- 著者: Jin Qian, Chenkai Ma, Quin T. Waterbury, Xiaofei Zhi, Christine S. Moon, Ruhong Tu, Hiroki Kobayashi, Feijing Wu, Biyun Zheng, Yi Zeng, Hualong Zheng, Yosuke Ochiai, Ruth A. White, David W. Harle, Jonathan S. LaBella, Leah B. Zamechek, Lucas ZhongMing Hu, Ryan H. Moy, Arnold S. Han, Bruce L. Daugherty, Seth Lederman, Timothy C. Wang
- Corresponding author: Timothy C. Wang (Columbia University Medical Center, New York, NY, USA, tcw21@cumc.columbia.edu)
- 雑誌: Cancer Cell
- 発行年: 2025
- Epub日: 2025-06-27
- Article種別: Original Article
- PMID: 40578360
背景
多形核骨髄由来抑制細胞 (polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells, PMN-MDSCs) は固形腫瘍において免疫チェックポイント阻害療法 (immune checkpoint inhibitor, ICI) への抵抗性を引き起こす主要因として確立されている。先行研究では、Veglia et al. NatRevImmunol 2021がMDSCの正規定義と多様性を整理し、Bronte et al. NatCommun 2018ではMDSC命名と特徴付け標準が提唱された。またCoffelt et al. Nature 2015はIL-17産生γδ T細胞と好中球が乳癌肺転移を促進することを示し、Szczerba et al. Nature 2019は好中球が循環癌細胞をエスコートし細胞周期進行を可能にすることを報告した。さらにKim et al. Nature 2022は腫瘍好中球のフェロトーシスが免疫抑制を駆動することを示した。CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4) は完全アゴニストCXCL12 (SDF-1, stromal cell-derived factor 1) とともに造血・免疫細胞の発生・遊走の中枢的制御因子であり、多くの固形腫瘍がCXCL12を過剰発現してPMN-MDSCを動員する。既存のCXCR4拮抗薬 (Plerixafor等) は臨床試験で限定的な効果に留まっており、CXCR4の正常な造血機能維持という必要性との均衡が課題であった。Trefoil factor 2 (TFF2) はTFFファミリーの分泌ペプチドとして同定されたCXCR4部分アゴニストであり、Tff2遺伝子は胃前癌病変でエピジェネティックにサイレンシングされ、その欠損はMDSCを増加させて癌増殖を促進する。何が足りなかったか：CXCR4部分アゴニズム戦略が固形腫瘍の免疫療法増強に有効かどうかは未検証であり、PMN-MDSC選択的標的化と骨髄granulopoiesis抑制を同時に達成するメカニズムベース療法は提示されていなかった。
目的
TFF2をマウス血清アルブミン (murine serum albumin, MSA) と融合させた安定化ペプチドTFF2-MSAを開発し、histidine decarboxylase (Hdc) -GFPマウスモデルを用いてPMN-MDSCをin vivo追跡しながら、TFF2-MSAの胃癌 (gastric cancer, GC) に対するCXCR4部分アゴニストとしての作用機序と抗PD-1療法との相乗効果を多モデルで検証することを目的とした。
結果
所見1：多モデルでの抗腫瘍効果と長期生存延長 (best track A: clinical-like in vivo synergy)：ACKP皮下移植モデル (n=10-12/group) でTFF2-MSA (22.5 mg/kg) +抗PD-1 (10 mg/kg) 併用療法は腫瘍増殖を顕著に抑制し、3/12例で腫瘍退縮を達成、単独療法はいずれも無効であった (Figure 1B-C)。生存期間中央値はvehicle 34日に対し併用群64日、TFF2-MSA+化学療法+抗PD-1群73日に延長 (P<0.0001、log-rank test、Figure 1D、n=14)。ACKP同所性胃移植モデルで併用療法が胃腫瘍の80%を根絶 (単独療法は0%、Figure 1E-F、n=5)。肝臓転移モデルでTFF2-MSA単独で転移を59%減少、併用で90%以上減少 (Figure 1G-H、n=5)、術後肺転移モデルで併用がほぼ完全に転移を消失させた (Figure 1I-J、n=6)。自然発生GCモデル (Mist1-CreERT; Cdh1flox/flox; LSL-RHOAY42C/Y42C; Hdc-GFP) では抗PD-1単独群が6ヶ月以内に全例死亡したのに対し、TFF2-MSA+抗PD-1群では80%が300日後も生存し組織学的GC陰性であった (Figure 1K-M、n=10、P<0.0001)。CT26大腸癌・Panc02膵癌・抗LAG-3抗体との組み合わせでも有効性が確認された (Figure S3、n=5-10)。
所見2：Hdc+ PMN-MDSC選択的減少とC2→C1サブセット比変化 (best track B: cohort_n + fold change)：Hdc-GFP+ PMNはCD45+CD11b+LY6G+LY6C-/low total PMNs中で核分葉不全 (1-3 lobes、bona fide PMN-MDSCマーカーCD14/CD84/CD300ld/JAML高発現) を示した (Figure 2A-B、n=3 mice pooled)。Imaging flow cytometryでHdc+ PMNはT cell proliferation阻害がHdc- PMNより強く (Figure 2C、3 independent experiments)、arginase 1とinducible NO synthase (iNOS) 依存性であった (Figure S4C)。TFF2-MSA治療により腫瘍内Hdc+ PMN-MDSCsは対照比約2-fold減少 (1/3減、p<0.0001、Figure 2D-E、n=6 biological replicates)。scRNA-seq解析で腫瘍PMNを2サブセット (C1: 抗原提示Cd74+H2k1+/interferon-stimulated genes [ISGs] Cxcl10/Ly6e陽性・免疫賦活的、C2: PMN-MDSCマーカーSlfn4/Cd84/Cd14陽性・ECMリモデリング・前腫瘍的) に分類し、TFF2-MSAはC1/C2比をC1優位へシフトした (Figure 2H-K)。RNA velocity解析で直接的C2→C1変換ではなく新規C2産生抑制が主要機序と示唆された (Figure S6G)。
所見3：CXCR4部分アゴニスト機序の機械的確認 (best track C: dose-response correlation)：K562-HiBiT-CXCR4 reporter細胞でTFF2-MSAとそのhuman版TFF2-HSAは用量依存的CXCR4内在化を誘導したが、完全アゴニストCXCL12より有意に弱かった (Figure S7E)。Chemotaxis assayでHdc+ PMNに対しTFF2-MSAはbell-shaped concentration-response curve (典型的partial agonist特性) を示し、低濃度で誘引・高濃度で抑制した (Figure S7F-G)。PI3K-AKT解析でTFF2-MSAはCXCL12誘発AKT過活性化を阻害しつつ単独では弱いAKT活性化を維持した (Figure S7H)。LysM-Cre; Cxcr4flox/floxマウスで骨髄系CXCR4欠損は併用療法の腫瘍抑制効果を完全に消失させ、TFF2-MSAの主要標的が骨髄系CXCR4であることが遺伝学的に確認された (Figure S7K-L、n=5)。GC mouse modelの血液・腫瘍内で高CXCL12濃度が確認され (Figure S7I-J)、dysregulated CXCL12-CXCR4 axisが治療標的として妥当であることが示された。
所見4：CD8+ T細胞応答回復と相乗効果の機序：TFF2-MSA+抗PD-1は腫瘍内CD8+ T細胞を優先的に増加させ (CD4・Treg増加なし、Figure 3A、n=5)、tumor core CD8+浸潤を約3-fold増強した (Figure 3B-C、n=10 random fields)。Tim3+/Tim3- Granzyme B+ cytotoxic CD8+ T細胞、Ki67+増殖CD8+、IFNγ+TNFα+ multifunctional CD8+全てが併用群で著明に増加 (Figure 3D-F)。scRNA-seqでCD8+ T細胞6サブクラスター中、cluster 3/4/5 (cytotoxicとprogenitor-like) が併用群で顕著に増加した (Figure 3G-J)。NSGおよびRag1-/-マウスで併用療法効果が完全消失 (Figure 3K-L)、抗CD8抗体投与で腫瘍抑制が完全に消失 (Figure 3L、n=10)、CD8+ T細胞がkey effectorであることが確認された。IFNγ・IL12・CXCL10いずれかの中和も併用効果を逆転させ (Figure 3M)、CD8+ T cell・IL12+ dendritic cell・CXCL10+ C1 PMNの3者連携が機序であることが示された。
所見5：骨髄granulopoiesis抑制と患者データの臨床相関：TFF2-MSAは血液・脾臓のHdc+ PMN-MDSCも腫瘍と同様に減少させた (Figure 4A-D、n=5-6)。脾臓PMNのscRNA-seqでtumor-free対照と比較すると、tumor-bearing miceでC2サブセット (S100a8/9、Xbp1、Cd14陽性、immaturity signature: Ngp/Camp/Lcn2/Ltf/Cd177/BM proximity score高値) が拡大、TFF2-MSA・併用治療でC2を縮小しCd101/Csf3r/Cxcr2 (maturation markers) を上昇させ、tumor-freeに近いプロファイルへ回復した (Figure 4E-H、Table S3)。GC患者cohortでCXCR4+LOX-1+ low-density neutrophil (PMN-MDSC様) の増加と循環TFF2レベル低下が有意に逆相関し (Spearman r、P<0.05)、動物モデル所見の臨床的関連性が確認された。
考察/結論
本研究はCXCR4部分アゴニズムという新規なコンセプトを固形腫瘍の免疫療法増強に応用した本研究で初めての研究である。TFF2-MSAはCXCR4完全アゴニストCXCL12の過剰シグナルを競合的に減弱させながら弱いCXCR4活性化を維持することで、既存のCXCR4拮抗薬が引き起こす造血恒常性の破壊 (代償性PMN-MDSC過産生) を回避しつつPMN-MDSCを選択的に抑制する。先行研究との違い：Veglia et al. NatRevImmunol 2021やBronte et al. NatCommun 2018はMDSC命名・分類フレームワークを提唱したものの、選択的標的化戦略は提案されていなかった。CXCR4拮抗薬 (Plerixafor等) の臨床試験 (KEYNOTE-A36等) では限定的効果に留まっていた点と異なり、本研究は部分アゴニスト戦略がhematopoietic homeostasis維持と腫瘍内PMN-MDSC抑制を両立可能なバランスを実現することを示した点で対照的である。新規性：(1) CXCR4部分アゴニズムによるPMN-MDSC選択的抑制というこれまで報告されていないメカニズムを確立、(2) Hdc-GFP reporterによるin vivo PMN-MDSC追跡というnovel技術を組み合わせ、(3) C1 (immunostimulatory) vs C2 (immunosuppressive) という腫瘍PMNサブセット分類を機能的に検証、(4) 自然発生RHOA Y42C diffuse-type GCモデルで80%の300日生存という新規の長期効果を実証した。臨床応用：TFF2-MSAのヒト版TFF2-HSAはTonix Pharmaceuticalsで開発中であり、抗PD-1療法抵抗性GC・大腸癌・膵癌へのbench-to-bedside展開が直近の選択肢である。循環TFF2低値とCXCR4+LOX-1+ low-density neutrophil高値という患者バイオマーカーが同定された点も臨床的有用性が高く、患者選択戦略に直結するtranslational意義を持つ。残された課題：(1) TFF2-HSA第I/II相試験での安全性・薬物動態の今後の検討、(2) 最適投与スケジュール・併用パートナー (anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-LAG-3, anti-TIGIT) の最適化、(3) ヒトHdc+ PMN-MDSC同定マーカーの確立 (マウスHdcはヒトでは異なる発現プロファイル)、(4) 非GI固形腫瘍 (肺癌、メラノーマ、腎癌) への適応拡大のfuture展望、(5) Plerixafor等既存CXCR4拮抗薬の失敗を回避するlimitationとして、TFF2-MSA投与時期と用量の精密制御が必要、が残された課題として残されている。本研究はメカニズム発見からモデル検証・患者データ統合まで一気通貫し、CXCR4部分アゴニズムを次世代免疫療法アジュバントへと押し上げる科学的・臨床的根拠を提示した。
方法
遺伝子改変マウス株 (mouse strains)：Hdc-GFP transgenicマウス (ヒスタミン脱炭酸酵素発現細胞をGFPで標識、PMN-MDSCを生体内追跡)、Cxcr4-GFP reporterマウス、LysM-Cre; Cxcr4flox/flox (骨髄系限定的Cxcr4欠損)、Mist1-CreERT; Cdh1flox/flox; LSL-RHOAY42C/Y42C; Hdc-GFP (自然発生diffuse-type GCモデル)、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)、Rag1-/- (適応免疫欠損)、BALB/c (CT26モデル用)、C57BL/6J (Panc02モデル用)。癌細胞株 (cell lines)：ACKP (Atp4bCre; Cdh1-/-; LSL-KrasG12D/+; Trp53-/-由来GC細胞)、PC (Trp53-/-; human CCNE1過剰発現organoid)、K562 (ヒト骨髄性白血病細胞株、内因性CXCR4欠如) にHiBiT-tagged CXCR4を導入したreporter細胞。腫瘍モデル：ACKP皮下移植 (Hdc-GFP host、初期腫瘍体積150-250 mm^3で治療開始)、ACKP-luciferase同所性胃移植 (胃粘膜下層注入、7日後治療開始)、ACKP門脈注射肝臓転移モデル、ACKP皮下腫瘍切除後の自然発生肺転移モデル、Mist1-CreERTタモキシフェン誘導diffuse-type GC自然発生モデル (8ヶ月後GC確立)。介入薬：TFF2-MSA融合ペプチド (22.5 mg/kg)、抗PD-1抗体 (10 mg/kg)、抗LAG-3抗体、5-FU+oxaliplatin化学療法、を3日毎i.p.投与。解析手法：scRNA-seq (10x Genomics) でACKP腫瘍CD45+細胞・脾臓LY6G+ PMNを解析、imaging flow cytometry (ImageStream) で核分葉計数、bioluminescence imagingで同所性腫瘍経時測定、H&E染色で病理組織評価、flow cytometryでCD11b/LY6G/LY6C/CXCR4/CD101/Hdc-GFP/CD8/CD4/Treg/Granzyme B/TNFα/IFNγを定量、PI3K-AKTシグナル解析、chemotaxis assay (Transwell)、RNA velocity解析。統計：two-way ANOVA、one-way ANOVA、log-rank test、Wilcoxon検定をGraphPad Prismで実施、P<0.05を有意とした。胃癌患者cohort (n>30) で循環TFF2とCXCR4+LOX-1+ low-density neutrophilを相関解析。