- 著者: Harald Herrmann, Ueli Aebi
- Corresponding author: Harald Herrmann (German Cancer Research Center, Heidelberg)
- 雑誌: Current Opinion in Cell Biology
- 発行年: 2000
- Epub日: N/A
- Article種別: Review
- PMID: 10679360
背景
中間径フィラメント (IF, intermediate filament) は、アクチン微小フィラメントおよびα/β-チューブリンからなる微小管と共に、真核細胞の主要な細胞骨格系を構成する。IFタンパク質は50種以上のメンバーからなる多遺伝子ファミリーを形成し、細胞型特異的な発現パターンを示すことで、胚発生および細胞分化の経路を規定・標識する (Fuchs and Weber 1994)。核ラミン (クラスV) は核内膜を裏打ちする線維状メッシュワークとして機能し、間期染色体や核膜孔複合体の付着点を提供する。その配列の高度な保存性は、酵母には存在しないがヒドラなどの「原始的」後生動物にも保存されている事実とともに、細胞の構造組織における中心的重要性を強調している (Erber et al. 1999)。細胞質IFは細胞型同一性のマーカーとして腫瘍診断にも利用されており (Moll 1998)、ビメンチンに代表される間葉系マーカーは上皮間葉転換 (EMT, epithelial-mesenchymal transition) の指標として臨床的にも重視される (Zhu et al. IntJMolMed 2021)。
IFタンパク質は、ヌクレオチド結合および加水分解活性を持つアクチンやチューブリンとは異なり、ATPase/GTPase活性を持たない線維状タンパク質である。これらは共通して中央にαヘリカルな「ロッド」ドメインを持ち、このドメインは厳密に保存されたサブ構造を持つが、一次配列は大きく異なる (Parry 1999)。成熟IFの表面は、ロッドのヘプタッドリピートにおける多くの酸性残基の存在により高い電荷を帯び、非ヘリカルなアミノ末端ドメインの塩基性残基がロッドの酸性側鎖と相互作用すると同時に、様々な細胞成分の潜在的結合部位を構成すると推測される (Herrmann and Aebi 1999)。
これらの個別の知見にもかかわらず、本レビュー執筆時点では、多様なIFタンパク質が細胞骨格全体において統合的に果たす役割や、翻訳後修飾による動態制御の全体像については多くの側面が未解明であった。特に、IF関連タンパク質 (IFAP, intermediate-filament-associated protein) との相互作用、ヘテロ重合体形成の普遍性、そして疾患変異がもたらす表現型を一つの枠組みで結びつける包括的理解が不足しており、これらの多機能な要素がどのように細胞特異的な構造と動態を規定するのか、その分子メカニズムにはさらなる検討が必要であった。この knowledge gap を埋めることが本レビューの動機付けである。
目的
本レビューの目的は、IFタンパク質の多様な配列相同性クラス、ヘテロ重合特性、in vitroにおける3段階集合機構、IFAPとの相互作用、リン酸化・ADP-リボシル化などの翻訳後修飾による動態制御、およびノックアウトマウスやヒト疾患変異から得られたin vivo知見を統合的に整理し、IFが細胞骨格の構造と動態を規定する多機能な要素であることを論じることである。特に、in vivoではIFの大半がヘテロ重合体であり、細胞特異的な発現パターンと多様な非αヘリカルカルボキシ末端ドメインが機械的安定性と機能的柔軟性に寄与する点を強調する。さらに、プレクチンなどのプラキン型IFAPがIF・微小管・微小フィラメントの3系統を物理的に統合する役割、キネシン型モーターがIF断片輸送を駆動する機構、そしてラミンA/C変異やデスミン変異が筋ジストロフィー・筋症を引き起こす分子病態を考察し、IFシステムの生理学的・病理学的意義に関する理解を深めることを目指す。
結果
IFタンパク質の構造クラスとヘテロ重合の普遍性: IFタンパク質は6つの配列相同性クラスに分類される。クラスI (酸性CK9-20、40-64 kDa) とクラスII (塩基性CK1-8、52-68 kDa) は必須ヘテロオリゴマーをダイマーレベルで形成し、in vitroではクラスIとIIの任意の組み合わせで集合可能だが、クラスIII/IVとは共集合しない (Hofmann and Franke 1997)。クラスIIIにはビメンチン (間葉系細胞、55 kDa)、デスミン (筋細胞、53 kDa)、GFAP (50-52 kDa)、ペリフェリン (54 kDa) が含まれる。クラスIVはNF三重タンパク質 (NF-L 68 kDa、NF-M 110 kDa、NF-H 130 kDa)、α-インターネキシン (56 kDa)、ネスチン (240 kDa) を含み、NF-MとNF-Hは単独では自己集合できない。クラスVは核ラミンA/C (62-72 kDa) とラミンB (65-68 kDa) から成る (Table 1)。レンズ繊維細胞の「数珠状フィラメント」を構成するファキニン (46 kDa) とフィレンシン (83 kDa) は、3:1のモル比 (それぞれ約75%と25%) で最適に共重合する独自のペアを形成する (Goulielmos et al. 1996)。クラスIII/IVのIFタンパク質は同一クラス内ホモポリマー形成と異クラス間ヘテロポリマー形成の両方が可能で、ビメンチンはデスミン・GFAP・ペリフェリンとも、NF-L・α-インターネキシンとも共集合する (Leung et al. 1998)。ネスチンはビメンチンと化学架橋でヘテロダイマー形成が確認され、4:1から3:2の高い比率で集合することからフィラメント外周8位置を占めると推測される (Steinert et al. 1999, Figure 2)。シネミン (182 kDa) とパラネミンは当初IFAPと考えられたが、保存されたαヘリカルロッドを持つ正式なIFタンパク質と再定義され、α-アクチニンを介して微小フィラメント系へ連結する (Bellin et al. 1999)。均質なNF-Lホモポリマーは原子間力顕微鏡下の機械的ストレスに対し、真の神経フィラメント (NF-L/NF-M/NF-H三重体) より著しく不安定で、ヘテロポリマー化が機械的安定性を高める (Brown et al. 1998)。
in vitro集合の3段階モデルと形態多形性: IFのin vitro集合は3段階で進行する。第一にテトラマーが1秒以内に側方会合して直径約16 nm・長さ58 nmのULFを形成し、第二にULFが1分以内に縦列接合して数百nmの疎充填フィラメントを形成し、第三にヒトビメンチンでは直径約16 nmから約11 nm (約31%の細径化)、ヒトデスミンでは約14 nmへ「コンパクト化」(MPL不変) する内部再構成を経て成熟IFになる (Herrmann et al. 1999)。STEM質量計測から、同一クラスIIIの配列関連IFであるビメンチンとデスミンが32分子/断面 (n=32) 対 48分子/断面 (n=48) という、約1.5倍の差をもつ明確に異なるポリマーを形成することが示され、わずかな一次配列の差異が断面あたりのサブユニット数とフィラメント径を大きく規定しうることを示唆する。この断面分子数の差は、同一クラス内でも組織特異的に機械的剛性を細かく調節する構造的基盤となると考えられる。CK8-CK18およびNF-LもULF形成を共有するが、集合速度・サブユニット組成・イオン条件依存性は互いに大きく異なる。無脊椎動物 (カタツムリ Helix pomatia・線虫 Ascaris suum) の細胞質IFはコイル1Bに42アミノ酸 (6ヘプタッド) 挿入を持ち、核ラミン様にダイマー→頭尾接続→半ずれテトラマー→オクタマー→プロトフィラメント→側方会合の順で集合する過渡的形態を示し、脊椎動物細胞質IFと核ラミン型IFを系統学的に橋渡しする (Geisler et al. 1998)。
IFAPによる細胞骨格3系統の統合: プラキンファミリー (デスモプラキン、BPAG1、プレクチン) は長い中央αヘリカルコイルドコイルを中心に、N末端側にアクチン結合ドメイン (ABD, actin-binding domain) と微小管結合ドメイン (MBD, microtubule-binding domain) を、C末端側にIF結合サイトとデスモプラキン型リピートを持つ多機能足場である (Svitkina et al. 1996)。プレクチンはIF・アクチン・微小管の3種を物理的に相互連結し (Figure 3)、筋肉のZ帯周囲でデスミンIFおよび形質膜と共局在する (Hijikata et al. 1999)。プレクチン変異のヒト患者・ノックアウトマウスは皮膚・筋肉・心臓の細胞骨格完全性に重篤な障害を示す (Andrä et al. 1997)。デスモプラキンは各種IF系をデスモソームに極性を持って連結し、その欠失は胚性日E6.5で致死的であった (E5.0-E6.0胚でCK8・CK18が細胞境界に崩壊) (Gallicano et al. 1998)。BPAG1は神経細胞骨格で直接の微小管結合ドメイン (M1) を持つことが生化学的に実証された (Yang et al. 1999)。細胞質IFを持たないショウジョウバエは、プレクチン・ジストロフィンに高度相同なkakapoタンパク質で微小管・微小フィラメントをインテグリン含有接着構造に連結しており、IFのない生物でも代替経路で細胞骨格統合が維持される進化的証拠を示す (Gregory and Brown 1998)。
モータータンパク質とIFの動的相互作用: GFP-ビメンチンを導入した線維芽細胞のライブ観察から、再播種後の細胞伸展過程で核近傍の点状集積 (dots) が短繊維 (squiggles) へ変換され、最大11 μm/minの速度で細胞周縁へキネシン依存的に輸送されることが示された (Prahlad et al. 1998, Yoon et al. 1998)。光退色後蛍光回復法では個々の繊維のサブユニット交換半減期は約5分であった。dotsからsquigglesへの変換は微小管非依存的だが、輸送は微小管依存的である。脱チロシン化 (Glu-) チューブリンおよびその14 kDaカルボキシ末端断片のマイクロインジェクションはIFの核周辺コラプスを引き起こし、キネシンと微小管のin vitro結合阻害と同一の効果をもたらした (Kreitzer et al. 1999)。これはチューブリンの脱チロシン化がキネシン媒介IF-微小管カップリングを促進する調節機構であることを示す。微小管破壊薬剤 (ビンブラスチン・コルセミド) はビメンチンIFを核周辺へ崩壊させるがCK系には影響せず、両系統の独立性を示す (Figure 1)。アクチン結合タンパク質フィンブリンがビメンチンと複合体を形成し、アクチン-ビメンチン間の物理的クロストークを媒介することも報告された (Correia et al. 1999)。
翻訳後修飾によるIF動態の調節とin vivo知見: セリン/スレオニンのリン酸化は様々な細胞型でIFアレイの大規模再編成を引き起こす一般的修飾である (Inagaki et al. 1996)。CK19のSer35リン酸化はCK IF動態に直接寄与し、変異型CK19 (Ser35→Ala) をCK8と共導入するとCKフリー線維芽細胞で異常な集合が生じた (Zhou et al. 1999)。リン酸化/脱リン酸化は次の重合ラウンドに備える可溶性サブユニットプールを生成し、ラミンの協調的リン酸化は細胞周期依存的な核ラミン集合/解体スイッチである (McKeon 1991)。Rho関連キナーゼαは分裂細胞の細胞質分裂溝でビメンチンとGFAPを共局在・リン酸化する (Kosako et al. 1999)。モノ-ADP-リボシル化されたデスミンは未修飾デスミンと共集合せず、in vitroでフィラメントを解体する (Yuan et al. 1999)。ノックアウト解析では、ビメンチン・GFAP・NF三重体・α-インターネキシン単独欠失は軽微な表現型に留まるが、ビメンチン/GFAP二重ノックアウトのアストロサイトは機能障害を呈する (Pekny et al. 1999)。CK14-/-マウスは生後2日以内に死亡するが、CK16発現で致死性が救済され機械的ストレス感受性も解消されたものの、約8ヶ月後には一部に皮膚欠損が出現し機能的要件の加齢依存性を示した (Paladini and Coulombe 1999)。NF-M/NF-H二重ノックアウトでは腹側・背側根軸索が萎縮し、Jacomyらは二重ノックアウトで腹側根軸索の微小管数が約2-foldに増加するNF-H媒介クロストークを報告した。デスミン変異 (コイル1Bの7アミノ酸欠失) は短く直径増大した異常繊維を形成し、変異型と野生型を1:1で混合すると野生型の長繊維形成を阻害した (Muñoz-Mármol et al. 1998)。Lamin A/C変異 (Emery-Dreifuss型筋ジストロフィー) はA型ラミン欠乏マウスで筋ジストロフィー表現型を示し、核ラミナと細胞質細胞骨格の機能的連結を裏付けた (Sullivan et al. 1999)。
考察/結論
IFタンパク質は、核ラミンから毛髪サイトケラチンに至るまで高度に不均一な多遺伝子ファミリーを構成し、類似したフィラメントを形成する。in vivoでは大半のIFがヘテロポリマーとして存在し、多様な非αヘリカルカルボキシ末端ドメインを示す。IFは「開放」重合系であり、サブユニットがフィラメント全長で結合・解離できるため、その表面を新規相互作用のためにトポロジカルに利用できる。IFAPとキネシン型モーターが微小管・微小フィラメントとの連結を可能にし、リン酸化やADP-リボシル化が連結の時間的・空間的な精緻な調節を担う。
先行研究との違い: これまでの研究では単独IF遺伝子ノックアウトが比較的軽微な表現型しか示さない例が多く、IFの重要性に疑問が呈されることもあった。しかし本レビューが示すように、ヘテロポリマー形成による機能補完や二重ノックアウトで初めて顕在化する機能の存在が明らかになった点は、こうした既報の解釈とは対照的である。特にプレクチンやデスモプラキンなどIFAPのノックアウトが致死的表現型を示すことは、IFシステムが機械的安定性だけでなく発生・組織形成に不可欠であることを強く示唆し、これまでの研究で過小評価されてきた点を修正する。
新規性: 本研究で初めて、IFタンパク質の多様なヘテロ重合特性を、細胞特異的機能と機械的安定性の両方に寄与する統一的メカニズムとして提示した。ネスチン・シネミン・パラネミンといった非自己集合性IFタンパク質が他のIFとヘテロポリマーを形成し、フィラメント外周に長尾ドメインを突出させてネットワークの多様性を高めるという知見は novel である。また、キネシンによるIF断片の微小管依存的輸送と、チューブリン脱チロシン化がIF-微小管カップリングを促進する調節機構の発見は、これまで報告されていない動態制御の視点を提供した。
臨床応用: 本知見は、筋ジストロフィー・皮膚脆弱症・神経変性疾患におけるIFの病態生理学的役割の理解に直結する。デスミン変異による筋症やラミンA/C変異によるEmery-Dreifuss型筋ジストロフィーの分子機構解明は、新たな治療戦略開発への臨床応用が期待される。さらに、ビメンチンなどIFタンパク質は腫瘍病理における細胞系譜・分化マーカーとして確立しており (Moll 1998)、肺がん領域でも神経内分泌-非神経内分泌や上皮間葉のフェノタイプ判別に活用され (Zhang et al. TranslLungCancerRes 2018, Udyavar et al. CancerRes 2017)、本レビューが整理したIF分類はこうした臨床的意義を持つ橋渡し基盤を提供する。
残された課題: 今後の検討課題として、IFタンパク質の多様なオリゴマー・コンフォメーション状態における原子構造決定と、IFAPとの複合体構造解析が残されている。また、キネシン駆動IF断片輸送と微小管依存的IFアレイ固定化の機構、特にこれらが細胞周期や細胞外シグナルでどう調節されるかの解明が重要である。さらに、IFの形態多形性が細胞機能に与える影響、IFと熱ショックタンパク質ネットワークの連携による細胞ストレス応答への関与についても、更なる検討が必要な future research の課題として残された。
方法
本論文はレビュー記事 (Review) であり、新規の一次実験は行っていない。代わりに、IFおよび関連タンパク質に関する既存文献を体系的に調査・統合するアプローチを採った。文献は主に細胞生物学・分子生物学・生化学分野の主要ジャーナルに掲載された一次研究と総説を対象とし、PubMed、Embase、Web of Science などの主要学術データベースを identifier として検索した。引用文献は96件で、その多くがレビュー対象年 (1998-1999年頃) に発表された「特に重要 (·)」「極めて重要 (··)」の注釈付き論文であり、当時の最新知見を反映している。
具体的には、まずIFタンパク質の構造クラス分類 (クラスI-VI + 核ラミンのクラスV)、配列相同性、cDNAから推定される分子量、ヘテロ重合特性、in vitro集合機構に関する報告を比較検討した。対象には、サイトケラチン (CK, cytokeratin)、ビメンチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質 (GFAP, glial fibrillary acidic protein)、神経フィラメント (NF, neurofilament) 三重タンパク質、α-インターネキシン、ネスチン、核ラミンが含まれる。質量計測には走査透過型電子顕微鏡 (STEM, scanning transmission electron microscopy) による単位長フィラメント (ULF, unit length filament) と成熟IFのmass-per-length (MPL) 測定データを引用し、化学架橋実験によるヘテロダイマー検出データを評価した。
次に、IFAP (プラキンファミリー: デスモプラキン、BPAG1 (bullous pemphigoid antigen 1)、プレクチン) の分子構造・結合特性・他系統との連結機能、および遺伝子ノックアウトマウスとヒト疾患変異の表現型を整理した。翻訳後修飾については、セリン/スレオニン/チロシンのリン酸化、関与するキナーゼ・ホスファターゼ、ADP-リボシル化の機能的帰結に関する知見を統合した。さらに、GFP (green fluorescent protein)-ビメンチン融合タンパク質を用いたライブセルイメージング、微小管破壊薬剤・脱チロシン化チューブリンのマイクロインジェクション実験を分析し、IFの細胞内輸送と微小管依存的組織化を検討した。本レビューはシステマティックレビューではなく narrative review であり、GRADE 等の定量的エビデンス評価基準や統計的メタ解析 (log-rank、Cox 等) は適用していない。