- 著者: Catherine Sabatel, Coraline Radermecker, Laurence Fievez, Geneviève Paulissen, Svetoslav Chakarov, Claudia Fernandes, Sabine Olivier, Marie Toussaint, Dimitri Pirottin, Xue Xiao, Pascal Quatresooz, Jean-Christophe Sirard, Didier Cataldo, Laurent Gillet, Hicham Bouabe, Christophe J. Desmet, Florent Ginhoux, Thomas Marichal, Fabrice Bureau
- Corresponding author: Thomas Marichal (t.marichal@uliege.be); Fabrice Bureau (fabrice.bureau@uliege.be) — Laboratory of Cellular and Molecular Immunology, GIGA Institute, University of Liège, Belgium
- 雑誌: Immunity
- 発行年: 2017
- Epub日: 2017-03-21
- Article種別: Original Article
- PMID: 28329706
背景
アレルギー性喘息の有病率は過去数十年間で増加しており、環境の変化がその一因であると広く認識されている (Eder et al. 2006)。この現象を説明する主要な仮説の一つが「衛生仮説 (hygiene hypothesis)」である。この仮説は、農村部や微生物が豊富な環境で育った小児のアレルギーおよび喘息罹患率が低いという疫学的観察に基づき、細菌への早期曝露がアレルギー性炎症に対する防御機構を誘導する可能性を提唱している (Strachan 1989)。実際、疫学研究では、農場で育つこと、特に細菌性エンドトキシン (LPS) への曝露が多いことが、アレルギー感作のリスク低減と関連していることが示されている (Braun-Fahrländer et al. 2002)。しかし、LPSがこれらの保護効果を媒介するかどうかは不確かであり、非農村環境での研究では、LPS曝露が喘息の有病率と重症度を増加させるリスク因子である可能性も示唆されている (Thorne et al. 2005)。また、LPSが動物モデルにおいて喘息を促進することも報告されており (Eisenbarth et al. 2002; Hammad et al. 2009)、その保護効果のメカニズムは未解明な点が多い。
細菌由来の非メチル化CpG DNA (CpG) は、微生物が豊富な環境による保護効果を媒介するもう一つの有力な候補である。CpGは、LPSと同様に、農家の埃に高濃度で存在し (Roy et al. 2003)、合成CpG DNA (CpG-ODN) の投与は、動物モデルにおいて一貫してアレルギー感作を予防することが示されている (Kline et al. 1998)。さらに、CpGは確立された喘息を動物で回復させることができ (Broide et al. 1998)、ヒトの臨床試験でもアレルギー性疾患の軽減に有効性が示されている (Beeh et al. 2013)。しかし、CpGがこれらの免疫調節効果をどのように発揮するのかは、その細胞および分子メカニズムが未解明な点が多かった。当初は、CpGがアレルゲン特異的なTh2細胞応答をTh1または制御性T細胞応答へと方向転換させると提案されていたが、CpGはアレルゲン非存在下でも保護効果を発揮できることから、適応免疫系とは独立して作用する可能性も示唆されていた (Krieg 2012)。
2009年、我々はマウスの肺間質に少数の制御性マクロファージ集団 (肺間質マクロファージ; IMs) を同定した (Bedoret et al. 2009)。これらのIMsはヒトにも存在し (Hoppstädter et al. 2010)、免疫抑制性サイトカインであるインターロイキン-10 (IL-10) を自発的に産生する。IMsは低用量のLPSに曝露されると、肺樹状細胞 (DC) のTh2応答誘導能力を打ち消すことができるが、高用量のアレルゲンとLPSに曝露されると、その免疫抑制効果は圧倒される。したがって、LPS以外の病原体関連分子パターン (PAMP) がIMsの免疫抑制効果を増強し、微生物が豊富な環境が喘息のリスクを低減するメカニズムを説明する可能性が考えられた。本研究の開始時点では、CpG DNA曝露がアレルギー性気道炎症を抑制する機構において、どの細胞集団が保護機構の中心であるかは確定していなかった。特に、肺IMsとCpGの関連性は未検証であり、この分野における知識ギャップが残されていた。
目的
本研究の目的は、細菌由来のCpG DNA曝露がアレルギー性気道炎症を抑制するメカニズムを解明することである。具体的には、CpG曝露によって関与する肺マクロファージサブセットを同定し、その保護効果の因果関係と分子機構 (IL-10依存性) を養子移入および遺伝学的操作によって確立する。さらに、CpG誘導性肺間質マクロファージ (IMs) の起源と肺への輸送経路を明らかにすることも目的とした。これにより、衛生仮説の細胞・分子基盤を確立し、慢性呼吸器疾患における新たな治療標的を特定することを目指した。
結果
CpG曝露によるTLR9依存的な制御性肺IMsの顕著な拡大: C57BL/6 WTマウスにCpG DNAを鼻腔内 (i.n.) 投与すると、肺間質マクロファージ (IMs) の数が7日後に平均1.7 x 10⁶ cellsに達し、定常状態のIMsと比較して42.5-foldに顕著に増加した (p<0.001)。このIMsの拡大は用量依存的であり、投与後72時間でピークに達し、1-2週間でベースライン値に復帰した。CpG-ODN以外のTLRリガンド (LPS, poly I:Cなど) やインフルエンザAウイルス、肺炎球菌感染では同等の効果は観察されず、この現象はTLR9を介したシグナル伝達に特異的であることがTlr9⁻/⁻マウスを用いた実験で確認された (p<0.001)。肺胞マクロファージ (AMs) の数はCpG処理後も変化せず、LPS処理後にわずかに増加するのみであった (Figure 2B, 2C, S2H, S2I)。CpG誘導IMsは、定常状態IMsと比較して、マクロファージの活性化と分化に関与する遺伝子 (c-MYCターゲット、mTORC1やNOTCHシグナル伝達によってアップレギュレートされる遺伝子など) の有意な濃縮を示し、CD11bとCD115の発現が上昇し、CD62L、SiglecF、CD169の発現が低下するという独特の表現型を獲得した (Figure 2D, 2E, S2J)。
CpG誘導IMsにおけるIL-10産生の大幅な上昇と制御性機能の獲得: IL-10β-ラクタマーゼレポーター (ITIB) マウスを用いた解析により、CpG投与後の肺IMsにおけるIL-10陽性細胞の割合がベースラインと比較して増加し、IL-10産生IMsの総数は55-foldに増加した (p<0.001)。さらに、CpG誘導IMsにおけるIL-10の発現レベルは定常状態IMsと比較して著しく高く、肺におけるIMs由来IL-10の総量はCpG処理後に550-foldに増加した (Figure 2F, 2G)。CpG誘導IMsは、Arg1やIL-1Raなどの制御性マクロファージのシグネチャーも発現し、M2様抗炎症性極性化を示すことが明らかになった。LPS刺激ではこのようなIL-10産生増強は認められなかった。これらの結果は、CpG曝露がIMsの数だけでなく、その機能的な免疫抑制能力も大幅に強化することを示している。
CpG誘導IMsによるHDM誘発性アレルギー性気道炎症の防御: CpG前投与を行ったn=16 miceの群では、HDM感作後の気道好酸球浸潤、Th2サイトカイン (IL-4, IL-5, IL-13) 産生、血清IgEレベル、気道過敏性 (AHR)、気管支周囲炎症、粘液産生を全て有意に抑制した (p<0.01-0.001)。この保護効果はTlr9⁻/⁻マウス (n=6 mice) では観察されず、CpGのTLR9依存性を示唆した (Figure 3B-3G)。さらに、CpG誘導IMsをナイーブマウス (n=8 mice) に気管内移入すると、HDMアレルギー反応が有意に抑制された (p<0.01) が、AMsの移入では効果がなかった。この結果は、CpG誘導IMsがアレルギー性気道炎症に対する保護の十分なメディエーターであることを直接的に証明している (Figure 3K-3N)。
保護効果のIL-10依存性の遺伝学的証明: Il10⁻/⁻ドナー由来のCpG誘導IMsを養子移入したマウス (n=8 mice) では、アレルギー性気道炎症に対する保護効果が完全に消失した。一方、野生型IMsの移入では保護効果が維持された。また、IL-10中和抗体の投与によってもCpGの保護効果が減弱したことから、IL-10がCpG誘導IMsによる保護効果に必須のエフェクターサイトカインであることが確立された (Figure 3J-3N)。これらのデータは、CpG誘導IMsがIL-10を介してアレルギー性炎症を抑制するという、衛生仮説の細胞・分子基盤を明確に示している。
確立された喘息に対するCpG誘導IMsの免疫治療効果: CpGは確立された喘息に対しても治療効果を示すことが知られている。HDM感作マウス (n=16 mice) にCpGを投与すると、気道過敏性、好酸球性炎症、HDM特異的Th2応答、粘液産生、DC活性化が有意に減少し、これらの効果はTlr9⁻/⁻マウス (n=6 mice) では認められなかった (Figure 4B-4I)。CpG誘導IMsの養子移入も、HDM感作マウス (n=8 mice) のアレルギー性気道炎症を著しく軽減したが、AMsやIl10⁻/⁻CpG誘導IMsの移入では効果がなかった (Figure 4K-4N)。CpG誘導IMsの拡大と免疫治療効果は、CpG投与後8週間まで持続することが示された (Figure S4E-S4L)。
CpG誘導IMsのCCR2非依存的な単球由来の起源: CpG誘導IMsの起源を調べるため、まずIMsの増殖能を評価したが、CpG処理後にEdU陽性IMsの割合は増加せず、局所増殖がIMs拡大の主要因ではないことが示唆された (Figure 5A)。驚くべきことに、Ccr2⁻/⁻マウス (n=12 mice) におけるCpG誘導IMsの数はわずかに減少するのみであり、LPS誘導IMsの数が大幅に減少したのとは対照的であった (Figure 5B, S5A)。この結果は、CpG誘導IMsが主にCCR2非依存的に動員される単球から発生することを示唆している。混合骨髄キメラマウスを用いた実験では、CpG処理後のIMsの拡大は、CD45.2+ Ccr2⁻/⁻ドナー細胞の著しい濃縮と関連しており、これはCCR2非依存的な前駆細胞からの発生を強く支持するものであった (Figure 5D-5F)。
肺および脾臓の単球がCpG誘導IMsの前駆細胞であることの同定: 我々は、肺に浸潤するCCR2非依存的な古典的単球を「肺単球」と定義した。Parabiosis実験および混合骨髄キメラ実験により、肺単球がCCR2非依存的に循環細胞によって継続的に補充されることが確認された (Figure 6B-6E)。CpG処理後のIMsの出現動態を解析すると、Ly6C hi CD64 lo細胞からLy-6C lo CD64 hi細胞への分化パターンがWTおよびCcr2⁻/⁻マウスの両方で観察され、肺単球がCpG誘導IMsに分化する可能性が示唆された (Figure 6F)。FACSで分離した肺単球はAMsやIMsよりも高いTlr9発現を示し、CpG刺激に応答してErkキナーゼのリン酸化が増加した (Figure 6G, 6H)。Ex vivoでのCpG処理は肺単球の生存を促進し、in vivoと同様の分化パターンを誘導した (Figure 6I, 6J)。この分化はTLR9依存的であった (Figure S6C)。
CpG処理後1日目の肺Ly6C hi細胞数および7日目のCpG誘導IMs数は、定常状態の肺単球数を大幅に上回っていた (Figure 6K, 5B)。EdU取り込みの増加は検出されなかったため、CCR2非依存的な単球が遠隔の貯蔵庫から動員され、CpG誘導IMsに分化する可能性が考えられた。興味深いことに、脾臓はCCR2非依存的な単球の貯蔵庫であることが示されており、脾臓単球も高いTlr9発現を示し、ex vivoでCpG刺激に応答してCpG-IMs様細胞に分化することができた (Figure 7A, 7B)。i.n.CpG処理後1日目には、脾臓単球数が有意に減少し、肺のLy6C hi単球数が増加した (Figure 7C, 7D)。脾臓摘出術を行ったCcr2⁻/⁻マウス (n=6 mice) では、肺単球およびCpG誘導IMsのプールが有意に減少したことから、脾臓がCCR2非依存的に肺に単球を供給し、CpG誘導IMsに分化させる貯蔵庫であることが示された (Figure 7E, 7F)。これらの結果は、CpGがCCR2非依存的な単球を動員し、肺特異的なシグナルがそれらの単球を肺に定着させ、制御性IMsへと分化させることを示唆している。
考察/結論
本研究は、細菌由来のCpG DNA曝露が、IL-10産生性の制御性肺間質マクロファージ (IMs) を拡大させることで、アレルギー性気道炎症を抑制するメカニズムを明らかにした画期的な論文である。この知見は、農村環境での喘息罹患率が低いという衛生仮説の細胞・分子基盤を提供し、微生物が豊富な環境が喘息から保護するメカニズムの枠組みを提示する。
新規性: 本研究で初めて、CpG曝露が肺IMs集団を著しく拡大させ、そのIL-10産生能力を大幅に増強することを示した。CpG誘導IMsは、定常状態IMsと比較して42.5-foldの数に増加し、IL-10産生量は550-foldに上昇した。この増強された制御能力が、アレルギー感作および確立された喘息の増悪に対する防御と関連していることを、養子移入実験とTlr9⁻/⁻マウスを用いた遺伝学的アプローチにより明確に証明した。特に、CpG誘導IMsがIL-10の産生を介してCpGの保護効果を媒介するために必要かつ十分であることを示した点は新規である。さらに、CpG誘導IMsの拡大が、従来のCCR2依存的な骨髄由来単球とは異なり、CCR2非依存的な肺および脾臓の貯蔵単球から主に生じるという独特なメカニズムを明らかにしたことも新規な発見である。
先行研究との違い: これまでの研究では、CpGの抗アレルギー作用は主に形質細胞様樹状細胞 (pDC) を介すると考えられていたが (de Heer et al. 2004)、本研究は肺pDCがTLR9を発現しないことと対照的に、肺および脾臓の貯蔵単球がTLR9を発現し、CpGの免疫調節効果を媒介する主要な細胞集団であることを示した。また、LPSもIMsを拡大させるが、CpGとは異なり、IL-10産生能力を大幅に増強せず、CCR2依存的な骨髄由来単球からの動員が主である点で、CpGとLPSが異なるメカニズムで作用することを示した。
臨床応用: 本研究の知見は、喘息やアレルギー性鼻炎に対するTLR9アゴニスト (CpG-ODN) 吸入療法の理論的根拠を強化する。CpG誘導IMsの養子細胞療法としての可能性も示唆され、慢性呼吸器疾患 (COPD, IPFなど) におけるIMs-IL-10軸の保護的役割の探索や、プロバイオティクス/微生物療法を通じたIMs拡大戦略への応用も期待される。ヒトIMsもTLR9を発現し、細菌DNA刺激によりIL-10産生を増加させることが報告されており (Hoppstädter et al. 2010)、TLR9遺伝子プロモーター領域の多型が喘息発症リスクの増加と関連していることから (Lazarus et al. 2003)、本研究の成果はヒトの疾患にも臨床的意義を持つと考えられる。
残された課題: 今後の検討課題として、まずマウス肺IMsとヒト肺IMsの同等な集団の同定と、本研究で得られた知見のヒトにおける翻訳的検証が必要である。また、HDMモデルのみでなく、他のアレルゲン (OVA, ゴキブリ、カビなど) を用いたモデルでの再現性も検証する必要がある。CpG誘導IMsの前駆細胞であるCCR2非依存的な単球輸送の分子メカニズム、特に代替のケモカイン受容体の同定は未解明であり、今後の研究で解明すべき重要な課題である。さらに、CpGの長期的な保護効果 (1ヶ月以上) の評価や、CpG-ODN投与量のヒト曝露濃度との比較による翻訳的関連性の確立も残された課題である。
方法
動物モデル: C57BL/6野生型 (WT) マウスを主要な実験動物として使用した。加えて、遺伝子改変マウスとして、Il10⁻/⁻マウス、Ccr2⁻/⁻マウス、Nr4a1⁻/⁻マウス、Myd88⁻/⁻マウス、Agtr1a⁻/⁻マウス、Cx3cr1-GFPマウス、IL-10β-ラクタマーゼレポーター (ITIB) マウス、Tlr9⁻/⁻マウスを用いた。マウスは6-10週齢で使用し、parabiosisマウスは6ヶ月齢で解析した。全ての実験プロトコルは、リエージュ大学の動物倫理委員会によって承認された。
CpG DNA曝露プロトコル: CpG-ODN 1826 (50 µg) または非CpG DNA (ODN、50 µg) を、単回または反復投与で鼻腔内 (i.n.)、皮下 (s.c.)、腹腔内 (i.p.) 投与した。TLRリガンド (Pam3CSK4, Poly(I:C), LPS, FLA-BS, MALP-2, R848) や病原体 (インフルエンザAウイルス、肺炎球菌) のi.n.投与も行った。
アレルギー性気道炎症モデル: House dust mite (HDM) 抽出物 (100 µg) を用いたTh2型喘息モデルを確立した。CpGの予防効果を評価するため、HDM感作の7日前にCpGをi.n.投与した。治療効果を評価するため、HDM感作後にCpGをi.n.投与し、その後HDMを吸入させた。卵白アルブミン (OVA) とミョウバンを用いた全身感作モデルも用いた。
肺マクロファージの同定と解析: 肺組織から単核細胞を分離し、フローサイトメトリーにより肺マクロファージサブセットを同定した。具体的には、肺胞マクロファージ (AMs) をCD11c hi Siglec-F+ CD64+で、間質マクロファージ (IMs) をCD11c int- Siglec-F− CD64+ MHC II+で定義した。IMsはさらにLy6C+/−およびCD11b+でサブ分類した。IL-10産生はIL-10β-ラクタマーゼレポーターITIBマウスを用いてin vivoで評価し、ELISAでex vivoで測定した。
養子移入実験: CpG処理マウスの肺から精製したCpG誘導IMs (1.5 x 10⁶ cells) を、ナイーブなレシピエントマウスに気管内移入し、その後HDM感作を行った。Il10⁻/⁻ドナー由来のCpG-IMsも用いてIL-10の必須性を検証した。
IL-10依存性の検証: Il10⁻/⁻ドナー由来のCpG-IMsの養子移入実験に加え、IL-10中和抗体を投与してCpGの保護効果への影響を評価した。
起源追跡と輸送経路の解析:
- 増殖能: EdU (5-ethynyl-2’-deoxy-uridine) の取り込みを解析し、IMsの局所増殖を評価した。
- 単球動員: Ccr2⁻/⁻マウス、CCL2/CCR2遮断抗体、clodronate含有リポソーム (Clo-Lips) による単球枯渇、およびparabiosis (共有血液循環マウス) を用いて、単球の起源と輸送経路を解析した。
- キメラマウス: CD45.1+ WTとCD45.2+ Ccr2⁻/⁻骨髄細胞を移植した混合骨髄キメラマウスを作製し、CpG誘導IMsの起源を追跡した。
- 脾臓の役割: 脾臓摘出術を行ったCcr2⁻/⁻マウスを用いて、脾臓由来単球の寄与を評価した。
- ケモカイン: 肺抽出物のケモカインアレイ解析を行い、単球動員に関与するケモカインを同定した。
喘息反応の評価: 気道過敏性 (AHR) はFlexiVentを用いて評価した。気管支肺胞洗浄液 (BALF) 中の好酸球数、気管支リンパ節 (BLN) 細胞のサイトカイン産生 (IL-4, IL-5, IL-13)、血清IgEレベル、肺組織の組織学的変化 (H&E染色、PAS染色による粘液産生) を評価した。樹状細胞 (DC) の活性化とリンパ節への遊走もフローサイトメトリーで解析した。
遺伝子発現解析: マイクロアレイ解析とGene Set Enrichment Analysis (GSEA) を用いて、CpG誘導IMsと定常状態IMsの遺伝子発現プロファイルを比較した。Tlr9 mRNA発現はリアルタイムPCRで測定した。
統計解析: R (バージョン3.2.4) を用いて統計解析を行った。残差の正規分布と等分散性の仮定は診断プロットで検証した。p値が0.05未満を有意とした。一元配置または二元配置ANOVAにTukeyの事後検定を適用した。