腫瘍の表現型: 4T1同種移植モデルにおいて、IRエクソソーム処理群の原発腫瘍では、vimentin（EMTマーカー）、Ki67（増殖マーカー）、CD31（血管新生マーカー）の発現がコントロール群およびIS群と比較して有意に増加した（p<0.05）（Fig. 2B-E）。これは、IRエクソソームがin vivoでEMT、細胞増殖、および血管新生を増強することを示唆する。解剖時にも、IR群の腫瘍ではコントロール群およびIS群と比較して血流量が顕著に多いことが観察された。原発腫瘍のバルクRNA-seq解析では、コントロール群とIR群の間で237個の遺伝子が差次的に発現しており（Supplementary Fig. S2C）、血管新生、Kras、およびEMT関連経路が濃縮されていた（Supplementary Fig. S2D）。肝臓においてもKi67発現の亢進がIR群で確認された（Supplementary Fig. S2A, S2B）。
脳転移への影響: 6-thioguanine耐性を利用した選択培養法により、遠隔転移クローンを定量した。肺におけるクローン数にはIR/IS/コントロール群間で有意差は認められなかった（Supplementary Fig. S3A, S3B）。しかし、脳におけるクローン形成はIR群で有意に増加し（p<0.05）、IS群ではコントロール群と比較して減少した（Fig. 3A, B）。脳転移クローンの形態解析では、IR群の細胞は細胞あたりの面積が小さく（Fig. 3C）、ソリディティが低下し（Fig. 3E）、コンパクトネス（Fig. 3F）および偏心率（Fig. 3G）が上昇し、エクステント（Fig. 3H）および円形度（Fig. 3I）が低下するなど、一貫して間葉系細胞の特徴を示す形態学的変化が認められた。IS群とコントロール群の間には形態学的差異は認められなかった。この結果は、エクソソーム処理自体ではなく、IRエクソソームの積荷（miRNAなど）が活性因子であることを示唆する。
トランスクリプトーム解析と臨床相関: 脳転移由来4T1細胞のバルクRNA-seq解析では、IR対IS群で有糸分裂紡錘体、血管新生、低酸素、EMT、がん幹細胞関連遺伝子セットが濃縮された（Fig. 4B）。ER陽性乳がん由来の肥満シグネチャをTCGAおよびMETABRICデータセットに投影した解析では、「Obesity-UP」シグネチャが「IR/C up」および「IS/C up」シグネチャと強い相関を示した（TCGAで>0.7、METABRICで>0.5）（Fig. 4D）。METABRICデータセットを用いた遺伝子セットバリエーション解析（GSVA）では、「IR/IS up」スコアが高い患者群は低い患者群と比較して有意に生存期間が短縮した（P=0.037）（Fig. 4E）。
候補miRNAの同定と機能検証: ISエクソソームとIRエクソソーム間で高度に差次的に発現するmiRNAとして、miR-145a-3pが同定された（Fig. 5C）。TargetScan解析により、miR-145a-3pは上皮間葉転換関連遺伝子であるOclnおよび腫瘍抑制遺伝子であるTrp53bp2の3’UTR領域に相補的配列を持つことが予測された（Fig. 5D上表）。バルクRNA-seqにより、miR-145a-3p過剰発現群では、これらの遺伝子の発現が有意に減少することが確認された（Fig. 5D下表）。miR-145a-3p過剰発現は、4T1細胞の移動能を有意に亢進させ（p<0.05）（Fig. 5A, B）、miR-145a-3p阻害剤はIRエクソソームによる移動能の亢進を抑制した（Fig. 5G, H）。in vivo脳転移モデルでは、miR-145a-3p過剰発現群で脳転移クローン数が有意に増加した（p<0.05）（Fig. 5I）。これらのin vitroおよびin vivoの結果は、miR-145a-3pがTNBCの細胞接着の低下、移動能の亢進、および遠隔転移の促進において重要な機能を持つことを示している。
考察/結論
本研究は、2型糖尿病（T2D）やインスリン抵抗性（IR）といった代謝疾患がトリプルネガティブ乳がん（TNBC）の脳転移を促進するという疫学的な観察に対し、分子機構を提示した重要な研究である。IR状態の脂肪細胞から分泌されるエクソソームが、4T1 TNBC細胞のEMT、増殖、血管新生を促進し、特に脳転移クローン形成を増強することをin vitroおよびin vivoの両方で明確に示した。これまで、腫瘍微小環境（TME）における脂肪細胞の代謝状態は、がん研究において十分に考慮されてこなかったが、本研究は、脂肪細胞の代謝状態の違い（IS vs IR）がエクソソームの積荷を介してがんの転移表現型を規定することを明示した点で新規性が高い。この知見は、Mullerらによるメラノーマにおける脂肪細胞エクソソームによる脂肪酸代謝亢進の報告 (Lazar et al. 2016) や、著者ら自身のER陽性乳がんにおける先行研究 (Jafari et al. SciSignal 2021) とも整合的であり、TNBCへの知見の拡張となる。
本研究で同定されたmiR-145a-3pは、IRエクソソームの主要な活性因子の一つとして、TNBCの悪性度と脳転移を促進する役割を果たすことが示唆された。これは、miR-145a-3pがOclnやTrp53bp2といった上皮関連遺伝子や腫瘍抑制遺伝子の発現を低下させることで、細胞の移動能を亢進させ、転移を促進するというメカニズムを支持する。IRエクソソーム処理群では、in vivoでKi67発現の亢進が認められたにもかかわらず、原発腫瘍の体積が増加しなかった点については、IR群の細胞がIS群やコントロール群と比較して小さく、細胞あたりの面積が減少していることが観察されたため、細胞数が増加しても体積に反映されなかった可能性が考えられる。これは、IRエクソソームが細胞の増殖を促進する一方で、細胞の形態やサイズにも影響を与えることを示唆しており、これまでの知見と異なり、Ki67発現と腫瘍体積が必ずしも直接相関しない可能性を示している。
臨床的意義として、本研究の結果はいくつかの重要な示唆を与える。第一に、T2Dを合併するTNBC患者における代謝管理（血糖コントロールやメトホルミンなどのインスリン感受性改善薬の使用）が、脳転移予防の新たな戦略となり得る可能性を示唆する。第二に、血中の脂肪細胞由来エクソソームのプロファイル、特にmiR-145a-3pのレベルが、代謝異常を伴うTNBC患者の転移リスクを評価するための非侵襲的なバイオマーマー候補となる可能性がある。第三に、本研究で同定されたobesity signatureに基づく患者層別化により、術前・術後のフォローアップを強化すべき患者群を特定できる可能性がある。
残された課題としては、miR-145a-3pの標的遺伝子のさらなる詳細な同定と機能的検証、およびヒト原発乳房脂肪組織由来エクソソームを用いた本研究結果の再現性が挙げられる。また、IS群が一部の形質（細胞老化経路の亢進や一部のEMT経路の抑制）においてコントロール群よりも保護的に振る舞う理由の解明も今後の検討課題である。さらに、代謝介入（インスリン感受性改善薬など）がエクソソームの積荷をどのように変化させ、がんの進展を抑制するかを評価する臨床試験の実施も必要である。これらの研究は、TNBC患者の管理において代謝的側面を考慮することの重要性を強く示唆し、新たな治療戦略の開発に繋がる可能性がある。本研究は、がんの進展における代謝とTMEの複雑な相互作用を理解するための新たな視点を提供し、今後の研究の方向性を示すものである。
方法
本研究では、マウス4T1 TNBC細胞株とマウス3T3-L1前脂肪細胞株を用いた。3T3-L1前脂肪細胞は、dexamethasone、IBMX (isobutylmethylxanthine)、インスリンを含む培地で成熟脂肪細胞に分化させた後、1 nmol/LのTNFαで24時間処理することによりインスリン抵抗性（IR）を誘導した。インスリン感受性（IS）およびIR状態は、グルコース取り込み応答によって確認した。成熟脂肪細胞のコンディション培地から、サイズ排除クロマトグラフィー（qEV column）を用いてエクソソームを精製し、NanoSight NS300システムでエクソソームのサイズ分布と濃度を測定した。
in vitro実験では、4T1 TNBC細胞に精製したエクソソームを50,000:1の比率（エクソソーム粒子数：4T1細胞数）で72時間曝露した。その後、RT2 Profiler EMT PCR arrayを用いてEMT関連遺伝子の発現を解析し、Transwell migration assayにより細胞の移動能を評価した。また、RNA-seq（DESeq2）を実施して、エクソソーム処理による網羅的な遺伝子発現変化を解析した。得られたデータはIngenuity Pathway Analysis（IPA）ソフトウェアを用いて、疾患・機能および下流経路の予測を行った。
in vivo実験では、4週齢の雌BALB/cJマウスの第4乳腺脂肪パッドに、エクソソーム処理した4T1細胞50,000個を移植した。移植2週間後にマウスを屠殺し、原発腫瘍、肺、脳を採取した。原発腫瘍組織は、vimentin、Ki67、CD31に対する免疫組織化学（IHC）染色を行い、EMT、細胞増殖、血管新生のマーカー発現を評価した。遠隔転移の定量には、4T1細胞が持つ6-thioguanine耐性を利用したクローン形成アッセイを実施し、肺および脳における転移クローン数を定量した。脳転移クローンの形態解析は、CellProfilerソフトウェアを用いて、細胞面積、円形度、コンパクトネス、ソリディティ、偏心率などのパラメータを定量的に評価した。
miRNAの機能解析では、ISおよびIRエクソソーム間で差次的に発現するmiRNAを同定し、特にmiR-145a-3pに焦点を当てた。miR-145a-3pをリポソームに再パッケージ化し、4T1細胞に処理して細胞移動能への影響を評価した。また、miR-145a-3p阻害剤を用いた実験も実施した。miR-145a-3p処理細胞のin vivo脳転移への影響も、同様のクローン形成アッセイで評価した。
臨床的関連性の評価として、METABRICおよびTCGAデータセットに、本研究で同定された遺伝子シグネチャを投影し、生存解析（log-rank P値）および肥満シグネチャとの相関を評価した。統計解析はStudentのt検定またはANOVAを用いてGraphPad Prismソフトウェアで実施し、P < 0.05を有意差ありとした。本研究で生成されたデータは、Gene Expression Omnibus（GSE286275）で公開されている。