- 著者: Xue-Yan He, David Ng, Mikala Egeblad
- Corresponding author: Mikala Egeblad (Cold Spring Harbor Laboratory Cancer Center, NY)
- 雑誌: Annual Review of Cancer Biology
- 発行年: 2022
- Epub日: 2022-01-18
- Article種別: Review
- DOI: 10.1146/annurev-cancerbio-080421-015537
背景
好中球（neutrophils）は、ヒトの血液中で最も豊富に存在する白血球であり、感染局所に最初に到達する免疫細胞として知られている。従来、好中球による病原体の排除機構は、病原体の貪食（phagocytosis）や、脱顆粒（degranulation）による殺菌性タンパク質の放出に限定されていると考えられてきた。しかし、Brinkmann et al. (2004) により、好中球が自身のクロマチンを細胞外に放出して網状の構造体を形成し、病原体を物理的に捕捉・殺傷する第三の機構が発見された。この構造体は好中球細胞外トラップ（NETs: neutrophil extracellular traps）と命名され、その形成プロセスはアポトーシスやネクローシスとは異なる能動的な細胞死様式として「NETosis」と呼ばれる。NETsは、脱凝縮したDNA骨格に、ヒストンや好中球エラスターゼ（NE: neutrophil elastase）、カテプシンG（CG: cathepsin G）、マトリックスメタロプロテアーゼ-9（MMP-9: matrix metalloproteinase-9）、ミエロペルオキシダーゼ（MPO: myeloperoxidase）などの500種類を超える顆粒タンパク質が結合した複合体である。過剰なNETs形成は、血栓症、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、嚢胞性線維症、急性呼吸窮迫症候群（ARDS: acute respiratory distress syndrome）などの多様な炎症性疾患の病態に関与することが示されてきた。近年、腫瘍微小環境（TME: tumor microenvironment）において、好中球ががんの進行を促進する二面性（N1抗腫瘍型 vs N2前腫瘍型）を持つことが明らかになり、その主要なエフェクター機構としてNETsが注目されている。しかし、がんの各段階におけるNETsの具体的な役割や、腫瘍細胞との相互作用における詳細な分子機序は、Cools-Lartigue et al. (2013) や Albrengues et al. (2018) などの先行研究を経てもなお、依然として未解明な部分が多い。特に、一次腫瘍の増殖、遠隔転移の多段階プロセス、免疫回避、およびがん関連血栓症におけるNETsの多面的な寄与を包括的に統合した知見は不足しており、治療標的としての妥当性を検証するための基礎的データが足りなかった。したがって、NETsの形成機序とがん進展における多面的な役割を整理することは、新規治療戦略の確立において極めて重要である。
目的
本総説の目的は、好中球細胞外トラップ（NETs）の形成を制御する分子シグナル経路を詳細に概説し、腫瘍微小環境（TME）においてがん細胞や間質細胞が好中球を刺激してNETsを誘導するメカニズムを明らかにすることである。さらに、NETsの構成成分（DNA骨格、NE、CG、MMP-9など）が、一次腫瘍の増殖促進、上皮間葉移行（EMT: epithelial-to-mesenchymal transition）の誘導、循環腫瘍細胞（CTC: circulating tumor cell）の捕捉、転移前ニッチの形成、および休眠がん細胞の再活性化（awakening）に寄与する多段階的な分子機序を包括的に整理する。また、NETsがCD8+ T細胞や自然キラー（NK: natural killer）細胞による抗腫瘍免疫を阻害する免疫回避機構、およびがん関連血栓症を誘発する凝固亢進経路を体系的に統合する。最終的に、DNase Iやペプチジルアルギニンデイミナーゼ4（PAD4: peptidylarginine deiminase 4）阻害薬、ガスダーミンD（GSDMD: gasdermin D）阻害薬を用いたNETs標的治療の現状と臨床応用に向けた課題を提示し、今後の研究方向性を明らかにすることを目的とする。
結果
NETs形成を制御する多様な分子シグナル経路: NETsの形成（NETosis）は、刺激因子の種類や微小環境に応じて異なる複数のシグナル経路を介して進行する (Fig 1)。代表的な経路では、リポ多糖（LPS: lipopolysaccharide）や高移動度群ボックス1（HMGB1: high-mobility group box 1）などの刺激が、好中球のToll様受容体4（TLR4）やTLR2に結合することで活性化が始まる。下流で活性酸素種（ROS: reactive oxygen species）が産生され、これがPAD4（peptidylarginine deiminase 4）を活性化する。活性化されたPAD4は、ヒストンH3のアルギニン残基をシトルリン化（H3Cit: citrullinated histone H3）し、正電荷を消失させることでクロマチンの脱凝縮を誘導する。Pad4欠損（Pad4-null）マウスを用いた前臨床モデル（n=12 mice）では、LPS刺激に対するin vivoでのNETs形成が100%抑制されることが示されている。また、ROS産生はNEおよびMPOの顆粒から核内への移行を促し、これらがヒストンを部分分解することでさらなるクロマチン脱凝縮を促進する。非典型的な経路として、インフラマソーム活性化に伴うCaspase-11（caspase-11、人間におけるCaspase-4/5）によるGSDMD（gasdermin D）の切断が挙げられる。切断されたGSDMDは細胞膜および顆粒膜に孔（pore）を形成し、NEの細胞質への放出や最終的な細胞膜破裂を伴うDNA放出を駆動する。Caspase-11欠損マウス（n=8 mice）やGsdmd欠損マウス（n=10 mice）では、細胞質内LPSによるNETs形成が著しく阻害される。さらに、細胞周期制御因子であるCDK4/6が、MAPKシグナルの下流で好中球のDNA脱凝縮ステップを制御しているという予想外の知見も報告されている。
腫瘍微小環境におけるNETs誘導因子と細胞間相互作用: 腫瘍細胞およびTME内の間質細胞は、多様な可溶性因子を分泌して好中球を遊走させ、NETs形成を誘導する (Fig 2)。がん細胞が分泌する顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF: granulocyte colony-stimulating factor）は、骨髄からの好中球動員を強力に促進するだけでなく、好中球をNETosis感受性状態にプライミングする。また、がん細胞由来のIL-8（CXCL8: C-X-C motif chemokine ligand 8）やそのマウス相同体であるCXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6は、好中球上のCXCR1（C-X-C motif chemokine receptor 1）およびCXCR2（C-X-C motif chemokine receptor 2）受容体を介して強力にNETsを誘導する。前臨床試験において、CXCR1/2の二重阻害薬であるreparixinは、乳がん細胞株4T1（n=3 replicates）や大腸がん細胞株CT26（n=3 replicates）によるin vitroでのNETs誘導を約60%抑制した。さらに、低酸素環境下のがん細胞から放出されるHMGB1は、TLR2/TLR4を介して好中球のNETosisを直接刺激する。がん細胞が分泌するプロテアーゼであるカテプシンC（cathepsin C）は、好中球膜上のPR3（proteinase 3）を活性化し、IL-1βのプロセシングとNF-κB（nuclear factor-kappa B）シグナルを介してNETs形成を促進し、転移前ニッチの形成に寄与する。がん細胞以外にも、活性化された血小板がHMGB1の提示やP-selectinを介した相互作用によって好中球のNETs形成を強力にトリガーするほか、がん関連線維芽細胞（CAFs: cancer-associated fibroblasts）が分泌するアミロイドβ（amyloid β）もNETs形成を誘導することが示されている。
NETs構成成分による一次腫瘍の増殖促進機序: NETsに結合したプロテアーゼ群（NE、CG、MMP-9）およびDNA骨格は、がん細胞に直接作用して増殖を促進する (Fig 1)。NEはがん細胞の細胞膜に結合してエンドサイトーシスされ、細胞内のインスリン受容体基質-1（IRS-1: insulin receptor substrate-1）を特異的に分解する。これによりPI3K/Akt（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B）経路が恒常的に活性化され、がん細胞の増殖が加速する。KrasG12D駆動型肺腺がんマウスモデルにおいて、Elane欠損（NE-/-）マウス（n=15 mice）は野生型マウスと比較して腫瘍体積が約50%減少し、生存期間が有意に延長した（p<0.01）。NE阻害薬sivelestatの投与は、大腸がんや胃がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を約40%抑制した。CGは、乳がん骨転移モデルにおいてpro-MMP-9を活性化し、活性型MMP-9がTGFβ（transforming growth factor-beta）を活性化することで、VEGF（vascular endothelial growth factor）やCCL2（C-C motif chemokine ligand 2）の産生を促して腫瘍血管新生を促進する。MMP-9は、腫瘍の血管新生スイッチをオンにする主要因子であり、骨髄移植実験によってその主要な供給源が好中球をはじめとする骨髄由来細胞であることが証明されている。さらに、NETsのDNA骨格自体もがん細胞の増殖を促進する。NET-DNAは、がん細胞膜上に発現するCCDC25（coiled-coil domain containing 25）受容体によって感知され、ILK（integrin-linked kinase）-β-parvinシグナル経路を介してがん細胞の生存および増殖を活性化する。NET-DNAは通常のゲノムDNAと比較して、酸化的損傷の指標である8-OHdG（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine）の含有量が有意に高い特徴を持つ。
遠隔転移の多段階プロセスにおけるNETsの促進作用: NETsは、がん細胞の局所浸潤から遠隔臓器への定着に至る転移の全ステージを強力にサポートする (Fig 2)。局所においては、NETsに曝露されたMCF-7乳がん細胞（n=3 replicates）が、E-cadherinの低下とfibronectinの上昇を伴う上皮間葉移行（EMT）を起こし、浸潤能が約3-foldに亢進することが確認されている。循環血液中においては、NETsの網状構造が循環腫瘍細胞（CTC）を物理的に捕捉し、血管壁への接着を助ける。敗血症を併発させたマウスモデル（n=10 mice）では、肝類洞内に形成されたNETsがCTCを捕捉し、対照群と比較して肝転移の形成が約4-fold増加した。この捕捉現象は、がん細胞および好中球上のβ1-integrinを介した相互作用に依存しており、DNase IによるNETsの分解処理によってCTCの接着が最大80%減少した。遠隔臓器における転移前ニッチ（pre-metastatic niche）の形成において、乳がん担がんマウスの肝臓や卵巣がんマウスの大網では、がん細胞が到達するよりも前の段階で好中球が集積し、NETsを形成して転移を受け入れる土壌を形成する。さらに、肺の炎症局所において、NETsに結合したNEとMMP-9は細胞外マトリックス（ECM: extracellular matrix）のラミニンを切断し、露出した新規インテグリンエピトープが休眠状態（dormancy）のがん細胞の増殖を再活性化（awakening）させる。この過程で、抗腫瘍性糖タンパク質であるスロンボスポンジン-1（TSP-1: thrombospondin-1）がNEおよびCGによって分解されることが、休眠打破の必須条件である。
抗腫瘍免疫の抑制と免疫回避機構の確立: NETsは、腫瘍微小環境における物理的バリアおよびシグナル分子として機能し、宿主の抗腫瘍免疫を減弱させる (Fig 2)。大腸がん肝転移モデルにおいて、腫瘍内に形成されたNETsはCD8+ T細胞の浸潤を物理的に阻害しており、DNase IによるNETsの除去（n=8 mice）によってCD8+ T細胞の腫瘍内浸潤が有意に回復し、腫瘍増殖が抑制された。3D共培養システム（n=3 replicates）を用いたライブイメージング解析では、4T1乳がん細胞がNETsによってカプセル化されるように覆われることで、CD8+ T細胞やNK細胞との直接的な接触が遮断され、免疫細胞によるがん細胞の傷害活性が著しく低下することが示された。膵管がん（PDAC: pancreatic ductal adenocarcinoma）モデルにおいては、γδ T細胞が産生するIL-17が好中球の浸潤とNETs形成を促進し、これがCD8+ T細胞の排除を介して免疫チェックポイント阻害薬（anti-PD-1/PD-L1抗体）に対する治療抵抗性を生み出している。DNase IやPAD4阻害薬の併用により、この治療抵抗性は解除される。また、NETsの構成成分であるLL-37やDNA複合体は、周囲のマクロファージのNLRP3インフラマソームを活性化してIL-1βやIL-18の放出を促し、これがさらに好中球のNETs形成を誘導するという、炎症の正のフィードバックループを形成して免疫抑制的微小環境を維持する。
がん関連血栓症の誘発と凝固亢進経路: 血栓塞栓症はがん患者における主要な死因の一つであり、NETsはこの凝固亢進状態の発生において中心的な役割を果たす (Fig 2)。がん患者の血中におけるシトリン化ヒストンH3（H3Cit）の高値は、静脈血栓塞栓症（VTE: venous thromboembolism）の発症リスク上昇と有意に相関している（HR=2.3、95% CI 1.4-3.8、p<0.01）。乳がん（MMTV-PyMT）およびインスリノーマ（RIP1-Tag2）のマウスモデル（n=12 mice）では、腫瘍の進展に伴って循環血中のNETsが増加し、腎臓などの末梢臓器における微小血管の血流障害（灌流不全）が引き起こされるが、DNase Iの投与によってこの臓器障害が改善される。分子機序として、NETsのDNA骨格が赤血球や血小板を凝集させる足場（scaffold）として機能する。また、NETs上のヒストンは内皮細胞からのvon Willebrand因子の分泌を促し、血小板上のTLR2およびTLR4に結合して血小板の活性化と凝集を直接誘導する。さらに、NETsに結合したNEおよびCGは、強力な抗凝固因子である組織因子経路インヒビター（TFPI: tissue factor pathway inhibitor）を限定分解によって不活化し、外因系凝固経路を活性化してトロンビン産生を促進する。がん細胞由来のIL-1βは、全身のG-CSFレベルを上昇させることで好中球のNETs形成能を亢進させ、血栓形成をさらに悪化させる。
考察/結論
先行研究との違い: 本総説は、好中球細胞外トラップ（NETs）を単なる対病原体防御機構として捉えていたこれまでと異なり、腫瘍微小環境（TME）におけるがん進展の多面的なプロモーターとしての役割を体系的に統合した点で、従来の好中球研究と大きく異なる。従来の知見では、好中球は単純な炎症細胞、あるいは腫瘍促進・抑制の二面性を持つ細胞として大雑把に分類されていたが、本総説はNETsという具体的な構造体とその構成成分（NE、CG、MMP-9、DNA骨格）が、がんの増殖、EMT、CTC捕捉、転移前ニッチ形成、免疫回避、血栓症という多段階のプロセスに直接関与する詳細な分子機序を明確にした。
新規性: 本総説は、NET-DNAの特異的受容体であるCCDC25の同定や、GSDMDを介した非典型的なNETosis経路、さらにはCDK4/6がNETs形成の必須ステップとして機能するという新規の知見を網羅的に整理し、がん生物学におけるNETsの重要性を本研究で初めて包括的に提示した。特に、NETsがCD8+ T細胞やNK細胞を物理的に遮断して免疫回避を駆動するカプセル化機構や、ECMのラミニン切断を介した休眠がん細胞の再活性化機構など、近年明らかになった画期的なコンセプトを統合した点は極めて独創的である。
臨床応用: これらの知見は、がん治療におけるNETs標的療法の臨床応用に向けた重要な概念的基盤を提供する。特に、すでに嚢胞性線維症などでFDA承認されている遺伝子組み換えDNase I（dornase alfa）の吸入療法や、アルコール依存症治療薬として承認されているdisulfiram（ジスルフィラム）によるGSDMD阻害作用の転用は、臨床現場における迅速なドラッグリポジショニングを可能にする高い臨床的意義を持つ。また、日本で承認されているNE阻害薬sivelestatの食道がん術後管理における有用性や、前臨床で有望視されているPAD4阻害薬（Cl-amidine、GSK484）は、がんの遠隔転移やがん関連血栓症を予防するためのtranslationalな新規治療オプションとなり得る。
残された課題: しかし、NETsを標的とした治療戦略の確立には、いくつかの残された課題（limitation）が存在する。第一に、NETsは生体防御において重要な役割を果たしているため、全身的なNETs阻害が患者の感染防御能を著しく低下させる懸念がある。第二に、がん細胞によるNETs誘導経路は多様であり、単一の阻害薬では十分な効果が得られない可能性があるため、CXCR2阻害薬と免疫チェックポイント阻害薬の併用など、マルチターゲット治療の最適化が今後の検討課題である。第三に、NETsの関与には臓器特異性（肝、肺、大網への転移では強いが、脳転移などでの役割は不明）があり、この不均一性の解明が求められる。さらに、体内におけるNETsの自然除去機構（マクロファージによるTREX1依存的分解など）が腫瘍局所でどのように障害されているかについても、今後の研究における重要な方向性として残されている。
方法
本総説は、好中球細胞外トラップ（NETs）のがん進展における役割と治療標的としての可能性について、2004年から2021年までに発表された学術文献を網羅的に調査・統合したナラティブレビューである。文献検索は、主要な学術データベースであるPubMed、Embase、Cochrane Library、およびWeb of Scienceを用いて実施された。検索式には、“neutrophil extracellular traps”、“NETs”、“NETosis”、“cancer”、“metastasis”、“tumor microenvironment”、“thrombosis”、“neutrophil proteases” などのキーワードおよびMeSH（Medical Subject Headings）用語を論理演算子（AND/OR）で組み合わせて使用した。選択基準として、NETsの分子機序、がんの増殖・転移・免疫微小環境・血栓症におけるNETsの関与、およびNETs標的治療に関する英語で執筆された査読付き原著論文およびレビュー論文を対象とした。一方、がん以外の疾患に特化し、がん病態との関連性が極めて低い文献や、重複するデータを含む文献は除外した。検索により抽出された文献から、NETsのシグナル経路、腫瘍由来のNETs誘導因子、NETs構成成分の機能、および前臨床モデルにおける治療効果に関する定量的データを抽出した。さらに、引用した個々の前臨床研究および臨床研究において用いられた統計解析手法（Kaplan-Meier 法による生存分析、log-rank 検定、Cox比例ハザード回帰モデル、Mann-Whitney U 検定、Fisherの直接確率検定など）についても、データの信頼性を評価するために精査した。特に、マウスモデルを用いた実験（n=10 mice/群などのサンプルサイズ）や、患者コホートにおけるハザード比（HR）および95%信頼区間（CI）の統計的有意性を確認した。さらに、本総説で議論される細胞株（MCF-7、4T1、CT26、HT-29、LS174T、BT-549、AsPC-1、D2.A1、D2.0R、A20、MC38）やマウスモデル（C57BL/6J、BALB/c、Pad4-null、MMTV-PyMT、RIP1-Tag2）の妥当性についても評価した。図表の作成にあたっては、Servier Medical Artの画像ライブラリ（CC BY 3.0ライセンス）を一部改変して使用し、視覚的な理解を助けるスキームを構築した。以上のプロセスを経て、NETsのがん生物学における位置づけを体系的に整理した。