- 著者: Laura Bub, Elza Evren, Stijn Verwaerde, Cecilia Ruscitti, Domien Vanneste, Pia Ghosh, Yu Gao, Natalie Sleiers, Rong Deng, Marta López Montes, Kelsey Howley, Raphaël La Rocca, Annika Niehrs, Vassilis Glaros, Maria Reina-Campos, Barbro Dahlen, Anna Smed-Sörensen, Harald Lund, Taras Kreslavsky, Niklas K. Björkström, Andrea Reboldi, Apostolos Bossios, Thomas Marichal, Bart N. Lambrecht, Tim Willinger
- Corresponding author: Tim Willinger (Karolinska Institutet); Bart N. Lambrecht (VIB-UGent Center for Inflammation Research); Thomas Marichal (University of Liège)
- 雑誌: Journal of Experimental Medicine
- 発行年: 2026
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 41774079
背景
肺は外界に常時曝露される臓器であり、肺胞マクロファージ (alveolar macrophage, AM) と間質マクロファージ (interstitial macrophage, IM) が免疫防御の最前線を担う。マウス研究では、AMは胎児単球由来で自己複製により恒常性が維持される一方、IMは骨髄由来単球への依存度が高く、3種類の解剖学的・機能的に異なる間質マクロファージサブセットが肺内に共存することが示されている (Gibbings et al. AmJRespirCellMolBiol 2017)。組織内マクロファージ集団の起源と動態、ニッチ構成細胞 (線維芽細胞・内皮細胞・上皮細胞) との相互作用によるマクロファージ同一性の形成については包括的に整理されているが (Aegerter et al. Immunity 2022)、単球がどのようにして特定のニッチに位置決めされ適切な分化シグナルを受け取るかというメカニズムは大部分が未同定であった。CCR2 (C-C motif chemokine receptor 2) 依存的なLy6Chi (lymphocyte antigen 6C high) 単球が感染・炎症・組織障害時に肺に動員されてマクロファージへ分化し、その際CCL2 (CC-motif chemokine ligand 2) やM-CSF (macrophage colony-stimulating factor) といシトカイン・ケモカインシグナルが重要であることは確立されているが (Sabatel et al. Immunity 2017)、肺ニッチへの単球誘引を制御するGPCR (G protein-coupled receptor、Gタンパク質共役受容体) とそのリガンドの産生細胞源は gap in knowledge として残されていた。
二つの解剖学的に異なる間質マクロファージ集団が組織横断的に共存することは報告されていたが (Chakarov et al. Science 2019)、肺固有のニッチシグナルによる単球位置決め機構については手薄な状況にあった。GPR183 (G protein-coupled receptor 183) はEBI2 (Epstein-Barr virus-induced gene 2) とも呼ばれ、オキシステロール (hydroxylated cholesterol metabolites) の細胞表面受容体であり、リンパ節でのB細胞・リンパ組織誘導細胞の位置決め促進など、リンパ系臓器での免疫細胞遊走・配置における機能は既報であった。GPR183の主要リガンドである7α,25-ジヒドロキシコレステロールはコレステロールからCH25H (cholesterol 25-hydroxylase、コレステロール25-ヒドロキシラーゼ) とCYP7B1 (cytochrome P450 7B1, oxysterol 7alpha-hydroxylase) による2段階反応で生成され、HSD3B7 (3beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 7) により胆汁酸前駆体へ分解される。しかし肺マクロファージニッチにおけるGPR183の機能、並びに非リンパ系臓器でのリガンド産生細胞源は未解明であった。
目的
単球の肺マクロファージニッチへの位置決めと組織マクロファージへの分化を制御するGPCRシグナルとしてGPR183の機能を解明し、組織内リガンド産生の細胞源を同定するとともに、ヒト気道疾患における臨床的関連性を評価すること。
結果
GPR183発現はニッチの解剖学的位置に依存して動的に変化する: Gpr183-GFPレポーター解析により、Ly6Chi・Ly6Clo (lymphocyte antigen 6C low) 肺単球および両サブセット (CD206+・CD206-) の間質マクロファージがGpr183 mRNAを発現することが示された (Fig. 1A, Fig. 2A, B)。一方、胎児単球由来の常在肺胞マクロファージはGpr183を発現しなかった。骨髄キメラ実験では移植3週時点で単球由来の移行期肺胞マクロファージ (CD11c+SiglecFmid) がGpr183を高発現したが、成熟した単球由来肺胞マクロファージ (CD11c+SiglecFhi) では5週時点で低下し、12週時点で消失した (Fig. 2E, F)。in vitroでもM-CSF誘導マクロファージはGpr183発現を維持したが、GM-CSF+TGFβ誘導肺胞マクロファージ様細胞 (特にCD11blo) では発現が低かった (Fig. 2H)。定常状態のGpr183+/+とGpr183-/-マウス間で肺胞マクロファージ・IM・Ly6Chi単球の細胞数に有意差はなく (Fig. 2C、ns)、GPR183は恒常的な常在マクロファージ維持には不要であることが確認された。SPAMデリーターマウスのscRNA-seqでもGpr183 mRNAが肺単球・IM・分化途中の単球由来マクロファージで高発現し、常在AMおよびDay 14の単球由来成熟AMでは低発現であることが確認され (Fig. 3G)、ニッチへの定着によるGpr183発現の動的制御が示された。
GPR183は競合的環境において単球の肺マクロファージニッチ占有を強力に促進する: 競合的骨髄キメラ (Gpr183+/+ と Gpr183-/-を1:1混合) では、血液および肺のLy6Chi単球は投与骨髄の入力比と同等の比率で存在していた (比率ほぼ1:1、ns)。これに対し肺胞マクロファージではGpr183+/+由来がGpr183-/-由来を有意に上回り (approximately 2-fold increase, p<0.0001)、間質マクロファージでも同様の競合的優位性が観察された (Fig. 4A, B、n=17-19 mice)。この優位性は時間依存的に拡大し、19-23週時点で肺胞マクロファージ比率は約9:1 (approximately 9-fold increase) に達した (Fig. 4C、n=14-15 mice、p<0.0001)。GPR183欠損単球は非競合的条件 (単独移植キメラ) では空の肺マクロファージニッチを補充できており (Fig. 4D、ns)、GPR183は競合的環境下でのニッチ占有競争優位性を付与することが明確となった。他臓器との比較では、脾臓・腹腔・脳マクロファージのキメリズム比率は同等であり (Fig. 4E、ns)、肝臓ではむしろGpr183+/+がわずかに低比率となり、GPR183の機能が肺に特異的であることが示された。Rag1-/-との混合キメラ (n=4 mice) でGpr183欠損AMが依然として競合劣位にあることから (Fig. 6B)、GPR183の効果がB・T細胞ではなく単球/マクロファージに内在することが確認された。さらにCcr2RFP/RFP骨髄との混合キメラ (n=9 mice) により、CCR2+肺単球が発現するGPR183が肺胞マクロファージへの分化効率に必須であることが示された (Fig. 6D)。SPAMデリーターキメラ (AM特異的枯渇後4週解析、n=6) でも、Gpr183+/+骨髄がGpr183-/-より効率よくAMニッチを補充し (p<0.05)、IM-DTRキメラ (IM特異的枯渇後2週解析、n=6) でも間質ニッチへのGpr183-/-の補充効率が有意に低かった (p<0.001, Fig. 5B, D)。
GPR183は分化初期のCD64+Ly6C+中間段階で単球に作用する: 競合的キメラの移植3週時点では、骨髄および血液中のLy6Chi単球比率は同等であり (Fig. 7B、ns)、GPR183が単球産生 (monopoiesis) や血中動員には不要であることが確認された。肺内の分化段階別解析では、Ly6ChiCD64- 単球 (最も未分化) の比率は同等であったが、CD64+CD11b+Ly6C+SiglecF- 単球-マクロファージ中間段階 (monocyte-macrophage intermediate) でGpr183+/+がGpr183-/-を有意に凌駕し始めた (p<0.01、Fig. 7B)。さらにCD64+CD11b+Ly6C-SiglecF- 中間体およびCD64+CD11c+SiglecFlo/mid 移行期AMでもGPR183+/+の優位性が持続した。これらの知見はGPR183欠損の影響がCD64アップレギュレーションとLy6Cダウンレギュレーションが起きる初期分化段階に集中することを示す。一方、Gpr183欠損肺胞マクロファージの代謝解析では酸化的リン酸化プロファイルに差はなく (Fig. S4A)、in vitroの競合分化実験 (M-CSF、GM-CSF+TGFβ各条件、7α,25-ジヒドロキシコレステロール添加の有無) でもGpr183+/+とGpr183-/-の比率は同等に保たれており (Fig. S4B, C)、GPR183欠損がin vitroでの分化能自体を損なうものではなく、in vivoのニッチへの位置決めシグナルが主要な作用点であることが示された。
肺線維芽細胞がニッチ枯渇を感知してGPR183リガンドを産生する: Ch25h欠損宿主でのキメラ実験では、Gpr183+/+単球のGpr183-/-に対する競合優位性 (AMで約2倍、IMで同程度) が消失した (Ch25h-/-宿主ではns、Fig. 7C)。照射抵抗性細胞 (非造血細胞) が肺Ch25h mRNAの主要産生源であることをCh25h+/+とCh25h-/-骨髄・宿主の組み合わせキメラで確認した (Fig. 7D、p<0.001〜0.0001)。SPAMデリーターマウスのscRNA-seq時系列解析では、肺胞線維芽細胞 (alveolar fibroblasts) がCh25hとCyp7b1を最高レベルで共発現しており (Fig. 8A)、AM枯渇後12時間以内に両酵素のmRNAが急速にアップレギュレートされた (Fig. 8C, D)。分解酵素Hsd3b7はAM枯渇後に逆にダウンレギュレートされ、7α,25-ジヒドロキシコレステロール産生量の増加を示唆した。Cyp7b1のピーク発現は48時間後であり (Fig. 8B)、単球が肺胞マクロファージへの分化を開始する時点 (Day 2) と一致した (Fig. 3F)。IM-DTRモデルでも線維芽細胞のCh25h・Cyp7b1発現がIM枯渇後12-24時間以内に急増し (Fig. 8H)、Hsd3b7は低発現のまま維持された。免疫蛍光顕微鏡法ではGpr183GFP/+ × Ch25htdTom二重レポーターマウスを用いて、PDGFRα+ (platelet-derived growth factor receptor alpha) Ch25h+ 線維芽細胞がGpr183+ CD68+ 単球/マクロファージと近傍に共局在することを示し (Fig. 9B, C)、LPS (lipopolysaccharide) 誘導急性肺傷害後にその近接距離がさらに短縮した (Mann-Whitney検定、Fig. 9D)。線維芽細胞はCcl2 (CCL2をコード) とCsf1 (M-CSFをコード) もAM枯渇後に同様にアップレギュレートしており、単球誘引・分化誘導の複数シグナルを並行して供給することが示された。
ヒト気管支拡張症気道でGPR183+単球が拡大する: 気管支拡張症患者6名と健常者10名のBAL液scRNA-seq統合解析 (n=14,437 cells total) では、11の転写的に異なるクラスターが同定された。PPARG (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 高発現とfetal-origin gene signature高スコアによりcluster 0、2、4、6、11を胎児由来AMと分類した (Fig. 10B, C, D)。Cluster 10はGPR183高発現かつKLF4 (Krüppel-like factor 4) 高発現を示し、HSPCs (hematopoietic stem and progenitor cells) 由来gene signatureが高いGPR183+単球クラスターとして同定された (Fig. 10B, D)。このGPR183+単球cluster 10と単球性VCAN (versican proteoglycan) -マクロファージcluster 1は、健常者と比べて気管支拡張症患者で有意に拡大していた (p<0.01〜0.001、Fig. 10E)。Slingshotアルゴリズムによる分化軌跡解析でGPR183+単球からマクロファージクラスターへの分化軌跡が予測され (Fig. 10F)、ヒト慢性炎症気道においてもGPR183+単球が肺マクロファージの前駆体として存在することが示唆された。
考察/結論
本研究は、肺マクロファージニッチの占有と単球のマクロファージへの分化制御における「オキシステロール-GPR183シグナリング軸」という新規の分子機構を確立した。マクロファージニッチが枯渇すると線維芽細胞がCH25H・CYP7B1酵素の発現を12時間以内に協調的に上昇させ、7α,25-ジヒドロキシコレステロールを産生することでGPR183+単球を当該ニッチへ誘引し、さらにCCL2やM-CSFによって分化が促進されるという「線維芽細胞主導のニッチ再建回路」が初めて明らかになった。線維芽細胞がニッチ枯渇の感知器として機能し、代謝シグナル・走化性因子・増殖因子を統合的に産生するという概念は、組織恒常性の能動的調節機構として重要な意義を持つ。
既報との違いと位置づけ: これまでの研究でGPR183はリンパ節でのB細胞の胚中心外マントル帯への移動やリンパ組織誘導細胞の腸管内位置決めへの関与が示されていたが、本研究は非リンパ系臓器における組織特異的マクロファージ分化への関与という対照的な機能を発見した。常在肺胞マクロファージがGPR183を発現しない一方で間質マクロファージが高発現するというニッチ解剖学的依存性、並びに単球由来AM前駆体のGPR183一過性発現と成熟AMでの消失という動的制御は既報には記載がなく、組織によって異なるGPCRシグナル体系が存在することを示す新知見である。さらに脾臓・腹腔・脳では競合優位性が認められないという肺特異性は、既存のGPR183の普遍的遊走促進という認識と相違があり、肺の解剖学的・代謝的固有性が背景にあると考えられる。
新規性: 本研究で初めて、肺線維芽細胞 (特に肺胞線維芽細胞) がマクロファージニッチ枯渇を感知してCh25h・Cyp7b1を急速に協調誘導し7α,25-ジヒドロキシコレステロールを産生するという新規な回路が示された。これまで報告されていない重要な知見は、線維芽細胞が単にM-CSF・CCL2のような既知因子だけでなく、脂質代謝産物であるオキシステロールを「位置情報シグナル」として産生し、単球を物理的に正しいニッチ座標へ誘引するという点である。競合的骨髄キメラという感度の高い実験系によって GPR183依存的な23週間の追跡解析が達成され、9:1という圧倒的な長期競合優位性を記録したことも本研究で初めて示された。
臨床的意義: ヒト気管支拡張症患者の慢性炎症気道でGPR183+単球が拡大し、SlingshotによりAMへの分化軌跡が予測されたことは、GPR183-オキシステロール軸の臨床的意義を支持する。GPR183はGPCRであり既存薬剤標的との親和性が高く、GPR183やCH25H・CYP7B1経路の調節によって肺感染症・喘息・COPD (chronic obstructive pulmonary disease) ・肺線維症などにおけるマクロファージ動員と炎症アウトカムを制御する治療戦略への臨床応用可能性がある (Ruscitti et al. SciImmunol 2024)。組織常在マクロファージの枯渇・機能異常が疾患進行に関与する病態において、GPR183シグナリングを操作することで適切なマクロファージ補充を促進する概念は橋渡し研究 (bench-to-bedside) の観点から注目される。
残された課題: 本研究ではGPR183は定常状態のAM維持には不要であったが、競合的設定での胎児由来AM発生への関与は未評価であり今後の検討課題である。線維芽細胞特異的Ch25h/Cyp7b1条件付き欠損モデルによる直接的な細胞源の証明が必要である。また、感染症 (肺炎球菌感染後など) という生理的に関連性の高いモデルでの検証、GPR183下流の分化プログラムの転写因子ネットワーク解明、並びにGPR183とCCR2が単球の肺ニッチ誘引において協調して働くかの検討も future research として挙げられる。さらに炎症性肺疾患でのGPR183阻害または増強が治療的に有益か有害かの評価は、更なる検討が不可欠である。
方法
マウスモデルと遺伝学的ツール: 全実験はC57BL/6J inbred strain (C57BL/6J; Jackson Laboratory stock #000664) の遺伝子改変マウスを使用した。Gpr183-GFP reporter mouse (GFP: green fluorescent protein reporter knock-in; genotype Gpr183GFP/+)、Gpr183欠損マウス (Gpr183-/-)、Ch25h欠損マウス (Ch25h-/-、Jackson Laboratory #016263)、並びにGpr183GFP/+ × Ch25h-tdTomato二重レポーターマウスを主要ツールとして使用した。肺胞マクロファージ特異的枯渇モデルとして「SPAMデリーターマウス」(EpxCre × SiglecfLox-DTR-Lox、DTR: diphtheria toxin receptor、ジフテリア毒素受容体を肺胞マクロファージに選択的に発現) を使用し、気管内ジフテリア毒素 (diphtheria toxin, DT) 投与 (100 pg〜40 ng) で肺胞マクロファージを特異的に枯渇した。間質マクロファージ特異的枯渇モデルとしてIM-DTRマウス (Tmem119Cre × Cx3cr1LSL-DTR) を用い、腹腔内DT 50 ng投与で枯渇した。
競合的骨髄キメラ実験: 全身2×5 Gy照射後にGpr183+/+ (CD45.1.2+) とGpr183-/- (CD45.2+) 骨髄を1:1混合して2×10^6細胞を尾静脈注射した競合的キメラを作製し (n=17-19匹)、3週・9-13週・19-23週・9-29週の各時点でフローサイトメトリー解析を実施した。移植比率への正規化を各実験で独立に実施。非競合的単独移植キメラ (n=4-5匹、7-8週後解析) でGPR183非存在下でのニッチ補充能を評価した。SPAMデリーターキメラではブスルファン (busulfan) 30 mg/kgで宿主単球を置換しつつ常在AMを保持した後、DT 1 ngで枯渇し4週後にフローサイトメトリー解析した (n=6匹)。IM-DTRキメラでは胸部遮蔽照射 (2×6 Gy) でIMを保護後に骨髄移植し、DT 50 ng投与2週後に解析した (n=6匹)。リンパ球の寄与を評価するRag1-/-混合キメラ (n=4匹、10週後) およびCCR2+単球のGPR183要件を検証するCcr2RFP/RFP混合キメラ (n=9匹、9-10週後) も作製した。
単細胞RNA配列解析 (scRNA-seq; single-cell RNA sequencing): SPAMデリーターマウスから肺胞マクロファージ枯渇前後の計7時点 (0、12時間、24時間、48時間、5日、8日、14日後、各n=4匹) に肺細胞を採取し、intravascular anti-CD45抗体で非標識の常在造血細胞 (CD45+CD64+) と非造血細胞 (CD45-) を含む合計117,715細胞のscRNA-seqを実施した。IM-DTRモデルでも非造血ニッチ細胞 (線維芽細胞・上皮細胞・内皮細胞) のscRNA-seqを各時点n=3-4匹で実施した。UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) によりクラスター可視化し、Slingshotアルゴリズムで分化軌跡を推定した。
ヒト検体解析: 気管支拡張症 (bronchiectasis) 患者6名のBAL (bronchoalveolar lavage、気管支肺胞洗浄) 液 (Karolinska大学病院、Swedish Ethical Review Authority承認#2019-00618) からCD45+CD66-細胞を採取してscRNA-seqを実施し、既報の健常者10名データセットと統合 (計14,437細胞) した。
統計解析: 一元配置ANOVA (Tukeyの多重比較post hoc検定)、対応のないStudentのt検定、Welchのt検定、両側Mann-Whitney検定を状況に応じて使用した。免疫蛍光顕微鏡法ではQuPathで最近接距離を定量し、走化性アッセイはトランスウェル法 (7α,25-ジヒドロキシコレステロール0-100 nM) で実施した。