- 著者: Hua Zhang, Camilla L. Christensen, Ruben Dries, Matthew G. Oser, Jiehui Deng, Brian Diskin, et al.
- Corresponding author: Hua Zhang (NYU Langone Medical Center); Nathanael S. Gray (Dana-Farber Cancer Institute); Kwok-Kin Wong (NYU Langone Medical Center)
- 雑誌: Cancer Cell
- 発行年: 2020
- Epub日: 2020-01-16
- Article種別: Original Article (preclinical mouse model + cell line study)
- PMID: 31883968
背景
Small cell lung cancer (SCLC) は全肺癌の約 15% を占め、tumor mutational burden が高いにもかかわらず immune checkpoint inhibitor (ICI) 単剤での奏効率は約 10-18% にとどまる (Nature et al. Basic 2015 が示した RB1/TP53 同時欠失と high mutational burden の paradoxical 構図)。Earlier work では atezolizumab + carboplatin + etoposide の IMpower133 試験で initial chemoimmunotherapy が承認されたが、overall survival 延長は化学療法単独比 2.0 か月 (12.3 vs 10.3 か月、HR 0.70) と限定的であった (Horn et al. NEnglJMed 2018)。これまでの研究で何が足りなかったかと言えば、SCLC 内在の immunosuppressive な tumor microenvironment (TME) を打破する pharmacologic な「免疫化 (immune sensitizer)」戦略が確立されていなかった点 (未解明 gap) である。Cyclin-dependent kinase 7 (CDK7) は CDK-activating kinase (CAK) 複合体の中核として細胞周期 (CDK1/2 T-loop リン酸化) と転写 (RNA polymerase II C-terminal domain リン酸化) を二重制御する key kinase で、これまでに covalent CDK7/12/13 dual inhibitor THZ1 が SCLC で super-enhancer-driven transcription を遮断し apoptosis を誘導することが報告されていた (Christensen et al. 2014、Kwiatkowski et al. 2014)。しかし CDK7 単独の選択的阻害が genome stability および anti-tumor immunity に与える影響は未解明であった。
目的
新規選択的 CDK7 covalent inhibitor YKL-5-124 (Olson et al. 2019 で報告) を用いて、(a) SCLC 細胞での CDK7 選択性と細胞周期 / DNA 複製への影響 (CDK1/2 T-loop phosphorylation vs RNA polymerase II C-terminal domain の同時測定)、(b) genome instability (γH2AX foci、micronuclei) 誘導機序、(c) 腫瘍細胞 intrinsic な innate immune response (interferon-γ signaling、CXCL9/10/11、TNFα) の活性化、(d) 複数 syngeneic immune-competent SCLC mouse model における anti-PD-1 および platinum-etoposide chemotherapy との併用効果を、化学療法 + anti-PD-1 (IMpower133 backbone) を control arm として体系的に評価することを目的とした。
結果
YKL-5-124 は CDK7 を選択的に阻害し RNA polymerase II 転写は維持する：YKL-5-124 は biotin-pull-down で cyclin H (CDK7 partner) を選択的に捕捉する一方 cyclin K (CDK9 partner) は捕捉せず (Fig 1A、Fig S1A)、SCLC 細胞 panel で 50 nM 濃度から CDK1/CDK2 T-loop phosphorylation を robust に抑制した (Fig 1B、Fig S1B)。一方 RNA polymerase II C-terminal domain (CTD) phosphorylation (Ser2、Ser5) には影響せず、super-enhancer 関連遺伝子 INSM1・ASCL1・NFIB・MYC の発現も変化なし (Fig S1D)、これは THZ1 が同遺伝子を有意に下方制御するのと対照的であった。Cell cycle 解析では G1 蓄積 (control 41% → YKL-5-124 処理 63%) と S 期細胞減少 (29% → 13%) が確認され、CDK7 inhibition による G1-S checkpoint 蓄積が示された (Fig 1C-D)。
DNA 複製開始阻害から γH2AX foci 増加と micronuclei 形成まで：YKL-5-124 (100 nM) 48 h 処理で BrdU+ 細胞比率が control 28% → 8% に減少 (約3.5-fold 減少、Fig 2A-B)、EdU+ chromatin-bound MCM2 levels も STORM 顕微鏡解析で有意に低下し (Fig 2C-H)、DNA replication initiation complex の機能不全が証明された。γH2AX foci は 48 h 処理で control vs 処理群で p<0.001 で有意に増加し (Fig 2I-J)、DNA damage response 活性化を示唆。Micronuclei 形成は DAPI 染色 immunofluorescence で control 5% → YKL-5-124 19% へ約3.8-fold 増加 (Fig 2K-L)、genome instability 表現型を裏付けた。
Interferon-γ signaling と CXCL9/10 産生の活性化 — cGAS-STING 非依存：RPP631 細胞の RNA-seq + Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) で YKL-5-124 処理後の top 5 positively regulated hallmark signature のうち 3 つが “Interferon-γ response” (normalized enrichment score; NES 2.39、Fig 3A)、“TNFα signaling via NFKB” (NES 2.24、Fig 3B)、“Inflammatory response” (NES 2.34、Fig 3C) であった。qRT-PCR で Tnf・Cxcl10・Cxcl9 の発現が 48 h で有意に upregulate (各 p<0.0001、Fig 3G-I)。Isogenic HAP1 system では CDK7 wild-type 細胞で TNFα/CXCL10 増加するが CDK7-Cys312Ser mutant では認めず (Fig S2G)、薬理学的 on-target effect が確認された。cGAS knockdown でも YKL-5-124 誘導 cytokine 産生は維持され、cGAS-STING 非依存の機序であることが新規 (novel) に示された (Fig S2H-I) — これは染色体不安定性が cytosolic DNA を介して cGAS-STING 経路を活性化するという従来の枠組 (Nature et al. Basic 2018) とは異なる新規 pathway 仮説を提示する。OT-I T cell co-culture では YKL-5-124 処理 RPP631 上清が CD8+ T cell の CD69・TNFα・IFNγ 発現を約2倍上昇させ、tumor-intrinsic な immunogenicity 変化が T cell activation を駆動することが確認された (p<0.01)。
Anti-PD-1 との併用で 3 つの syngeneic model で中央 OS を 4 倍延長：RPP orthotopic model (MRI で腫瘍負荷確認後 randomize、n=9-25/arm) で control 群は 3 週で腫瘍体積 doubling、anti-PD-1 単剤は modest 抑制で added median OS benefit 10 days (p<0.05)、YKL-5-124 単剤は added median OS benefit 約 30 days (p<0.001)、YKL-5-124 + anti-PD-1 combination は added median OS benefit 45 days と最も長く、control vs combination で 2-fold 超の生存延長 (Fig 4F、log-rank p<0.0001)。RP model (combination added median OS benefit 43 days、Fig 4G、p<0.001) と RPP-MYC model でも再現された (Fig S6A-D)。RPP GEMM (n=9) でも combination 群 7 例で tumor burden 顕著減少 (Fig S6F-H、n=7/9 responder)。
4 剤併用 (Chemo + Combo) で 17 匹中 12 匹が 90 日超生存：cisplatin + etoposide + anti-PD-1 (Chemo + anti-PD-1) と YKL-5-124 + cisplatin + etoposide + anti-PD-1 (Chemo + Combo、4 剤) を直接比較すると、Chemo + Combo 群は body weight 毒性なく全例 stable disease 達成、17 匹中約半数で 3 週時点 >20% 腫瘍縮小、最も重要な点として 17 匹中 12 匹 (71%) が 90 日超生存した (Fig 4F)。一方 Chemo + anti-PD-1 群 vs Combo 群では Combo 群が有意に長生 (Fig 4F、p<0.001)、CDK7 inhibition が化学療法・ICI 双方の effect を上乗せ的に増強することが示された。
Combo 群で CD4+ Ki67+/ICOS+ 効果 T cell・GzmB+ CD8+ CTL・CD11c+CD103+ DC が同時 enrich：treatment day 7 の tumor-infiltrating lymphocyte 解析 (RPP orthotopic、n=5/arm) で CD4+ T cell 比率は YKL-5-124 単剤で穏やかに上昇、Combo で最大 (Fig 5A)、CD44highCD62Llow effector CD4+ も Combo で peak (Fig 5C-D)。Ki67+ CD4+ proliferating fraction と ICOS+ CD4+ activated fraction は Combo で最高 (Fig 5E-F)。GzmB+ CD8+ cytotoxic T lymphocyte (CTL) は YKL-5-124 単剤・anti-PD-1 単剤で同程度に増加、Combo で最大 percentage 到達 (Fig 5G)。Tumor-resident MHCII+CD11c+CD103+ dendritic cell (DC) も YKL-5-124 と Combo で有意に増加 (anti-PD-1 単剤では less effect、Fig 5H)。Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) Luminex で TNFα、CXCL9、CXCL10 が YKL-5-124・Combo 群で in vivo に著明上昇 (Fig 5I-K)、in vitro データを完全再現。Single-cell RNA-seq (n=31,180 cells、4 treatment arms) で in vivo にも tumor cell G1 蓄積・S 期減少・IFNγ response 上昇が confirmed され、Combo 群で IFNγ-producing CD4+/CD8+ T cell ratio が最大であった (Fig 6・7)。
考察/結論
先行研究との違いと新規性：本研究はこれまでの dual CDK7/12/13 inhibitor THZ1 が super-enhancer-driven transcription block で apoptosis を誘導する機序とは異なる軸の新規 (novel) な発見を提示する — 選択的 CDK7 阻害は RNA polymerase II 転写と SCLC lineage transcription factor (INSM1、ASCL1、NFIB、MYC) を温存しながら、CDK1/2 T-loop dephosphorylation → DNA replication origin firing 障害 → MCM2 complex 機能不全 → γH2AX/micronuclei → cGAS-STING 非依存の IFNγ/TNFα/CXCL9・10 cytokine cascade → T cell-mediated anti-tumor immunity という linear な分子経路を初めて系統的に証明した。これは PARP inhibition で報告された cGAS-STING 依存性 immune sensitization とは独立の mechanism であり、新規な mechanism class を構成する。さらに earlier work の Christensen 2014 / Kwiatkowski 2014 が SCLC 細胞増殖抑制のみ示していたのと相違し、本研究は 3 種の syngeneic mouse model + GEMM で in vivo 有効性と immune profile remodeling を同時に証明した点も方法論的に novel である。
臨床応用 — SCLC ICI 抵抗性を破る backbone candidate：本研究の臨床応用 (bench-to-bedside) 含意は、(i) SCLC 患者対象の selective CDK7 inhibitor (現在 SY-5609、ICEC0942、CT7001 等が phase I/II 開発中) の臨床試験で anti-PD-1/PD-L1 との combination が試験設計の優先選択肢となる、(ii) chemotherapy + anti-PD-L1 (IMpower133・CASPIAN レジメン) の backbone に CDK7 inhibitor を加える 4 剤 platform が長期生存を狙える可能性 (71% で 90 日超生存)、(iii) γH2AX foci / micronuclei / serum CXCL10 levels が pharmacodynamic biomarker として早期患者選別・効果モニタリングに利用可能、(iv) CDK7 inhibition が SCLC で chemotherapy resistance を decouple する可能性 (chemo + Combo が chemo + anti-PD-1 を上回る)、の 4 点である。臨床的意義として MYC-driven aggressive SCLC subtype (約 20%) で特に有望と考えられる。
残された課題と limitation：(1) ヒト SCLC 患者検体での CDK7 inhibitor in vivo target engagement biomarker (γH2AX、CXCL10) の validation、(2) MYC amplification・neuroendocrine 分化度 (ASCL1/NEUROD1/POU2F3/YAP1 subtype 別) ごとの response variability、(3) RPP mouse model は high replication stress baseline を持つため臨床 SCLC への extrapolation の妥当性、(4) anti-PD-L1 (atezolizumab、durvalumab) との併用が anti-PD-1 と同等か未検証、(5) overlapping toxicity (chemotherapy-induced bone marrow suppression と CDK7 阻害による G1 arrest の additive cytopenia)、(6) brain metastasis (SCLC で頻発) への CDK7 inhibitor penetration、(7) acquired resistance mechanism (CDK7 gatekeeper mutation C312S 等) の臨床的頻度、が今後の研究課題として残された。これらの limitation が解決されれば SCLC 免疫療法 paradigm を一変させる候補機序となり得る。
方法
Cell lines：human SCLC cell lines DMS79・H82・H446・H524 ほか、murine syngeneic SCLC cell line RPP631 (Rb1 knockout; Trp53 knockout; p130 knockout triple genotype)、isogenic HAP1 cell system で CDK7 wild-type と CDK7-Cys312Ser gatekeeper mutant を対比 (YKL-5-124 共有結合が消失する mutation)。Compounds：selective CDK7 covalent inhibitor YKL-5-124 (100 nM in vitro / 5 mg/kg intraperitoneal once daily in vivo)、対照 dual CDK7/12/13 inhibitor THZ1、CDK12/13 inhibitor THZ531、anti-PD-1 antibody (clone RMP1-14、10 mg/kg every three days intraperitoneal)、cisplatin 7 mg/kg + etoposide 10 mg/kg (IMpower133 backbone mimicking)。Endpoints：cyclin H pull-down with biotin-tagged YKL-5-124、propidium iodide flow cytometry for cell cycle、5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) / 7-aminoactinomycin D (7-AAD) co-staining、ethynyldeoxyuridine (EdU) / minichromosome maintenance complex 2 (MCM2) stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) imaging、phosphorylated histone H2AX (γH2AX) foci immunofluorescence、4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) micronuclei counting、bulk RNA sequencing with gene set enrichment analysis (GSEA)、quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) for Tnf / Cxcl10 / Cxcl9、cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase (cGAS) knockdown rescue assay。In vivo models：3 種の immune-competent syngeneic orthotopic models — RPP (Rb1 knockout Trp53 knockout p130 knockout)、RP (Rb1 knockout Trp53 knockout)、RPP-MYC、ならびに genetically engineered mouse model (GEMM) として autochthonous RPP。Treatment arms (各群 n=9-25)：vehicle、anti-PD-1 単剤、YKL-5-124 単剤、YKL-5-124 + anti-PD-1 combination、cisplatin + etoposide + anti-PD-1、cisplatin + etoposide + YKL-5-124 + anti-PD-1 (4 剤併用)。Magnetic resonance imaging (MRI) による腫瘍体積追跡、Kaplan-Meier 生存解析と log-rank test、flow cytometry-based immune profiling (cluster of differentiation 4 positive [CD4+] / CD8+ T cell、granzyme B [GzmB] positive cytotoxic T lymphocyte、proliferation marker Ki67、inducible costimulator [ICOS]、major histocompatibility complex class II [MHCII] positive CD11c+CD103+ dendritic cell)、bronchoalveolar lavage fluid (BALF) cytokine Luminex multiplex measurement、single-cell RNA sequencing (n=31,180 tumor-infiltrating cells、10x Genomics platform、Seurat version 3 integration、CellChat ligand-receptor analysis)。Statistical methods：unpaired two-tailed Student t-test (cell・群間比較)、one-way analysis of variance (multi-group)、log-rank test (Kaplan-Meier)、p value <0.05 を有意とする two-sided test。