- 著者: Ricardo Grieshaber-Bouyer, Felix A. Radtke, Pierre Cunin, Giuseppina Stifano, Anais Levescot, Brinda Vijaykumar, Nathan Nelson-Maney, Rachel B. Blaustein, Paul A. Monach, Peter A. Nigrovic, ImmGen Consortium
- Corresponding author: Peter A. Nigrovic (Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA)
- 雑誌: Nature Communications
- 発行年: 2021
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 34001893
背景
好中球は感染防御・組織修復・がん・冠動脈疾患・自己免疫といった多面的病態に関与する自然免疫エフェクター細胞で、核形態・顆粒内容物・浮遊比重・表面マーカー・遊走能・貪食能・抑制機能のいずれにおいても極めて多様な表現型を呈する。一方で T 細胞や NK 細胞のように離散的サブセットが系統樹的に確立した他の白血球とは異なり、好中球では成熟・priming・activation という重層的バックグラウンドの中から「真の subtype」を切り出す方法論が存在しなかった (Evrard et al. Immunity 2018)。
この問いは治療戦略に直結する。好中球を一括して枯渇させる治療は感染防御も同時に損なうため臨床応用に乏しいが、もし病的サブセットが定義できればそれを選択的に標的化できる可能性がある (Fridlender et al. CancerCell 2009, Giese et al. Blood 2019)。single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) は数千細胞同時の transcriptome プロファイリングで集団内構造をバイアスなく検討できる強力な手法だが、好中球は他白血球に比べ RNA 含量が乏しく、droplet 系での discrete clustering が parameter 依存で不安定化する技術的困難があった。先行する scRNA-seq 研究は骨髄での発達初期 (Evrard et al. Immunity 2018) や腫瘍・感染という限定的条件下の解析にとどまり、健常な骨髄・血液・脾臓・炎症組織を横断する好中球連続性の全貌は明らかでなかった (Xie et al. NatImmunol 2020)。これまでに足りなかったのは、(a) 健常 3 組織 (骨髄・血液・脾臓) と複数炎症組織 (関節・肺・腹腔) を同一プラットフォームで横断する大規模 scRNA-seq データ、(b) UMAP/Leiden 以外の多次元削減法 (diffusion map・Monocle 3・principal curve) を並走させたクラスター安定性の検証、(c) chronological 順序を RNA velocity と in vitro 同期分化で 2 重に validate する experimental confirmation の 3 点で、これらの gap を埋める systematic 解析が課題として残されていた。
目的
ImmGen consortium の枠組みで健常マウスの骨髄・血液・脾臓および 3 種類の sterile inflammation モデル (K/BxN 関節炎の関節と血液、IL-1β 肺炎、IL-1β 腹膜炎) から 17,000 超の好中球の scRNA-seq を実施し、(1) 好中球集団が離散的サブセットの集合 vs 単一連続スペクトラムのどちらで最もよく記述されるか、(2) 連続体であるならばその発達順序と transcription factor (TF) 制御プログラムは何か、(3) 炎症組織への動員に伴う転写変化は新規 subtype の生成か既存連続体への重ね書きかを明らかにすることを目的とした。
結果
所見1: UMAP cluster 数が parameter 依存で 3-23 と不安定、離散構造は同定不能：UMAP+Leiden clustering で k と resolution を生理的範囲で振ると 3-23 個の cluster が yield され、離散的サブセット数として安定した結論が出なかった (Fig. 1b, Supplementary Fig. 3a)。便宜的に採用した 4-population model では P1 (granule 遺伝子 Chil3, Camp, Lcn2, Ltf, Mmp9 高発現) → P4 (成熟マーカー Csf3r, Il1b, Ccl6 高発現) という発達様パターンが見えたが、tissue 分布は P1-P3 が骨髄優位、P4 が血液/脾臓優位で (Fig. 1d-e)、cluster の境界はあくまで人為的閾値の産物であった。P1 (全体の 1.66%) は G2M 期 cell が多く、転写多様性が最も高く、preNeu marker gene score が最も高かった (Fig. 1f-h)。preNeu 頻度は骨髄 3.55%、脾臓 1.01%、血液 0.10% で (Fig. 1i)、proliferation-competent な好中球前駆細胞が骨髄に局在することを再確認した。
所見2: Diffusion map と RNA velocity で単一連続体「neutrotime」を同定、分岐は検出されず：cell-cell transition probability に基づく diffusion map では好中球が単一の連続スペクトラムとして配置され、一端 (低 neutrotime) に preNeu と未成熟骨髄好中球、対極 (高 neutrotime) に成熟血中好中球が位置した (Fig. 2a-b)。RNA velocity vector field は preNeu → 未成熟 → 成熟という一方向 progression を unambiguous に支持し (Fig. 2e)、Hoxa9-Lyz cell の in vitro differentiation 時系列 (96-120 h) でも Camp/Chil3/Serpinb1 減少 + Il1b/Ccl6/Junb 増加という neutrotime と同方向の変化が確認された (Fig. 2f)。Monocle 3 (発達分岐検出に特化) は支配的な branch を 1 つも検出せず (Supplementary Fig. 5a)、principal curve との Spearman correlation は 0.955 と高一致を示した (Supplementary Fig. 5c)。Cell density distribution には 3 つの accumulation peak (preNeu/immature marrow/mature blood) が見え、Hartigan’s Dip Test は連続体上での multimodal 分布を支持した (Supplementary Fig. 5d)。Neutrotime の急峻な遷移は preNeu → 未成熟 と 成熟骨髄 → 血中 の 2 箇所に存在した (Fig. 2g)。
所見3: ChEA3 解析で early/late neutrotime が異なる TF module で駆動されることを同定：neutrotime と Spearman correlation ≥ 0.25 で正相関する 48 遺伝子と ≤ -0.25 で負相関する 66 遺伝子を identify し、上位 50 遺伝子ずつの heatmap で発現が急峻 breakpoint なく連続変化することを示した (Fig. 3a-b)。Gene Ontology では early neutrotime が代謝 + defense response 関連、late neutrotime が environment 応答 + 免疫応答 + gas transport に偏り、GSEA でも granule loading (early) → effector process (late) という transition が confirmed された (Fig. 3d-f)。ChEA3 解析で early neutrotime は C/EBPε (Cebpe) と lactoferrin (Ltf、二次顆粒蛋白だが TF 活性を持つ) で駆動され、late neutrotime は ATF3、KLF2、C/EBPβ (Cebpb)、JUNB、JUND が支配的であった (Fig. 6c-e)。これは Cebpe-KO で好中球成熟が停止する既報の遺伝学的データと整合した。
所見4: Human bone marrow neutrophil (N=7,049) でも neutrotime gene signature が conserved：100 遺伝子の simplified neutrotime-S score を構築し、full neutrotime と Spearman correlation 0.905 で converge することを示した上で (Fig. 5b)、Evrard et al. Immunity 2018 の bulk RNA-seq populations を neutrotime-S 軸上に投影すると preNeu → 未成熟 → 成熟骨髄 → 成熟血中 の順に整列した (Fig. 5c)。成熟骨髄と成熟血中の間には 981 遺伝子の発現差があり (FDR<0.05、log2FC≥1)、血中で Il1b up + Lcn2/Retnlg/Ly6g down という最終分化が確認された。Human Cell Atlas 由来 bone marrow scRNA-seq (N=7,049 neutrophil) で 1:1 ortholog に変換した early/late neutrotime score を計算したところ、マウスと同様の連続体 pattern が再現された (Fig. 5e-g)。
所見5: 炎症組織好中球はコア neutrotime を保持しつつ部位/刺激特異的 program を上乗せ：3 種の炎症モデルから合計 N=4,246 細胞 (関節 801 + 関節炎血液 2,791 + 肺 287 + 腹腔 367) を解析し、PCA で炎症好中球が「acute IL-1β (肺/腹腔) 方向」と「subacute K/BxN (関節) 方向」の 2 方向に polarize することを示した (Fig. 7b)。Neutrotime-S 比較では関節好中球が最も成熟 (0.647±0.001)、健常血中 (0.639±0.003) > 関節炎血中 (0.585±0.003) で、炎症時に未成熟好中球が早期 release されることが示唆された。3 炎症組織共通の up-regulation 遺伝子に Cd14, Cxcl2, Ccl4, Ccl3, Irg1, Fth1, Il1r2, Il1rn が含まれ、part-specific には肺 vs 腹腔で 224 遺伝子の差 (FDR<0.01、log2FC≥0.25) が検出された (Fig. 7d)。Chemokine receptor では肺/腹腔/血中で Cxcr2 優位、関節で Cxcr4 優位という対照的 pattern を示し (Fig. 7f)、後者は炎症組織への好中球 retention を担う既報の機能と整合した。ChEA3 解析で炎症組織には Cebpb (emergency granulopoiesis の hallmark)、NFKB1、RELB、ATF3 などが活性化していた (Fig. 8b-d)。
考察/結論
本研究は scRNA-seq 17,000 細胞超の解析という規模と、UMAP/diffusion map/Monocle 3/PCA-principal curve という 4 種類の独立次元削減手法の収束を根拠に、「好中球は離散サブセットの集合ではなく単一発達連続体 (neutrotime) として組織化される」という新規パラダイムを確立した。これまでの好中球分類は形態 (banded vs segmented)、密度 (低密度 vs 高密度)、表面マーカー (TAN N1/N2、MDSC) などの離散カテゴリーに依拠していた (Fridlender et al. CancerCell 2009) のと対照的に、本研究は転写プロファイル空間で「主系列 (main sequence)」を提示し、観察される多様性のほとんどが maturational axis 上の位置と環境刺激による偏差の組合せで説明できるとした。これまでの先行研究との違いとして、Evrard et al. Immunity 2018 は骨髄内 3 集団 (preNeu/immature/mature) を sort+bulk RNA-seq で discrete に定義したが、本研究は scRNA-seq + diffusion map で同じ集団が連続体上の accumulation peak であることを示し、Xie et al. NatImmunol 2020 が graph-based clustering で「maturity stage を bypass する」discrete subset を示唆したのと相違して、本データでは discontinuity は検出されなかった。
新規性は (a) 拡散マッピング + RNA velocity + Monocle 3 + PCA-principal curve の 4 戦略を並走させて「分岐の不在」を多角的に証明した点、(b) Hoxa9-Lyz cell の in vitro 同期分化系列で neutrotime の chronological 性を experimental に検証した点、(c) ChEA3 解析で early/late neutrotime を駆動する TF を C/EBPε + Ltf (early) と C/EBPβ + ATF3 + KLF2 + JUNB + JUND (late) として specific に同定した点、(d) 炎症好中球を「新規 subtype」ではなく「成熟連続体への部位特異的 transcriptional overlay」として概念化した点にある。これまで報告されていない preNeu → 未成熟 → 成熟血中 の 2 段階急峻遷移 (sharp increment) の存在も初めて定量化された。
臨床応用面では、好中球の病的機能を選択的に標的化したい場合、「サブセット枯渇」よりも「neutrotime 上の特定位置 + 部位特異的 program 阻害」という二次元的アプローチが必要となる。特に Cxcr4 経路を関節炎好中球に対する標的とする方針 (Qian et al. CancerCell 2025 の腫瘍領域での CXCR4 partial agonist 戦略にも通底)、IL-1 受容体経路 (Il1r2, Il1rn) の自然な抗炎症 module を強化する方針、emergency granulopoiesis を駆動する Cebpb を一時的に抑制する方針などが、neutrotime framework から臨床的有用性として導出可能となる。腫瘍関連好中球についても本連続体 framework は単一細胞解析の解釈基盤となり、後続の NSCLC neutrophil atlas (Salcher et al. CancerCell 2022) や CHI3L3+ immature neutrophil 研究 (Shi et al. CancerCell 2025) の理論的下敷きとなった。
残された課題: (1) マウス中心の解析で、ヒト末梢血/腫瘍/感染病巣での neutrotime の精密検証は今後の検討に委ねられる。(2) 各 TF (特に Ltf の TF 機能) の好中球発達への必須性を遺伝学的に検証する必要があり、Ltf-KO マウスでは early development は正常で respiratory burst のみ障害という限定的表現型から、redundancy が予想される。(3) Transcript vs protein expression の相関が CD9/CD14/CD53/CD63/Itgam/Cxcr2/Cxcr4/Ly6g の 8 遺伝子で highly variable (Supplementary Fig. 11) であり、scRNA-seq から機能を外挿する際の限界を示しており、CITE-seq などの protein 同時計測との統合が今後の課題である。(4) 炎症組織での site-specific program (肺 vs 腹腔の 224 遺伝子差) の機能的意義 (感染防御 vs 組織障害) を loss-of-function で検証する必要がある。
方法
6-8 週齢の雄性 C57BL/6 マウス (Jackson Laboratory) を 2 独立実験で使用し、心臓穿刺による末梢血、大腿骨/脛骨フラッシュによる骨髄、機械的破砕による脾臓細胞から Ly6G+CD11b+ 好中球を FACS sort して 10X Genomics platform で droplet-based scRNA-seq を実施した (健常検体合計 N=12,672 細胞、tissue ごとに N=3 マウスを pool、各 tissue で 2 独立実験を実施)。Hashtag oligonucleotide を用いた multiplex で複数条件を同一 lane に載せ batch effect を最小化した。249 個の ImmGen reference population に対する multinomial mapping で contaminating lineage を除外し、ミトコンドリア転写産物 >5%、転写産物数 >99%ile/<1%ile を quality filter で除去後、血液 4,985 細胞、骨髄 4,504 細胞、脾臓 3,183 細胞 (median 1,455 UMI/515 gene per cell) を保持した。発現遺伝子は 10,900 種から residual variance >1.3 で 3,322 種に絞り込んだ。
次元削減は (a) UMAP clustering (PC1-20、k=20/100/500、resolution=0.3/0.8/1.5 のパラメータ振り、3-23 cluster を yield)、(b) diffusion map (cell-cell transition probability ベース、分岐に敏感)、(c) Monocle 3 (graph-based trajectory)、(d) PCA + principal curve の 4 戦略を並走させた。Chronological 順序の検証は scvelo による RNA velocity (spliced/unspliced mRNA 比) と、conditional Hoxa9 過剰発現により myeloid progenitor stage で reversibly immortalize した Hoxa9-Lyz-GFP 細胞の bulk RNA-seq による in vitro differentiation 時系列 (96-120 h) で実施。Pre-neutrophil (preNeu) は Evrard et al. Immunity 2018 の sorted-population bulk RNA-seq (GEO:GSE109467) との gene signature 照合で同定した。TF 制御は ChIP-X Enrichment Analysis Version 3 (ChEA3、ENCODE/ReMap/ARCHS4/GTEx/Enrichr/literature 統合) で推定した。Human neutrophil 検証は Human Cell Atlas 由来 bone marrow scRNA-seq (N=7,049 neutrophil) で実施した。炎症モデルは K/BxN serum 150 µL の i.p. 投与 day 0/2 → day 7 採取 (関節と末梢血)、IL-1β 25 ng の i.n. 投与 3 h 後の BAL (pneumonitis)、IL-1β 25 ng の i.p. 投与 3 h 後の腹腔洗浄 (peritonitis)。動物実験は Brigham and Women’s Hospital IACUC (#2016N000535) 承認下で実施した。