- 著者: Christine Youn, Cristina Pontaza, Yu Wang, Dustin A. Dikeman, Daniel P. Joyce, Martin P. Alphonse, Meng-Jen Wu, Sabrina J. Nolan, Mohamed A. Anany, Michael Ahmadi, Jeremy Young, Aron Tocaj, Luis A. Garza, Harald Wajant, Lloyd S. Miller, Nathan K. Archer
- Corresponding author: Nathan K. Archer (Department of Dermatology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD 21287, USA; narcher2@jhmi.edu)
- 雑誌: Science Advances
- 発行年: 2023
- Epub日: 2023-06-16
- Article種別: Original Article
- PMID: 37327341
背景
黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) はSSTI (skin and soft tissue infections、皮膚軟部組織感染症) の最も主要な病原菌であり、心内膜炎・骨髄炎・菌血症・敗血症などの侵襲性感染症をも引き起こす。特にCA-MRSA (community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus、市中感染型MRSA) USA300株の蔓延は深刻な公衆衛生上の負担となっており、米国では年間1,400万件超の外来・救急受診と75万件超の入院を招いている (Turner et al. Nat Rev Microbiol 2019; Tong et al. Clin Microbiol Rev 2015)。新規抗生物質の開発ペースを耐性菌の出現が上回る現状において、宿主防御機序の解明と抗生物質に代わるHDT (host-directed therapy、宿主指向型治療法) の開発が急務である。
腫瘍壊死因子TNF (tumor necrosis factor) は多面的なサイトカインであり、TNFR1 (TNF receptor 1) とTNFR2 (TNF receptor 2) という2つの受容体を介してシグナルを伝達する (Muendlein et al. SciImmunol 2022)。TNFR1は有核細胞の大部分に恒常的に発現し、TNFR2は活性化時に誘導発現して制御性T細胞・骨髄由来抑制細胞・マクロファージなど特定の免疫細胞に限局する (Bronte et al. NatCommun 2016)。関節リウマチ・乾癬・炎症性腸疾患などの自己免疫疾患に対してTNF阻害薬が広く使用されているが、TNF阻害薬投与患者においてS. aureus皮膚感染リスクが増加することが複数の臨床コホートで報告されており (Fréling et al. Am J Gastroenterol 2015; Cossio et al. J Cutan Med Surg 2020)、TNFがS. aureus皮膚感染に対する防御に関与する可能性が示唆されていた。
好中球はS. aureus感染に対する第一線防御細胞であり、貪食・ROS (reactive oxygen species、活性酸素種) 産生・NETs (neutrophil extracellular traps、好中球細胞外トラップ) 形成を介して細菌を排除する。試験管内の研究では、TNFR2シグナルが好中球のNET形成を促進することが示されていたが (Neuenfeldt et al. CellRep 2022)、その知見が生体内の皮膚感染でも再現されるか、またTNFR1とTNFR2が好中球において非冗長的に異なる機能を分担するか否かは未解明のままであった。特に、好中球内在性のTNFR1・TNFR2シグナルをcell-type-specificに分離した養子移入実験による直接証明は存在せず、TNFR2選択的アゴニストによる治療的介入が実際の感染防御を増強できるかという重要な問いも未検討であった。
目的
本研究の目的は、S. aureus皮膚感染症に対する宿主防御における骨髄由来免疫細胞産生TNFの寄与を骨髄移植キメラモデルで解明すること、TNFR1欠損・TNFR2欠損マウスを用いて各受容体の役割を比較すること、好中球精製・養子移入実験により好中球内在性TNFRシグナルの機能的証拠を確立すること、PAD4 (peptidylarginine deiminase 4、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ4) 欠損マウスとの比較によりNET形成の防御的役割を検証すること、および TNFR2選択的アゴニストNewSTAR2を用いた治療介入によりS. aureus・緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 皮膚感染症に対する新規宿主指向型治療法としての有効性を実証することであった。
結果
TNFは骨髄由来免疫細胞から産生され、好中球が感染皮膚における主要な供給源である: S. aureus皮膚感染モデル (USA300 LAC::lux, 3 × 10^7 CFU皮内注射) において、TNF-/-マウスはWTマウスと比較して皮膚病変面積および細菌負荷が著明に増大し (Fig. 1A-D, n=8, p<0.001)、TNFが感染防御に不可欠であることが示された。骨髄移植キメラ実験では、WT骨髄細胞をTNF-/-マウスに移植した群 (WT BM → TNF-/-) はWTと同等の防御を示した一方、TNF-/-骨髄細胞をWTマウスに移植した群 (TNF-/- BM → WT) は感染が悪化した (Fig. 1E-F)。また、WT骨髄細胞を移植した2群間、TNF-/-骨髄細胞を移植した2群間にはレシピエント遺伝子型による有意差がなく、骨髄由来免疫細胞が産生するTNFが防御の主役であることが確立された。皮膚内TNFタンパク質レベルは感染1日目から上昇し感染3日目にピークに達した後7日目に減衰した (Fig. 1G)。感染3日目の皮膚のフローサイトメトリー解析では、CD45+細胞中でTNF+細胞として好中球が圧倒的多数を占め、マクロファージが少数、単球はほぼ皆無であった (Fig. 1I-J)。これらの結果は好中球がS. aureus皮膚感染における主要なTNF産生・応答細胞であることを示す。本項の主要所見はすべて独立した2-3回の実験で再現され (各群n=8 independent animals)、データを統合解析した。
TNFR1とTNFR2はともに宿主防御に必須であり、好中球内在性シグナルとして非冗長的に機能する: TNFR1-/-マウスおよびTNFR2-/-マウスは、いずれもWTと比較して有意に増大した皮膚病変と細菌負荷を示した (Fig. 2A-D, n=8, p<0.001)。感染3日目の皮膚のフローサイトメトリー解析では、好中球が生細胞中でTNFR1・TNFR2の両方の主要発現細胞であることが示され、感染後に好中球上のTNFR1・TNFR2発現数がともに非感染皮膚と比較して著明に増加した (Fig. 2E-H)。非免疫細胞およびマクロファージ上のTNFR1発現は感染後に減少した一方、単球・非免疫細胞上のTNFR2は増加するという受容体別の動態の違いも確認された。好中球内在性TNFRシグナルの役割を直接証明するために養子移入実験を実施した。WT好中球 (純度>92%) をTNFR1-/-マウスに移入した群 (WT → TNFR1-/) は、TNFR1-/-好中球移入群と比較して皮膚病変面積および細菌負荷が有意に減少した (Fig. 3A-D, n=10, p<0.01)。同様に、WT好中球をTNFR2-/-マウスに移入した群 (WT → TNFR2-/-) は、TNFR2-/-好中球移入群と比較して著明な病変縮小と細菌クリアランス亢進を示した (Fig. 3E-H)。これにより、好中球内在性のTNFR1・TNFR2シグナルがそれぞれ独立して宿主防御に貢献することが生体内実験で直接確認された。
TNFR1シグナルは好中球の皮膚への動員と好中球性膿瘍形成を促進する: H&E染色による感染3日目の皮膚組織の解析では、TNF-/-マウスおよびTNFR1-/-マウスで好中球性膿瘍面積がWTと比較して著明に消失していた一方、TNFR2-/-マウスでは膿瘍形成はWT同等であった (Fig. 4A-B, n=8, p<0.001)。フローサイトメトリーによる皮膚内好中球数の定量でも同様のパターンが再現され、TNF-/-・TNFR1-/-マウスで好中球数が著明に減少したがTNFR2-/-では変化がなかった (Fig. 4E)。グラム染色では、TNF-/-・TNFR1-/-・TNFR2-/-のすべての欠損マウスでWTと比較して細菌バンド幅が有意に拡大しており (p<0.001)、動員障害と機能不全がそれぞれ異なる経路で細菌クリアランス低下をもたらすことが示された (Fig. 4C-D)。これらの結果は、TNFR1シグナルが好中球の感染部位への招集という「物理的封じ込め」を担うことを示す。
TNFR2シグナルはNOX2活性化・ROS産生・NET形成を制御して全身播種を防止する: PAD4-/-マウス (n=8) はWTと比較して皮膚病変が著明に拡大し細菌負荷が増加した (Fig. 5A-D, p<0.001) が、好中球性膿瘍面積と皮膚内好中球数はWT同等であった (Fig. 5F-G)。これはNET形成が好中球動員とは独立した固有の防御機構であることを示す。免疫蛍光染色によるH3-Cit (citrullinated histone H3) の定量では、TNF-/-・TNFR2-/-・PAD4-/-マウスでNET形成がWTと比較して著明に減少していた一方、TNFR1-/-マウスではWT同等であった (Fig. 6A-B, n=6, p<0.001)。この受容体特異的な違いは、TNFR2シグナルがNET誘導経路の主要な上流であることを示す。腎臓への細菌播種 (CFU) は、TNF-/-・TNFR2-/-マウスでは有意に増加したが、TNFR1-/-・PAD4-/-マウスではWT同等であった (Fig. 6C, n=8)。このことは、TNFR2が全身播種防止においてNET形成とは独立したメカニズムをも持つことを示す予期せぬ所見であった。フローサイトメトリーによるNET種別解析では、suicidal NETs (死細胞性、細胞膜溶解を伴う) とvital NETs (生細胞性、小胞放出型) の両者がTNFR2-/-・PAD4-/-マウスで著明に減少し、TNFR1-/-マウスでは変化がなかった (Fig. 6D)。皮膚浸潤後の好中球のROS産生 (mean ± SEM) は、TNFR2-/-好中球でWTと比較して著明に低下し、TNFR1-/-・PAD4-/-好中球ではWT同等であった (Fig. 6E)。なお、in vitroのS. aureus刺激 (MOI 100) ではTNFR1とTNFR2の両者がROS産生に寄与し、生体内環境との相違が示された。NOX2活性化の指標であるp47phoxリン酸化 (phos-p47phox) の免疫蛍光定量では、TNFR2-/-マウスの感染皮膚でpuncta数/mm²がWTと比較して著明に減少し (Fig. 6F-G, n=6, p<0.001)、TNFR1-/-・PAD4-/-ではWT同等であった。以上からTNFR2-NOX2-ROS-NET形成という好中球活性化軸が確立された。
TNFR2アゴニストNewSTAR2がS. aureus・P. aeruginosa双方の皮膚感染症に治療効果を示す: S. aureus皮膚感染後4時間にNewSTAR2 (8 mg/kg、単回腹腔内投与) を投与した群 (n=7) は、ビヒクル (PBS) 投与群と比較して皮膚病変面積および細菌負荷が有意に減少した (Fig. 7A-D, p<0.01)。投与群と対照群で皮膚内好中球数に差はなかったが (Fig. 7E)、suicidal・vital NETs形成はいずれも著明に亢進した (Fig. 7F, 2.2-fold increase)。NewSTAR2の直接抗菌活性は80・160・320 μg/mlのいずれの濃度でも認められなかった (160 μg/mlが投与マウス相当濃度)。次に、Gram陰性菌P. aeruginosa Xen41株 (1 × 10^6 CFU皮内) を用いたモデルでも、NewSTAR2 (8 mg/kg、感染4時間後単回投与、n=10) がビヒクル群と比較して皮膚病変縮小・細菌負荷減少に加え、体重減少の改善と生存率の有意な向上をもたらした (Fig. 8A-F, p<0.01)。P. aeruginosa感染での治療効果も直接抗菌活性によるものではないことが確認された。以上の結果は、TNFR2アゴニズムがGram陽性・Gram陰性菌双方に対して広域スペクトルの抗菌免疫治療効果を持つことを示す。
考察/結論
本研究は、S. aureus皮膚感染症に対する宿主防御において好中球内在性TNFRシグナルが担う非冗長的・独自の役割を解明し、TNFR2選択的アゴニズムが多剤耐性菌感染症に対する宿主指向型治療となりうることを示した重要な生体内証拠を提示した。
先行研究との違い: 好中球動員におけるTNFの関与はこれまでの研究で接触過敏性皮膚炎モデルで部分的に示されていたが、本研究は好中球内在性のTNFR1とTNFR2がin vivo感染環境において「動員・膿瘍形成」と「活性化・殺菌機能」という全く異なる分業を担うことをcell-type-specific実験で初めて分離した点でこれまでの研究と異なる。また、Miller et al. (2006) がTNFR1欠損マウスでS. aureus皮膚感染防御に障害がないと報告していることとの相違は、使用したS. aureus株の違い (MRSA USA300 vs. MSSA) に起因する可能性がある。MRSA USA300はMSSAと比較して細胞内生存・溶血活性・免疫回避酵素産生が優れており、既報とは異なる病原体-宿主相互作用が生じた可能性がある。さらに、TNFR2は制御性T細胞の分化・拡大やMDSC (myeloid-derived suppressor cell、骨髄由来抑制細胞) の免疫抑制機能増強など対照的な免疫抑制的役割を担うことが知られていたが (Bronte et al. NatCommun 2016)、本研究は好中球においてTNFR2が逆にNOX2活性化・ROS産生・NET形成を通じた殺菌経路を誘導することを示した。これは受容体シグナルの細胞種依存的・文脈依存的な二面性を示す注目すべき知見である。
新規性: 本研究で初めて、好中球内在性TNFR1とTNFR2が生体内感染環境において明確に異なる機能分担を担うことが直接証明された。特に新規に同定された機序として、TNFR2が全身播種防止においてNET形成とは独立したメカニズムをも持つ点が挙げられる (PAD4欠損では腎臓播種増加なし、TNFR2欠損では増加)。また、in vitroではTNFR1もROS産生に寄与するが、生体内のin vivo環境ではTNFR2のみがNOX2依存的ROS産生を担うことを本研究で初めて示した。この乖離は、好中球豊富な膿瘍内でmTNF (membrane-bound TNF、膜結合型TNF) がTNFR2に優先的に作用し、TNFR2の活性化が受容体凝集依存的であるためと説明される (Neuenfeldt et al. CellRep 2022)。
臨床応用: 本知見は多剤耐性菌感染症に対する臨床応用として直接的な意義を持ち、TNF阻害薬投与患者でS. aureus感染リスクが増加するという臨床観察に好中球内在性TNFR2シグナル遮断という機序的説明を与える。NewSTAR2はMRSA・P. aeruginosaなど難治性感染症に対する単剤療法または既存抗生物質との併用療法として、臨床現場での応用が期待される。さらにTNFR2アゴニストは神経変性疾患・急性移植片対宿主病でも有効性が示されており、感染症と炎症性病態の共存症例における bench-to-bedside 橋渡し治療戦略としての展開も視野に入る。NET形成が腫瘍進行・凝固異常・自己免疫病態とも関連することから、本研究のTNFR2-NET軸の解明はこれらの臨床的含意でも重要性を持つ。
残された課題: 今後の検討課題として、(1) T細胞・NK細胞・Treg上のTNFRシグナルのS. aureus感染防御への関与の評価、(2) LTα (lymphotoxin alpha) の寄与 (TNFR1・TNFR2双方に結合するため欠損マウス実験で分離できていない)、(3) ミトコンドリア由来ROSとNOX2由来ROSの相対的寄与 (全身性S. aureus感染ではミトコンドリアROSの重要性が既報)、(4) NewSTAR2のヒトにおける安全性・薬物動態および制御性T細胞の意図しない増幅による免疫抑制リスクの評価、(5) 複数のS. aureus株・P. aeruginosa株および皮膚以外の感染部位 (肺・骨・菌血症) でのTNFR2アゴニストの有効性検証、ならびに (6) TNFR1アゴニストとの併用療法の検討 (TNFR1・TNFR2が非冗長的役割を持つため相加効果が期待される) が残された課題として挙げられる。
方法
動物モデルと感染プロトコル: 6〜10週齢の雌C57BL/6J (JAX stock #000664, Jackson Laboratories) バックグラウンドの野生型 (WT)・TNF欠損 (TNF-/-)・TNFR1欠損 (TNFR1-/-)・TNFR2欠損 (TNFR2-/-)・PAD4欠損 (PAD4-/-) マウスを使用した。S. aureus皮膚感染モデルでは、麻酔下 (2% isoflurane) で背側皮膚に生物発光性CA-MRSA USA300 LAC (Los Angeles County) 株の発光マーカー導入クローンLAC::luxを3 × 10^7 CFUで皮内注射した。P. aeruginosa感染モデルでは生物発光性Xen41株 (PAO1派生、PerkinElmer) を1 × 10^6 CFUで皮内注射した。細菌負荷はBLI (bioluminescence imaging、生体内生物発光イメージング; Lumina III IVIS, PerkinElmer) を用いて経時的・非侵襲的に測定し、BLIシグナルはex vivo CFU計測と高い相関 (R²=0.9996) を示した。皮膚病変面積はImageJを用いてデジタル写真から定量化した。
骨髄移植キメラ実験: 致死量放射線照射 (8-Gy) を施したWTまたはTNF-/-レシピエントマウスに、WTまたはTNF-/-ドナー由来の骨髄細胞を1 × 10^7個、照射後3時間以内に眼窩内静脈経由で移植した。照射後3週間は抗菌薬含有飲料水を投与し、7〜8週後に骨髄再構成をフローサイトメトリーで確認後に感染実験を実施した (n≥8)。
好中球精製・養子移入実験: 骨髄からNeutrophil Isolation Kit (Miltenyi Biotec) を用いて精製した好中球 (生存率>94%、CD45+CD11b+Ly6G+純度>92%) を5 × 10^6個、感染2時間前に眼窩内静脈経由でWTまたは欠損マウスに移入した (n≥10)。
フローサイトメトリー: 感染皮膚の単細胞懸濁液 (DNase I + Liberase TL消化、40 μmフィルター) を調製し、好中球 (Ly6C^int/low Ly6G+)・単球 (Ly6C+ Ly6G-)・マクロファージ (F4/80+) を同定した。TNFR1/TNFR2発現、細胞内TNF、ROS (DCFDA)、suicidal/vital NETs (Sytox Orange + H3-Cit抗体 + MPO抗体) をMACSQuant flow cytometerで取得した。
組織学的解析: 感染3日目の皮膚切片にてH&E染色 (好中球性膿瘍面積計測)、グラム染色 (細菌バンド幅計測)、免疫蛍光染色 (H3-Cit・Ly6G・DAPI: NET検出; phospho-p47phox・Ly6G・DAPI: NADPHオキシダーゼ2 (NOX2, NADPH oxidase 2) 活性化検出) を実施した。H3-Cit強度は統合蛍光密度、phos-p47phoxはpuncta数/mm²で定量化した。なお、NOX2 (NADPH oxidase 2) の活性化はリン酸化p47phoxを代替指標として評価した。
治療介入: TNFR2選択的アゴニストNewSTAR2 (マウスTNF変異体三量体2個をIgG1 N297A変異体に融合したsc(mu)TNF80ベース構造体) を8 mg/kgで感染4時間後に単回腹腔内投与した (n≥7)。直接抗菌活性は細菌発育曲線 (OD600、10時間) にて80・160・320 μg/mlの各濃度で確認した。
統計解析: 2群間経時比較にtwo-way ANOVA、複数群比較にone-way ANOVA (Tukey補正) またはKruskal-Wallis検定 (Dunn補正)、2群間単時点比較にStudent t-test (two-tailed) またはMann-Whitney検定を用いた。GraphPad Prism 9にて解析し、p<0.05を有意差とした。各群n≥8を基本とし、独立した2実験以上の結果を統合した。外れ値はGrubbs検定で同定・除外した。