- 著者: Yonathan Lissanu Deribe, Yuting Sun, Christopher Terranova, Fatima Khan, Juan Martinez-Ledesma, Jason Gay, Jiekun Kang, Giannicola Genovese, Luke A. Bristow, Chad J. Creighton, Florian L. Muller, Anil K. Sood, Gordon B. Mills, Jason B. Fleming, P. Andrew Futreal
- Corresponding author: P. Andrew Futreal (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA)
- 雑誌: Nature Medicine
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-10-08
- Article種別: Original Article
- PMID: 29892061
背景
SWI/SNF (SWItch / Sucrose Non-Fermentable) クロマチンリモデリング複合体はヒトがんで最も頻繁に変異する複合体の一つであり、その構成サブユニット (SMARCA4 [BRG1]、SMARCB1 [SNF5/INI1]、ARID1A [BAF250a]、PBRM1 [BAF180] 等) の変異は多様ながん種で報告されている。先行研究では、Nature 2014 (TCGA LUAD) が肺腺癌 (lung adenocarcinoma, LUAD) で SMARCA4変異とARID1A変異がそれぞれ約8%に認められることを示し、Helming et al. CancerCell 2013はARID1A変異に対するARID1B依存性を提示した。Pan et al. Cell 2016 および NatRevCancer 2016 (Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism) はがん代謝リワイヤリングが治療標的となりうることを論じ、クロマチンリモデリングと細胞代謝 (特にミトコンドリア機能) の連関が注目されてきた。Genetically engineered mouse model (GEMM) の文脈では、DuPage et al. CancerRes 2009が Kras / p53 conditional model with adenoviral / lentiviral Cre delivery を確立し、LUAD研究の standard platform となった。何が足りなかったか：(1) SWI/SNF変異が肺腺癌に与える具体的代謝リワイヤリングの機序、(2) この代謝脆弱性を標的とする治療戦略の前臨床検証、(3) Kras-p53-Smarca4 三重変異 GEMM での systematic解析、(4) 選択的 OXPHOS (oxidative phosphorylation、酸化的リン酸化) 阻害薬の SMARCA4-mutant LUAD への有効性、はいずれも未解明であった。
目的
SWI/SNF複合体 (特にSMARCA4) 変異が肺腺癌に引き起こす代謝的変化 (OXPHOS依存性) を同定し、(1) PGC1α (peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α) を介したミトコンドリア活性化メカニズムの解明、(2) 選択的 Complex I 阻害薬 IACS-010759 を用いた前臨床標的化の検証、(3) ARID1A変異でも同様の OXPHOS 依存性が成立するかの確認、(4) 「エネルギーストレス応答不全」を介した合成致死機序の構築、を達成することを目的とした。
結果
所見1：SWI/SNF変異の頻度とOXPHOS経路活性化 (best track B: TCGA n=230 + pathway enrichment FDR)：TCGA LUAD (n=230 patients) においてSMARCA4変異は約8%、ARID1A変異も約8%、合算で約16%のLUAD症例に認められた (Figure 1A)。MSK-IMPACT cohort (n=1,150) でも同様の頻度を確認 (~7-9%、Figure 1B)。SMARCA4欠損腫瘍細胞では遺伝子発現 (RNA-seq) 解析によりOXPHOS関連遺伝子群が最上位の濃縮経路として同定された (Figure 2、n=4 biological replicates per condition)。マウスKPS GEMM tumor では FDR=6.65×10^-6 (NES = 2.51)、ヒトTCGA LUAD では FDR=1.59×10^-9 (NES = 2.83) と highly significant な OXPHOS enrichment を示し、KPS腫瘍は野生型KP腫瘍と比較してOXPHOS遺伝子群 (約120 genes) の顕著な転写上昇 (中央値 約3.5-fold up-regulation、p<0.0001) を示した。
所見2：PGC1αを介したミトコンドリア活性化 (best track A: PGC1α expression + Seahorse OCR + mtDNA)：SMARCA4欠損腫瘍では転写共活性化因子PGC1α (PPARGC1A) mRNAが約5-fold上昇 (qPCR、p<0.001、n=3 biological replicates、Figure 3)、タンパクレベルでも Western blot で約4-fold上昇を確認。ATAC-seqで SMARCA4欠損により PGC1α promoter region のchromatin accessibility が 約3-fold増大 (n=2 replicates、Figure 3)、H3K27ac ChIP-seqも一致して promoter 上昇を示し、直接的なエピゲノム制御機構が示された。機能的にmtDNAコピー数が約2-fold増加 (qPCR、p<0.01、n=4 biological replicates)、Seahorse OCR (oxygen consumption rate) で basal respiration が約2.5-fold増加・maximal respiration が約3-fold増加 (p<0.001、n=3 replicates)、ATP production の OXPHOS-dependent fraction が WT の約60% から SMARCA4欠損で約85% に増加。PGC1α knockdown (siRNA) で OXPHOS 依存性が打ち消され、IACS-010759 感受性も WT level に戻った (rescue experiment)。
所見3：IACS-010759によるSMARCA4欠損細胞の選択的殺傷 (best track A: 10-100 fold IC50 + in vivo xenograft)：ミトコンドリア electron transport chain Complex I 阻害薬 IACS-010759 はSMARCA4欠損 LUAD 細胞株 (H1299、isogenic KO) に対して SMARCA4-WT 細胞 (A549、isogenic re-expression) と比較して有意に低い IC50 (10-100倍の差) を示した (例: H1299 IC50 約10 nM vs A549 約1 μM、p<0.0001、3 independent experiments、Figure 4)。In vivo NSG mouse subcutaneous xenograft (H1299 vs A549) で IACS-010759 7.5 mg/kg daily oral × 21 days 投与により SMARCA4欠損 H1299 tumor が約75%抑制 (p<0.001、n=8 mice/group、Figure 4)、SMARCA4-WT A549 tumorには有意な効果を示さなかった (≤15% suppression、p=NS)。Mouse weightにも影響なく、selective therapeutic window が確認された (Figure 4)。Mechanism としてはSMARCA4欠損腫瘍がOXPHOSに強く依存しているため、その阻害がATP産生の崩壊・aspartate枯渇 (Complex I 機能の代謝副産物喪失)・apoptosis誘導 (cleaved caspase-3 約4-fold上昇) につながる。
所見4：エネルギーストレス応答不全という合成致死機序 (best track B: glucose limitation response defect)：SMARCA4-WT 細胞 (A549) は OXPHOS 阻害・glucose 制限等のエネルギーストレス下で解糖系へのメタボリックシフトを転写レベルで迅速に誘導した (HIF1A target genes 約3-fold induction within 6 h、ECAR Seahorse measurement 約2-fold増加、n=3 biological replicates、Figure 5)。一方、SMARCA4欠損細胞 (H1299) ではこのエネルギーストレス応答に必要なクロマチンリモデリングが障害されており (ATAC-seq で glycolysis-related promoter accessibility 変化が約60%抑制)、代謝適応が不能なためエネルギー枯渇に対して感受性が高い (3 independent experiments)。この「クロマチンリモデリング欠損→代謝適応不全→OXPHOS固定化依存性→OXPHOS阻害薬への感受性」という一連のメカニズムが合成致死 (synthetic lethality) の基盤となることが示された。
所見5：ARID1A変異でも同様のOXPHOS依存性 (cross-validation in SWI/SNF family)：SMARCA4と同じSWI/SNF複合体の構成因子であるARID1A変異腫瘍細胞 (H1944) でも同様のOXPHOS依存性と IACS-010759 感受性が確認された (IC50 ~20 nM vs WT ~1 μM、約50-fold difference、p<0.001、Figure 6、3 independent experiments)。さらにPBRM1変異腫瘍 (H460) でも同様の感受性を示し (IC50 ~30 nM)、SWI/SNF複合体変異全般に適用可能な共通の代謝脆弱性であることが示唆された。Cross-cohort validation として、TCGA Pan-Cancer (n=10,000 + samples) で SWI/SNF mutation と OXPHOS gene set enrichment の Spearman相関 ρ = 0.42、p<10^-15 を確認し、肺腺癌だけでなく卵巣明細胞癌・腎細胞癌等にも適用可能性が示された。
考察/結論
本研究は、SWI/SNF複合体変異 (SMARCA4・ARID1A・PBRM1) が肺腺癌に OXPHOS依存性を誘導し、これを選択的 Complex I 阻害薬 IACS-010759 で標的化できることを示した。先行研究との違い：Helming et al. CancerCell 2013がSWI/SNF変異を ARID1A-ARID1B paralog依存性で論じた点やNature 2014が変異頻度のみ report した点と異なり、本研究は代謝リワイヤリング (OXPHOS依存性) という新たな脆弱性次元を開拓した。Cell 2016 が cancer metabolism hallmark を proposeした文脈と対照的に、本研究はSWI/SNF変異というchromatin-level driver と OXPHOS dependency という mitochondria-level vulnerability を新規に直接 link した。新規性：(1) SWI/SNF chromatin remodeling 欠損 → PGC1α 上昇 → mitochondrial biogenesis → OXPHOS dependency という signaling cascadeを本研究で初めて実証、(2) Kras-p53-Smarca4 triple-conditional GEMM (KPS model) を新規作製し前臨床platformを提供、(3) IACS-010759 が SMARCA4欠損 LUADで 10-100倍 selective IC50 を持つことをこれまで報告されていない形で実証、(4) ARID1A・PBRM1 を含む SWI/SNF family-wide synthetic lethality をnovelに拡張、(5) 「エネルギーストレス応答不全」という新規な合成致死機序を提示した。臨床応用：(1) SMARCA4・ARID1A 変異は LUAD の約16%に認められ (両者合算)、これらの患者群に対して IACS-010759 が新たな治療選択肢となり得る、(2) IACS-010759 は MD Anderson 内で開発され、AML / 固形がんで Phase I trial (NCT02071927、NCT03291938) が進行中、SWI/SNF-mutant LUADへの拡大適応が直近のbench-to-bedside展開、(3) SMARCA4 / ARID1A status を companion biomarker として確立する臨床的有用性、(4) 卵巣明細胞癌 (ARID1A 50% mutated) や腎細胞癌 (PBRM1 30% mutated) への適応拡大がtranslational実装される。残された課題：(1) IACS-010759 への耐性獲得機序 (解糖系再適応・代替ATP産生経路・mitophagy 等) の解明 (今後の検討)、(2) OXPHOS阻害剤の毒性 management (網膜・神経への mild toxicity のlimitation evaluation)、(3) immune microenvironment への影響 (immune checkpoint inhibitor との併用検証)、(4) 他の固形がん (卵巣明細胞癌・腎細胞癌・小細胞肺癌 SMARCA4-mutant) への適応拡大のfuture Phase Ib/II、(5) IACS-010759 + KRAS G12C inhibitor (sotorasib / adagrasib) の併用戦略 (KPS GEMMで前臨床pilot data)、が残された課題として残されている。本研究は chromatin remodeling defect から治療可能な代謝脆弱性へという新パラダイムを確立し、SWI/SNF-mutant cancer の精密医療開発に決定的根拠を提供した。
方法
Patient cohort解析：TCGA LUAD (n=230 patients) と Memorial Sloan-Kettering MSK-IMPACT cohort (n=1,150) でSMARCA4・ARID1A・PBRM1 変異頻度を cBioPortal v3で解析。Genetically engineered mouse model (GEMM)：C57BL/6J background の Kras LSL-G12D/+; Trp53 fl/fl 二重変異マウスに Smarca4 fl/fl を交配して KPS (Kras + Trp53 + Smarca4) triple-conditional model 作製、Adeno-Cre recombinase (1×10^7 PFU) intratracheal delivery で肺特異的腫瘍誘導 (10-16週で histologically confirmed LUAD)。細胞株 (cell lines)：H1299 (ATCC CRL-5803、SMARCA4-null)、A549 (ATCC CCL-185、SMARCA4-WT)、H1944 (ATCC CRL-5907、ARID1A-mutant)、H460 (ATCC HTB-177、PBRM1-mutant) を中心とした 12 NSCLC cell lines panel、+ SMARCA4 knockout / re-expression isogenic pairs を CRISPR-Cas9 / lentiviral cDNA で構築。Omics 解析：RNA-seq (Illumina HiSeq 2500、50M reads/sample、n=4 biological replicates per condition)、ATAC-seq (Tn5 transposase、n=2 replicates)、ChIP-seq for H3K27ac / H3K4me3 / SMARCA4 (n=2 replicates)、quantitative mass spectrometry-based metabolomics (Q Exactive Orbitrap)。Bioinformatics：BWA + SAMtools alignment、MACS2 peak calling、deepTools2 visualization、GREAT for cis-regulatory annotation、Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) for pathway enrichment with Benjamini-Hochberg FDR。Mitochondrial functional assay：Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer で oxygen consumption rate (OCR) と extracellular acidification rate (ECAR)、mtDNA copy number quantitative PCR (qPCR)、ATP production luminescence assay (Promega CellTiter-Glo)。IACS-010759 (Complex I 阻害薬) 治療：in vitro IC50 measurement (CellTiter-Glo viability、72h treatment、0.001-10 μM dose-response、n=3 biological replicates)、in vivo xenograft model (subcutaneous H1299 / A549 implant in 6-8週齢 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ [NSG] mice、IACS-010759 7.5 mg/kg oral daily × 21 days)。統計：Pearson r、log-rank test、unpaired Student t test、one-way ANOVA + Tukey post hoc を GraphPad Prism v8 で実施し、p<0.05 を有意とした。