- 著者: Lucotti S, Cerutti C, Soyer M, et al.
- Corresponding author: Ruth J. Muschel (University of Oxford)
- 雑誌: Journal of Clinical Investigation
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-03-25
- Article種別: Original Article
- PMID: 30907747
背景
転移はがん関連死の主要原因であり、その予防は臨床的に重要な課題である。プロスタノイドはシクロオキシゲナーゼ-1 (COX-1) およびシクロオキシゲナーゼ-2 (COX-2) の活性により産生される生理活性脂質群であり、プロスタグランジン (PGD2, PGE2, PGF2a)、トロンボキサンA2 (TXA2)、プロスタサイクリン (PGI2) などを含む。アスピリンは両COXアイソフォームを不可逆的に阻害することで、全てのプロスタノイド生合成を抑制する。長期的なアスピリン投与は、マウスモデルおよび臨床試験において遠隔転移の減少をもたらすことが報告されているが (Gasic et al. 1973, Connolly et al. 2002)、その抗転移効果に関与するCOXアイソフォーム、下流プロスタノイド、および細胞コンパートメントは未解明であった。
COX-1とCOX-2は酵素活性はほぼ同一であるものの、細胞種における発現パターンやプロスタノイド合成酵素との機能的結合が異なるため、産生されるプロスタノイドのスペクトルはインビボで異なる (Kihara et al. 2014)。例えば、COX-2は炎症や創傷治癒時に内皮細胞やマクロファージで誘導され、PGE2合成酵素と結合して炎症性PGE2を産生する (Kirkby et al. 2016)。一方、COX-1は構成的に発現し、血小板ではTXA2合成酵素 (TXAS) と結合して、凝固刺激（コラーゲン、トロンビン、ADPなど）に応答して血栓形成促進性のTXA2を生成する (FitzGerald 1991, Patrono et al. 2005)。
NSAIDsを含むCOX阻害剤が転移を抑制するという報告は多数あるが (Zhao et al. 2017)、特定のCOX-2阻害が転移を抑制するという報告もあれば (Singh et al. 2007)、そうでない報告もあり (Xu et al. 2014)、どのアイソフォームが重要であるかは一貫した見解が得られていない。また、TXA2やPGE2合成の阻害が動物モデルで転移を減少させる一方で (Honn 1983, Nie et al. 2000)、PGI2は転移を抑制すると報告されているが (Ho et al. 2013)、一部例外もある (Karpatkin et al. 1984)。これらの先行研究は、プロスタノイドが転移予防の標的となり得る可能性を示唆するものの、どのプロスタノイドがどの細胞コンパートメントで転移に寄与するのかという知識ギャップが残されている。
血小板は、腫瘍細胞が血流の敵対的な環境で生存するために共存する多様な細胞タイプの一つであり (Strilic and Offermanns 2017)、組織因子 (TF) やP-セレクチンリガンドの発現を介して、腫瘍細胞表面に小さな凝集体や血栓を形成することが知られている (Gil-Bernabé et al. 2012, Kim et al. 1998)。血小板の凝集と活性化は、腫瘍細胞の血中生存を直接的または骨髄系細胞の動員を介して支持し、血管表面での癌細胞の拡散や血管内皮細胞を介した遊走を開始させることが示唆されている (Labelle et al. 2011, Im et al. 2004)。しかし、血小板がCOX-1/TXA2依存的に腫瘍細胞周囲に凝集して転移を促進するという仮説は提唱されていたものの、その直接的な証明は不足していた。アスピリンの抗転移効果の分子メカニズムを詳細に解明することは、より安全で効果的な転移予防戦略の開発に繋がるため、重要な課題である。
目的
本研究の目的は、アスピリンの抗転移効果において、COX-1とCOX-2のどちらのアイソフォームが寄与するか、下流プロスタノイドとしてTXA2が重要であるか、そしてどの細胞（特に血小板）がその産生源であるかを、選択的阻害薬、遺伝子欠損マウス、および血小板移植実験という複数の独立した手法を用いて包括的に解明することである。具体的には、以下の点を明らかにすることを目指した。
- アスピリンの抗転移効果がCOX-1とCOX-2のどちらの阻害に起因するかを、用量依存的なCOX阻害プロファイルと選択的COX阻害薬を用いて評価する。
- COX-1依存的な抗転移効果において、TXA2が主要なメディエーターであるかを、TXA2合成酵素阻害薬およびTXA2受容体拮抗薬、ならびにTXA2アナログの補充実験を用いて検証する。
- 血小板のCOX-1が転移における決定的な細胞コンパートメントであるかを、COX-1欠損マウス (Ptgs1-/- mice) および血小板枯渇後の血小板再輸注実験を用いて特定する。
- COX-1/TXA2経路の阻害が、血管内転移ニッチの形成（腫瘍細胞への血小板凝集、内皮活性化、腫瘍細胞の内皮への接着、転移促進性単球/マクロファージの動員）および転移前ニッチ形成に与える影響を詳細に解析する。
- アスピリンの抗転移効果が転移のどの段階（血管内滞在期、管外遊走期、血管外増殖期）に限定されるかを、時相別投与実験により特定する。
結果
アスピリンの抗転移効果とCOX-1/COX-2の役割: アスピリンの中・高用量投与により、血清TXB2濃度が95%以上減少し (COX-1阻害の指標)、アラキドン酸およびU46619誘導性の血小板凝集が抑制された (図1B-D)。具体的には、中用量アスピリン群では血清TXB2が約1 ng/mLに減少し、対照群の約100 ng/mLと比較して有意な抑制が認められた (p≤0.001, n=3 mice)。一方、低用量アスピリンではTXB2の95%以上の減少は認められなかった。全ての用量のアスピリンでLPS誘導後の血漿PGE2濃度が減少した (COX-2阻害の指標) (図1F)。実験的転移モデルにおいて、中・高用量アスピリンはB16F10肺転移結節数を50%以上減少させた (p<0.001, n=5-6 mice) が、低用量では効果がなかった (図2B, C)。この結果は、TXB2の95%以上の減少と転移抑制効果が強く相関することを示唆する。また、アスピリンはMC-38-GFP、4T1、MDA-MB-231-CFP細胞を用いた他の転移モデルでも転移結節数を減少させた (Supplemental Figure 3)。4T1乳がん細胞を用いた自然発症転移モデルにおいても、アスピリンは肺および肝転移結節数、肺内の播種性腫瘍細胞数、循環腫瘍細胞 (CTCs) 数およびその浸潤能を有意に減少させた (図2F-I)。
COX-1阻害が転移抑制に十分であること: COX-1選択的阻害薬SC-560は、B16F10、MC-38-GFP、4T1、MDA-MB-231-CFPモデルにおいて転移結節数を有意に減少させた (p<0.001, n=12-16 mice) (図3C, D)。SC-560投与群では、平均転移結節数が約20個であり、対照群の約100個と比較して顕著な減少を示した。一方、COX-2選択的阻害薬NS-398は転移結節数に変化を与えなかったが、コロニーサイズのみを減少させた (図3E, F)。COX-1欠損マウス (COX-1-/- mice) では、野生型マウス (COX-1+/+ mice) と比較してB16F10細胞による実験的肺転移結節数が有意に減少した (p<0.001, n=7 mice) (図4A, B)。COX-1-/-マウスの転移結節数は平均約20個であり、COX-1+/+マウスの約120個から大幅に減少した。これらの結果は、アスピリンの抗転移効果が主にCOX-1阻害に起因することを示唆する。
COX-1阻害は血管内滞在期にのみ抗転移効果を持つ: 転移の各フェーズに合わせた薬物投与実験を実施した。アスピリンおよびSC-560は、血管内フェーズ (day -2→+1) にのみ投与した場合でも転移結節数を有意に減少させた (p<0.001, n=11-14 mice) が、管外遊走フェーズ (day +1→+4) および血管外フェーズ (day +4→+21) では効果が認められなかった (p>0.05 vs. NS) (図5B, C)。腫瘍細胞注射24時間後の肺への早期滞留も、アスピリン、SC-560、およびCOX-1欠損マウスで有意に減少した (p<0.01, n=5-12 mice) (図5E, F)。これらの所見は、COX-1が宿主細胞において腫瘍細胞の肺内滞留および転移開始に必要であり、その阻害が転移の初期段階に限定的な効果を持つことを示唆する。
TXA2がCOX-1依存的抗転移効果の主要メディエーター: TXA2合成酵素阻害薬兼TP受容体拮抗薬であるpicotamide (PICO) は、血漿TXB2濃度および血小板凝集を有意に減少させ (p<0.001, n=4-6 mice) (図6B-D)、B16F10および4T1モデルにおける転移結節数、ならびに肺への24時間早期腫瘍細胞滞留を有意に減少させた (p<0.01, n=6-14 mice) (図6E, F, H, I)。picotamide処理群では、B16F10肺転移結節数が約30個に減少し、対照群の約180個と比較して大幅な抑制が観察された。TP受容体拮抗薬vapiprostも早期腫瘍細胞肺滞留を抑制した (Supplemental Figure 6)。アスピリン処理マウスに安定型TXA2アナログU46619を補充すると、24時間後の腫瘍細胞肺滞留および実験的転移結節数がコントロールレベルに回復した (p<0.01, n=5-10 mice) (図7D, E, G, H)。これらの結果は、COX-1由来のTXA2がアスピリンによる転移抑制の中心的役割を担うことを強く示唆する。
血小板のCOX-1が転移に必要: インビトロの血小板-腫瘍細胞共培養実験において、COX-1+/+血小板のみがTXB2を産生し、COX-1-/-血小板、B16F10細胞、または肺微小血管内皮細胞 (LMVEC) はTXB2を産生しなかった (図8D)。COX-1+/+血小板単独培養ではTXB2濃度が約100 pg/mLであったのに対し、他の細胞群では検出限界以下であった。血小板枯渇後の血小板再輸注実験では、COX-1+/+血小板の再輸注は、COX-1-/-血小板の再輸注と比較して、24時間後の腫瘍細胞肺滞留 (p<0.01, n=5 mice) および転移結節数 (p<0.001, n=8 mice) を有意に増加させた (図8E, G, H)。アスピリン、SC-560、およびpicotamideで処理した血小板の再輸注では転移の回復は認められなかったが、NS-398で処理した血小板では転移が回復した (図8G, H)。これらのデータは、血小板のCOX-1/TXA2経路が転移成立における決定的な細胞コンパートメントであることを明確に証明した。
COX-1/TXA2阻害による血管内転移ニッチ構成要素の抑制: アスピリン、SC-560、およびpicotamideは、腫瘍細胞周囲の血小板凝集（クロット形成数およびサイズ）を有意に減少させた (p<0.001, n=3 mice) (図8A-C)。COX-1/TXA2阻害は血管径の増大（血管収縮の抑制）と関連した (Supplemental Figure 11)。Cx3cr1-GFP+単球/マクロファージのB16F10細胞周囲への集積（血管内微小転移ニッチ形成の指標）が、アスピリン、SC-560、およびpicotamideによって有意に減少した (p<0.01, n=3 mice) (図9A, B)。腫瘍細胞周囲の血管におけるE-selectinおよびVCAM-1の発現（内皮活性化の指標）も、COX-1/TXA2阻害により減少した (図9D-F)。COX-1欠損血小板を輸注した群では、血小板凝集、内皮活性化、単球集積、血管径変化の全てがCOX-1野生型血小板群と比較して有意に抑制された (p<0.05, n=3 mice) (図10)。インビトロのフローアッセイでは、アスピリンおよびSC-560がLMVEC単層への腫瘍細胞接着および血小板の腫瘍細胞への結合を減少させた (Supplemental Figure 10)。
COX-1/TXA2阻害による転移前ニッチ抑制: 皮下B16F10腫瘍担がんマウスでは、腫瘍なしマウスと比較して実験的転移でのコロニー数が増加したが、アスピリン処理（腫瘍接種後開始、腫瘍細胞注射2日前に中断）によってこの増加が完全に消失した (図11B)。転移前肺におけるCx3CR1-GFP+単球/マクロファージ数の増加もアスピリンで消失した (p<0.01, n=3 mice) (図11C, D)。これらの結果は、COX-1/TXA2経路が転移前ニッチの形成にも寄与することを示唆する。
P2Y12受容体拮抗薬clopidogrelおよびαIIbβ3インテグリン阻害薬eptifibatideはADP誘導性血小板凝集を減少させたが、血漿TXB2レベルには影響せず、B16F10細胞の早期肺滞留にも影響を与えなかった (図12D, E)。このことは、TXA2シグナル伝達が血小板凝集の他の経路とは異なる、早期転移ニッチ形成に特異的に必要な経路であることを示唆する。
考察/結論
本研究は、アスピリンの抗転移効果がCOX-2ではなくCOX-1阻害に起因し、血小板由来TXA2がその主要メディエーターであることを、選択的阻害薬、遺伝子欠損マウス、および細胞移植実験という複数の独立した手法で包括的に証明した。
新規性: 本研究で初めて、アスピリンの抗転移効果が血小板のCOX-1活性とその産物であるTXA2の抑制に特異的に依存することを明確に示した。特に、血小板のCOX-1が転移における決定的な細胞コンパートメントであり、その阻害が転移の初期段階である血管内滞在期に限定的な効果を持つという知見は新規である。TXA2が血小板凝集、内皮活性化、単球/マクロファージ動員、転移前ニッチ形成の連鎖を駆動するオーケストレーターとして機能するというモデルを提示したことは、転移メカニズムの理解を深める上で重要な貢献である。
先行研究との違い: 先行研究では、血小板-腫瘍細胞相互作用が転移を促進することが示唆されていたが (Labelle et al. 2011)、そのメカニズムの中核がCOX-1/TXA2であり、血小板が主要な産生源であることはこれまで報告されていなかった。本研究は、COX-1阻害が転移を抑制するという知見が、低用量アスピリンのヒト心血管予防用量がCOX-1に選択的に作用するという薬理学的特性と整合し、疫学的なアスピリンの抗転移効果（Rothwell et al. 2012のHR 0.74-0.45）の分子機構を説明する。COX-2阻害が転移を抑制するという一部の報告 (Singh et al. 2007) とは対照的に、本研究ではCOX-1阻害が転移抑制に主要な役割を果たすことを示し、COXアイソフォームの役割に関する議論に新たな視点を提供した。
臨床応用: 本知見は、がん患者に対するアスピリンの補助療法としての臨床応用に直結する。特に、低用量アスピリンが血小板COX-1を優先的に阻害し、心血管イベント予防に用いられる用量で転移抑制効果を発揮するという事実は、既存薬の新たな価値を提示する。TXA2合成酵素阻害薬兼TP拮抗薬であるpicotamideがアスピリンと同等の抗転移効果を示したことは、COX-1産物のうちTXA2のみを選択的に標的にしつつ、胃保護的なCOX-1産物（PGI2など）を温存できる可能性を示唆する。これにより、副作用プロファイルが改善された転移予防薬として将来性があり、臨床現場での安全性と有効性を両立した治療選択肢となり得る。
残された課題: 今後の検討課題として、本研究で詳細にメカニズムを解析したB16F10黒色腫細胞以外の多様な癌種におけるCOX-1/TXA2経路の関与を検証する必要がある。また、P2Y12受容体拮抗薬やαIIbβ3インテグリン阻害薬が早期転移ニッチ形成に影響を与えなかったという結果は、TXA2シグナル伝達が他の血小板活性化経路とは異なる特異的な役割を持つことを示唆するが、これらの経路が転移の後期段階（上皮間葉転換や血管外遊走など）に寄与する可能性も残されている。これらの経路とTXA2経路との相互作用についても、さらなる研究が必要である。Limitationとして、本研究は主にマウスモデルでの検討であり、ヒトにおける詳細なメカニズムの検証や、長期的なアスピリン投与の安全性と有効性に関する大規模臨床試験の結果（例: ADD-ASPIRIN Trial）との整合性を確認することが今後の重要な課題である。
方法
本研究では、C57BL/6マウスにB16F10黒色腫細胞を用いた実験的転移モデル（静脈内注射）およびBALB/cマウスに4T1乳がん細胞を用いた自然発症転移モデル（皮下腫瘍形成後の自然転移）を主に使用した。さらに、MC-38-GFP結腸直腸癌細胞およびMDA-MB-231-CFPヒト乳がん細胞を用いたモデルも一部で採用した。
薬物投与: アスピリン (ASA) は低用量 (30 mg/L)、中用量 (180 mg/L)、高用量 (625 mg/L) で飲水投与した。COX-1選択的阻害薬SC-560 (24 mg/L) およびCOX-2選択的阻害薬NS-398 (12 mg/L) も飲水投与した。TXA2合成酵素阻害薬兼TP受容体拮抗薬picotamide (PICO; 30 mg/L) およびTP受容体拮抗薬vapiprost (20 mg/L) も飲水投与した。TXA2アナログU46619 (50 μg/kg) はアスピリン処理マウスに補充投与した。血小板凝集を抑制する他の薬剤として、P2Y12 ADP受容体拮抗薬clopidogrel (10 mg/kg/d) およびαIIbβ3インテグリン阻害薬eptifibatide (0.5 mg/kg/d) を腹腔内注射で投与した。
薬理作用の確認: COX-1活性のマーカーとして血清TXB2濃度を、COX-2活性のマーカーとしてLPS誘導後の血漿PGE2濃度を測定した。血小板凝集能は、アラキドン酸、U46619、ADPをアゴニストとしてフローサイトメトリーにより評価した。
遺伝子欠損マウスおよび血小板移植実験: COX-1欠損マウス (Ptgs1-/- mice) を使用し、B16F10細胞の実験的肺転移を評価した。血小板枯渇実験では、R300抗体で血小板を枯渇させた後、COX-1+/+またはCOX-1-/-マウス由来の血小板、あるいは薬物処理した血小板を輸注し、腫瘍細胞の肺滞留および転移結節形成への影響を評価した。
転移各フェーズへの影響評価: 転移の時相別実験として、薬物投与期間を血管内フェーズ (day -2→+1)、管外遊走フェーズ (day +1→+4)、血管外フェーズ (day +4→+21) に分けて、転移結節数および24時間後の肺への早期腫瘍細胞滞留数を評価した。
血管内転移ニッチの評価: 蛍光標識B16F10細胞 (B16F10-CMAC) とPKH26標識血小板 (Plts-PKH26) を共注射し、共焦点顕微鏡を用いて腫瘍細胞周囲の血小板凝集（クロット形成数・サイズ）を評価した。Cx3cr1gfp/+マウスを用いて、Cx3cr1-GFP+単球/マクロファージの腫瘍細胞周囲への集積を可視化した (Qian et al. Nature 2011)。E-selectinおよびVCAM-1の免疫染色により、腫瘍細胞周囲の血管内皮活性化を評価した。血管径の変化も測定した。インビトロでは、LMVEC単層への腫瘍細胞接着をフローアッセイで評価した。
転移前ニッチの評価: 皮下B16F10腫瘍担がんマウスにおいて、腫瘍接種後にアスピリンを投与し、腫瘍細胞注射2日前に中断することで、転移前肺におけるCx3CR1-GFP+単球/マクロファージ数の変化および実験的転移でのコロニー数への影響を評価した (Kaplan et al. Nature 2005)。
統計解析: GraphPad Prism (version 5.02) を用いて統計解析を実施した。正規分布データにはunpaired t検定または一元配置ANOVAとTukeyの多重比較検定、Pearsonの相関検定を適用した。非正規分布データにはMann-Whitney検定、Kruskal-WallisとDunnの多重比較事後検定、またはSpearmanの相関検定を適用した。P値が0.05未満を有意差ありと判断した。