- 著者: Shigeki Nakayama, Nadia J.W. Sng, Julien Carretero, Jihye Welker Leidner, Takeshi Hayashi, Xiaoling Yamamoto, Takefumi Ohtsuka, Hisatoshi Sugiura, Masaaki Hynes, Cyril Benes, Kwok-Kin Wong, Adam J. Bass, Susumu S. Kobayashi
- Corresponding author: Susumu S. Kobayashi (Division of Hematology/Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Boston, MA, USA)
- 雑誌: Cancer Research
- 発行年: 2014
- Epub日: N/A
- Article種別: Original Article
- PMID: 25164010
背景
非小細胞肺がん (NSCLC) における上皮成長因子受容体 (EGFR) の活性化変異 (L858RおよびExon 19欠失) の発見と、それに続くEGFRチロシンキナーゼ阻害剤 (EGFR-TKI) の開発は、肺がん治療に革命をもたらした。しかし、ほぼ全ての患者でEGFR-TKIに対する耐性が獲得され、特に二次変異であるT790Mがその主要な機序として50%以上を占めることが知られている (Sequist et al. SciTranslMed 2011)。第一世代EGFR-TKI (ゲフィチニブ、エルロチニブ) は初期奏効率が高いものの、T790M変異を持つ腫瘍に対しては効果が限定的であり、第二世代TKI (アファチニブ、ネラチニブ) もT790M変異を持つ患者に対しては十分な臨床効果を示せていないのが現状である (Miller et al. LancetOncol 2012)。このため、EGFR変異NSCLCの腫瘍増殖と維持に関与する代替シグナル経路を同定し、それを標的とする新たな治療戦略の開発が喫緊の課題であった。
Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路は、細胞の増殖、分化、幹細胞性において重要な役割を担い、多くのがん種で異常な活性化が報告されている。β-カテニン (CTNNB1) は、Wntシグナル伝達のエフェクターとして機能し、その核内蓄積と転写活性化は腫瘍形成、がん幹細胞性、および薬剤耐性に関与することが示唆されている (Reya and Clevers, Nature 2005)。特に、大腸がんではAPC遺伝子の変異によるβ-カテニンの恒常的活性化が腫瘍形成の主要なドライバーであることが確立されている (Korinek et al. Science 1997)。肺がんにおいてもWnt/β-カテニン経路の活性化が報告されており、肺腺がんの転移において重要な役割を果たすことが示されている (Nguyen et al. Cell 2009)。しかし、EGFR変異肺がんにおけるβ-カテニン活性化の具体的な分子機序、特に変異型EGFRがβ-カテニンを直接チロシンリン酸化して活性化するかどうか、またこの経路がEGFR-TKI耐性 (T790M) 腫瘍の治療標的となりうるかについては、これまで詳細な解析が不足しており、未解明な点が多かった。
これまでの研究では、β-カテニンがSrcや野生型EGFRなどのチロシンキナーゼによってチロシンリン酸化され、その安定性、核内移行、転写活性が調節されることが報告されている (Lilien and Balsamo, Curr Opin Cell Biol 2005)。また、Bcr-AblやFLT3変異型タンパク質といった他の癌原性キナーゼもβ-カテニンをチロシンリン酸化し、その安定性と転写活性を増加させることが示されている (Coluccia et al. EMBO J 2007; Kajiguchi et al. Eur J Haematol 2012)。これらの知見は、恒常的に活性化された癌原性キナーゼがβ-カテニン活性を増加させることで、がんの発生や進行に寄与する可能性を示唆する。しかし、EGFR変異、特にTKI耐性をもたらすT790M変異がβ-カテニン経路にどのように影響するか、そしてその影響が肺腫瘍の発生と維持にどの程度重要であるかについては、包括的な理解が不足しており、未解明な点が多かった。本研究は、この知識ギャップを埋めることを目指した。
目的
本研究の目的は、EGFR変異 (L858R、Exon 19欠失、L858R/T790M) がβ-カテニン活性化に与える分子機序を詳細に解明することである。具体的には、変異型EGFRがβ-カテニンを直接チロシンリン酸化し、その安定化、核内移行、および転写活性化を促進するかどうかを検証する。さらに、β-カテニン経路の薬理学的または遺伝学的阻害が、EGFR変異肺腫瘍、特にEGFR-TKI耐性を示すT790M変異腫瘍の増殖と形成に対して治療効果を示すかどうかを、in vitro細胞モデル、in vivoトランスジェニックマウスモデル、およびヒト臨床検体を用いて多角的に評価する。最終的に、β-カテニン経路がEGFR変異による肺腫瘍形成に不可欠な役割を果たすことを証明し、EGFR-TKI耐性克服のための新たな治療標的としての可能性を提示することを目指す。
結果
EGFR変異型細胞におけるβ-カテニンの過剰発現と核内局在: EGFR活性化変異を持つNSCLC細胞株 (H1650: exon 19欠失; H3255: L858R; H1975: L858R/T790M) では、野生型EGFRを持つ細胞 (A549) と比較してβ-カテニンの発現レベルが上昇していた (Figure 1A)。共焦点顕微鏡による免疫蛍光染色では、EGFR変異型細胞 (H1650, H1975) においてβ-カテニンが細胞膜だけでなく、細胞質および核内にも検出されたのに対し、野生型EGFR細胞 (A549) では主に細胞表面に局在していた (Figure 1B)。in vivoモデルでは、EGFR-L858R-T790M (EGFR TL) 誘導性肺腺がんマウスの腫瘍細胞において、約70%の細胞で細胞質性β-カテニンが、約20%の細胞で核内β-カテニンが陽性であった (Figure 1C)。Wnt/β-カテニン経路の直接的な標的遺伝子であるAxin2 (Axin-related protein 2) もほとんど全ての腫瘍細胞で検出され、EGFR変異型腫瘍細胞でβ-カテニン経路が活性化していることが示唆された。
変異型EGFRによるβ-カテニンの安定化と転写活性化: 293T細胞に野生型EGFR、EGFR-L858R、またはEGFR-L858R-T790Mを共導入した実験では、EGFR-L858R-T790Mを導入した細胞で細胞質および核内β-カテニンの発現が最も高く、次いでEGFR-L858R導入細胞で高かった (Figure 2A)。ヒト気管支上皮細胞BEAS-2BにEGFR変異体を安定発現させた細胞株を用いた解析でも、EGFR-L858R-T790M発現細胞で核内β-カテニンが最も顕著に増加していた (Figure 2C)。TCF/LEF (T-cell factor/lymphoid enhancer factor) ルシフェラーゼレポーターアッセイでは、EGFR-L858R-T790Mを導入した細胞でTCF/LEF転写活性が最も高く、EGFR-L858R導入細胞でも野生型EGFRと比較して有意に活性が増強された (p < 0.01) (Figure 2D)。さらに、EGFR TLマウスとTOPGALレポーターマウスを交配させたモデルでは、EGFR TL/CCSP-rtTA/TOPGALマウスの肺腫瘍においてβ-ガラクトシダーゼが強く陽性となり、in vivoでβ-カテニン経路が活性化していることが確認された (Figure 2E)。これらの結果は、変異型EGFR、特にEGFR-L858R-T790Mがβ-カテニンの発現と活性を増加させることを示している。
ヒトNSCLC検体におけるβ-カテニン活性化の臨床的関連性: ヒトNSCLC組織マイクロアレイ (TMA) を用いた免疫組織化学 (IHC) 解析では、EGFR変異陽性腫瘍 (n=31) の19% (6/31例) に核内β-カテニン蓄積が認められたのに対し、EGFR野生型腫瘍 (n=117) では6.0% (7/117例) に留まり、統計的に有意な差が認められた (p < 0.05, Fisherの正確検定) (Figure 3A)。さらに、EGFR-TKI治療前後の生検ペア (n=4) の解析では、TKI治療後 (T790M耐性出現後) の生検において、核内β-カテニン陽性細胞の割合が治療前の16.2%から治療後の36.3%へと増加する傾向が観察された (p < 0.05, Studentのt検定) (Figure 3B)。この結果は、EGFR-TKI耐性の獲得とβ-カテニン経路の活性化が臨床的に関連している可能性を示唆する。
変異型EGFRによるβ-カテニンのチロシンリン酸化とその活性化への寄与: 免疫沈降実験により、変異型EGFR (L858RおよびL858R-T790M) がβ-カテニンと優先的に結合し、そのチロシンリン酸化を促進することが示された (Figure 4B)。EGFR-L858Rにおけるβ-カテニンのリン酸化はエルロチニブとアファチニブの両方で阻害されたが、EGFR-L858R-T790Mにおけるリン酸化はアファチニブのみで阻害された (Figure 4C)。これは、変異型EGFRがβ-カテニンの直接的なチロシンキナーゼとして機能することを示唆する。アファチニブによるβ-カテニンのチロシンリン酸化阻害は、β-カテニンの核内蓄積を減少させた (Figure 4D)。β-カテニンのチロシンリン酸化部位として、Y86 (SrcおよびBcr-Ablによる) とY654 (野生型EGFRおよびFLT3-ITDによる) に着目し、Y86F、Y654F、Y86F/Y654Fのβ-カテニン変異体を作製した。これらの変異体は野生型β-カテニンと比較してチロシンリン酸化レベルが低下し、TCF/LEF転写活性も有意に減少した (p < 0.05) (Figure 4F)。特にY86F/Y654F二重変異体で最も顕著な効果が認められた。これらの結果は、変異型EGFRによるβ-カテニンのチロシンリン酸化が、その安定化、核内移行、および転写活性化に重要な役割を果たすことを強く示唆する。
β-カテニン阻害による腫瘍増殖抑制効果: EGFR-L858R-T790M変異を持つNCI-H1975細胞において、shRNAによるβ-カテニンノックダウンは、ソフトアガーコロニー形成能を有意に抑制した (p < 0.05) (Figure 5B)。CBP-β-カテニン相互作用阻害薬ICG-001 (0.3125 µM) は、NCI-H1975細胞のAXIN2 mRNA発現を有意に抑制し (p < 0.05)、細胞増殖も抑制したが、野生型EGFRを持つNCI-H460細胞には効果を示さなかった (Figure 5C, D)。in vivoでは、EGFR TLマウス (n=12) にドキシサイクリン誘導後、ICG-001 (150 mg/kg/日) を投与したところ、MRIによる腫瘍容積測定で有意な腫瘍増殖抑制効果が認められた (p = 0.004) (Figure 5E, F)。ビヒクル投与群 (n=8) では腫瘍が増大したのに対し、ICG-001投与群では腫瘍形成が著明に抑制された。
Ctnnb1遺伝子欠損による肺腫瘍形成の劇的抑制: 肺上皮細胞特異的にCtnnb1遺伝子を条件付きで欠損させたEGFR TL/CCSP-rtTA/teto-Cre/Ctnnb1F/Fマウス (n=17) では、EGFR-L858R-T790M誘導後の肺腫瘍形成が劇的に抑制された (Figure 6B)。Ctnnb1F/Fマウスの肺重量は、ヘテロ接合性Ctnnb1F/+マウス (n=12) と比較して有意に軽く (約3分の1以下)、正常マウス肺に近い値であった (p < 0.01) (Figure 6C)。組織学的解析でも、Ctnnb1F/Fマウスでは腫瘍形成がほとんど見られず、生存期間も有意に延長した (p < 0.001) (Figure 6D, E)。ドキシサイクリン投与25週以上で組織学的に検出可能な小腫瘍クラスターが77% (17/22) のCtnnb1F/Fマウスで観察されたが、これらの腫瘍の多く (67%, 8/12) ではβ-カテニンの欠損が不完全であった。これらの遺伝学的証拠は、β-カテニンがEGFR変異、特にTKI耐性T790M変異による肺腫瘍の形成と維持に不可欠であることを強力に支持する。
考察/結論
本研究は、EGFR活性化変異 (L858R、exon 19欠失、L858R/T790M) がWnt/β-カテニンシグナル伝達経路の主要なエフェクターであるβ-カテニンを直接的にチロシンリン酸化し、その安定化、核内移行、および転写活性化を促進するという新規のクロストーク機構を初めて明らかにした。特に、EGFR-TKI耐性変異であるT790Mの存在がβ-カテニン経路の活性化をさらに増強することが示された。
先行研究との違い: これまでの研究では、Wnt/β-カテニン経路が肺がんの転移に関与することが報告されていたが (Nguyen et al. Cell 2009)、変異型EGFRがβ-カテニンを直接チロシンリン酸化し、その活性化を駆動するという具体的な分子機序は未解明であった。本研究は、EGFR変異とWnt/β-カテニン経路間の直接的なクロストークを分子レベルで解明した点で、これまでの知見と異なる。また、T790M変異がβ-カテニン活性化を増強するという所見は、TKI耐性機序におけるβ-カテニンの新たな役割を示唆する。
新規性: 本研究で初めて、変異型EGFRがβ-カテニンのY86およびY654残基を直接チロシンリン酸化し、これによりβ-カテニンの核内移行と転写活性が亢進することを新規に同定した。このEGFR-β-カテニン軸は、EGFR変異依存性肺腫瘍の形成と維持に不可欠であることが、遺伝学的および薬理学的手法によって強力に示された。特に、第一世代EGFR-TKIに耐性を示すT790M変異腫瘍においてもβ-カテニン経路が活性化し、その阻害が腫瘍増殖を抑制するという発見は、TKI耐性克服に向けた新たな治療標的の可能性を提示する点で極めて新規性が高い。
臨床応用: 本研究の知見は、EGFR変異陽性NSCLC、特にEGFR-TKI耐性T790M変異腫瘍に対する新たな治療戦略の開発に重要な臨床的意義を持つ。β-カテニン阻害薬 (例: ICG-001) は、TKI耐性後の治療選択肢が限られている患者に対して有効な治療法となる可能性がある。ヒト臨床検体においてEGFR変異陽性腫瘍で核内β-カテニン蓄積が有意に高く、TKI耐性獲得後にその蓄積が増加する傾向が認められたことは、本機序が前臨床モデルに留まらず、実際の患者腫瘍でも作動している可能性を示唆する。これにより、β-カテニン核内蓄積をバイオマーカーとして、β-カテニン阻害薬の治療効果が期待できる患者を選択できる可能性も考えられる。
残された課題: 今後の検討課題として、EGFR-TKI (第一世代および第三世代) とβ-カテニン阻害薬の併用療法の有効性を評価する必要がある。また、β-カテニン経路の活性化がEGFR-TKI耐性を直接的に引き起こすメカニズム、あるいは耐性獲得後の腫瘍維持にどのように寄与するのか、その詳細な分子メカニズムの解明が残されている。具体的には、β-カテニンによって転写活性化される標的遺伝子の特定や、他の癌原性キナーゼ (例: EML4-ALK転座) 駆動型肺腫瘍におけるβ-カテニン活性化の有無についても検討が必要である。ICG-001のin vivoでの完全な腫瘍根絶には至らなかったことから、より強力なβ-カテニン阻害剤の開発や、最適な投与量・投与スケジュールの検討も今後の研究方向性となる。
方法
細胞株と培養: EGFR変異型NSCLC細胞株 (H1650: exon 19欠失; H3255: L858R; H1975: L858R/T790M) および野生型EGFR細胞株 (A549: KRAS変異; HCC4006: exon 19欠失) を用いた。また、ヒト気管支上皮細胞株BEAS-2Bに野生型または変異型EGFRを安定的に発現させた細胞株も作製した。293T細胞およびCOS7細胞も使用した。細胞株は定期的に遺伝子型を確認した。
分子生物学的解析: ウェスタンブロット法により、β-カテニン、リン酸化β-カテニン (pY86, pY654)、EGFR、リン酸化EGFR、GSK3β、リン酸化GSK3β (Ser9) などのタンパク質発現レベルを評価した。免疫沈降および共免疫沈降法を用いて、EGFRとβ-カテニンの物理的結合およびβ-カテニンのチロシンリン酸化を検証した。β-カテニンのチロシンリン酸化部位を特定するため、Y86F、Y654F、Y333F、およびY86F/Y654Fのβ-カテニン点変異体を構築し、その影響を評価した。細胞質および核タンパク質を分画し、β-カテニンの細胞内局在を解析した。TCF/LEF (T-cell factor/lymphoid enhancer factor) ルシフェラーゼレポーターアッセイ (pTOPFLASH/pFOPFLASH) を用いて、β-カテニンを介した転写活性を定量的に測定した。リアルタイムPCRにより、Wnt/β-カテニン経路の標的遺伝子であるAXIN2 (Axin-related protein 2) のmRNA発現レベルを測定した。
薬理学的阻害実験: CBP-β-カテニン転写複合体特異的阻害薬であるICG-001 (10 µM) を用いて、EGFR変異型細胞株 (H1975、H1650) および野生型EGFR細胞株 (NCI-H460) における細胞増殖抑制効果をCellTiter-Gloアッセイで評価した。また、EGFR-TKIであるエルロチニブ (1 µM) およびアファチニブ (1 µM) を用いて、β-カテニンのリン酸化および核内移行への影響を評価した。Src阻害剤SU6656 (1 µM) の影響も検討した。
in vivoトランスジェニックマウスモデル:
- EGFR-L858R-T790M誘導性肺腺がんマウス: CCSP-rtTA; tetO-EGFRL858R-T790M (EGFR TL) 二重トランスジェニックマウスを作製し、ドキシサイクリン投与により肺腺がんを誘導した。
- β-カテニン条件付き欠損マウス: Ctnnb1flox/floxマウスとEGFR TLマウス、およびteto-Creマウスを交配させ、肺上皮細胞特異的にβ-カテニン遺伝子 (Ctnnb1) を欠損させたEGFR TL/CCSP-rtTA/teto-Cre/Ctnnb1F/Fマウスを作製した。
- 薬理学的in vivo実験: EGFR TLマウスにドキシサイクリン誘導後、ICG-001 (150 mg/kg/日、腹腔内投与) またはビヒクルを投与し、MRIにより腫瘍容積の変化を評価した。
- 腫瘍形成および生存期間解析: β-カテニン欠損マウスおよび対照マウスの肺重量を測定し、H&E染色および免疫組織化学 (IHC) 染色により腫瘍形成を組織学的に評価した。カプラン・マイヤー法を用いて生存期間を比較した。
ヒト臨床検体解析:
- 組織マイクロアレイ (TMA) 解析: 148例のNSCLC患者組織から作製されたTMAを用いて、EGFR変異陽性 (n=31) および陰性 (n=117) 腫瘍におけるβ-カテニンの発現と細胞内局在 (細胞質/核) をIHC染色で評価した。
- TKI治療前後生検ペア解析: EGFR-TKI治療前後の生検ペア (n=4) を用いて、TKI耐性獲得後のβ-カテニン局在変化をIHC染色で評価した。
免疫蛍光染色: 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、β-カテニンの細胞内局在を視覚的に評価した。
統計解析: 各実験群間の差は、Fisherの正確検定、Studentのt検定、またはWilcoxon符号順位検定を用いて評価した。P値が0.05未満の場合を統計的に有意と判断した。生存期間の推定にはカプラン・マイヤー法とログランク検定を用いた。統計解析にはSTATAバージョン12.1を使用した。