- 著者: Susana García-Silva, Alberto Benito-Martín, Laura Nogués, Alberto Hernández-Barranco, Marina S. Mazariegos, Vanesa Santos, Marta Hergueta-Redondo, Pilar Ximénez-Embún, Raghu P. Kataru, Ana Amor Lopez, Cristina Merino, Sara Sánchez-Redondo, Osvaldo Graña-Castro, Irina Matei, José Ángel Nicolás-Avila, Raúl Torres-Ruiz, Sandra Rodríguez-Perales, Lola Martínez, Manuel Pérez-Martínez, Gadea Mata, Anna Szumera-Ciećkiewicz, Iwona Kalinowska, Annalisa Saltari, Julia M. Martínez-Gómez, Sabrina A. Hogan, H. Uri Saragovi, Sagrario Ortega, Carmen Garcia-Martin, Jasminka Boskovic, Mitchell P. Levesque, Piotr Rutkowski, Andrés Hidalgo, Javier Muñoz, Diego Megías, Babak J. Mehrara, David Lyden, Héctor Peinado
- Corresponding author: Babak J. Mehrara (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, NY, USA); David Lyden (Weill Cornell Medical College, NY, USA); Héctor Peinado (CNIO, Madrid, Spain)
- 雑誌: Nature Cancer
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-11-25
- Article種別: Original Article
- PMID: 34957415
背景
メラノーマはリンパ節 (LN) へ優先的に転移し、センチネルLN (sLN) における転移前ニッチ (PMN) 形成がリンパ管新生亢進や免疫抑制環境の構築として先行することが確立されている。血管内皮増殖因子 (VEGF)-C/Aなどの液性因子が原発巣からリンパ管新生を誘導し、LN転移と遠隔転移を促進することが報告されている。腫瘍由来細胞外小胞 (EV) もまた、メラノーマの転移促進に関与することが先行研究で示されていた Becker et al. CancerCell 2016。特に腫瘍エクソソーム (小型細胞外小胞: sEV) は、肝臓や肺へのPMN形成の主要なメディエーターとして多く研究されてきたが Hoshino et al. Nature 2015、LNのPMN形成に関わるsEV依存的分子機序は不明であった。
神経成長因子受容体 (NGFR; p75NTR/CD271) は、TNF受容体スーパーファミリーの一員であり、メラノーマの発生、浸潤、転移、免疫療法耐性において内在的な役割を持つことが報告されていた。しかし、sEVに搭載されたNGFRが受容細胞であるリンパ管内皮細胞 (LEC) に与えるパラクリン的影響はこれまで未検討であった。メラノーマ由来sEVはリンパ系を通じて分布し、腫瘍細胞のホーミングを促進し、sLNの被膜下洞CD169+マクロファージに結合して免疫応答を誘発することが示されているが Hood et al. CancerRes 2011、LNのPMN形成におけるsEVの役割と関連するメカニズムは未解明であった。本研究は、この知識のギャップを埋め、sEV-NGFR軸がLNのPMN形成で果たす役割を包括的に解明することを目的とした。特に、メラノーマ由来sEVがリンパ系を介してLNに到達し、LECに取り込まれるメカニズム、およびNGFRがLECの機能に与える影響については、これまで報告されていない点が不足していた。
目的
本研究は、転移性メラノーマ由来小型細胞外小胞 (sEV) のリンパ節 (LN) 転移前ニッチ (PMN) 形成における役割を解析することを目的とした。具体的には、以下の点を検証する。
- 転移性メラノーマ由来sEVがリンパ系を通じてリンパ管内皮細胞 (LEC) に到達し、リンパ管新生を誘導するメカニズムを解明すること。
- sEVに搭載された神経成長因子受容体 (NGFR) が、LECにおけるERKおよびNFκB経路の活性化、細胞間接着分子-1 (ICAM-1) 発現、および血管内皮増殖因子受容体3 (VEGFR3) リン酸化を通じてPMN形成を促進する分子機序を明らかにすること。
- sEV中のNGFR除去または薬理学的阻害が、リンパ管新生表現型を逆転させ、LN転移を減少させ、前臨床モデルにおける生存期間を延長する治療的意義を評価すること。
- ヒトメラノーマ患者におけるLN転移巣でのNGFR発現の臨床的意義、特に原発腫瘍との比較および患者の全生存期間との相関を検証すること。
これらの目的を達成することで、メラノーマのLN転移におけるsEV-NGFR軸の重要性を明らかにし、新たな治療標的の可能性を探る。
結果
転移性sEVのリンパ管特異的分布と長期保持: NIR815標識sEVの足底内注射による追跡実験の結果、高転移性メラノーマ細胞株であるB16-F10およびB16-F1R2由来のsEVは、低転移性B16-F1および正常メラノサイトmelan-a由来sEVと比較して、より広範なLN分布と長期的なLN内保持を示した (Fig 1a-c)。特に、足底内注射後24時間以内にB16-F10由来sEVが膝窩LNのLYVE-1+皮質領域に有意に集積することが観察された (p=0.0249)。3週間の追跡期間においても、B16-F10/F1R2由来sEVはB16-F1由来sEVよりも有意に多くLNに蓄積した (Fig 1b,c)。sEVのサイズやモード径にはB16-F1/F10/F1R2間で有意な差は認められなかったが、B16-F10由来sEVは細胞数あたりのタンパク質量が高く、Z電位が低いという特徴を示した。表面質量分析により、B16-F10/F1R2由来sEVでは185種類のタンパク質がB16-F1由来sEVと比較して高発現しており、細胞接着関連プロセスが濃縮されていることが示された。インテグリンプロファイルには大きな差はなかった。
sEVの主要な取り込み細胞集団はLECとマクロファージ: フローサイトメトリー解析により、膝窩LNにおいてリンパ管内皮細胞 (LEC) が最も早く、かつ最も多くsEVを取り込む主要な細胞集団であることが明らかになった (Fig 2d,e)。sEV注射後4時間時点で、約95%のLECがsEV陽性であり、次いでDPマクロファージ (CD169+F4/80+) が約60%、F4/80+マクロファージが約30%、被膜下マクロファージが約20%の割合でsEVを取り込んでいた (n=3 LNs analyzed)。T細胞やB細胞へのsEV取り込みは検出されなかった。これらのデータは、LECがLNにおいて腫瘍由来sEVに最初に遭遇する細胞タイプであり、マクロファージもsEVを取り込むが、その速度と程度はLECに劣ることを示唆している。
sEVによるリンパ管新生誘導と腫瘍細胞接着促進: ヒトLEC (hLEC) をSK-MEL-147由来sEVで処理すると、LYVE1, VEGFC, ENG, KDR, PDGFRB, VEGFAなどのリンパ管新生・血管新生関連遺伝子が広範に上方制御され、VEGFR3のリン酸化が活性化された (Fig 4a-c)。in vitroスプラウティングアッセイでは、sEV処理hLECの管腔数と長さが16時間で有意に増加した (Fig 4d)。in vivo Matrigelプラグアッセイでは、sEVを埋め込んだプラグは対照と比較してLYVE-1+細胞数が有意に増加した (p=0.0480, n=5 plugs for control, n=4 plugs for sEVs) (Fig 4e,f)。Vegfr3-EGFP-Lucリンパレポーターマウスでは、sEV投与LNのVegfr3発現が有意に上昇し、LYVE-1+領域も有意に増加した (Fig 4h-k)。LECの増殖はsEV投与後24時間で3.5-fold、7日後で2.5-foldに増加した (Fig 4l,m)。マクロファージはリンパ管新生遺伝子発現に影響を与えず、LECが主要なエフェクターであることが確認された。さらに、SK-MEL-147由来sEV処理によりhLECへの腫瘍細胞接着が促進され、これはICAM-1の発現上昇と相関した (Fig 3d,e)。ICAM-1 mRNAおよびタンパク質発現はsEV処理により上昇し、ICAM-1-FcによるブロッキングによりsEV誘導腫瘍細胞接着が完全に抑制された (Fig 3k,l)。
sEV搭載NGFRの機能的同定と水平転送: RNAシーケンスとプロテオーム統合解析により、hLECで正の相関を示す遺伝子-タンパク質ペアの中で、神経成長因子受容体 (NGFR) が最上位候補として同定された (Fig 3b)。ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリー解析の結果、高転移性メラノーマ細胞株 (SK-MEL-147, SK-MEL-103, B16-F10, B16-F1R2) 由来sEVのみがNGFRを高発現しており、低転移性細胞やメラノサイト由来sEVではほとんど検出されなかった (Fig 5a,b)。sEV内のNGFRはhLECに水平転送され (フローサイトメトリーで4時間後に4-fold増加, n=3 samples per group)、かつde novoのNGFR mRNA誘導も認められた (Fig 5c,d)。B16-F1-NGFR-GFP sEVのin vivo注射後、LYVE-1+領域でのGFP+面積が4-fold増加し (n=6 LNs per group)、in vivoでのNGFR水平転送が実証された (Fig 5f-h)。
NGFRを介したERK/NFκB/ICAM-1シグナル軸の活性化: SK-MEL-147由来sEVはhLECにおいてNFκB p65の核移行を誘導し (30分および24時間)、これはshNGFR sEVまたはNGFR阻害薬THX-Bにより有意に減弱した (p<0.001) (Fig 6a-g)。ERK1/2のリン酸化もsEV処理により誘導され、shNGFR sEVでは減弱した (Fig 6h-k)。ICAM-1 mRNAおよびタンパク質発現はsEV処理により上昇し、shNGFR sEV、MEK阻害薬、またはNFκB阻害薬により抑制された (Fig 7a-c)。in vivoでのsEV投与によりLNでのICAM-1発現が上昇し (p=0.0034)、LYVE-1+領域でのICAM-1増加がLEC上での腫瘍細胞接着増強と相関した (Fig 3g-j)。ICAM-1-Fcによる機能阻害は、sEV誘導腫瘍細胞接着を完全に抑制した (Fig 3k,l)。これらの結果は、メラノーマ由来sEVがNGFRを介してLECのNFκBおよびMAPK経路を活性化し、ICAM-1発現を誘導することで、腫瘍細胞接着を促進することを示している。
NGFR除去・阻害による転移抑制と生存延長: Ngfr-KO sEVで教育したマウスは、野生型 (WT) sEVで教育したマウスと比較して、LN転移が有意に減少し、生存期間が延長した (ログランク検定 p<0.05, n=12 mice for control sEVs, n=10 mice for Ngfr-KO sEVs) (Fig 8c-f)。Matrigelプラグアッセイでは、shNGFR sEVはshC sEVと比較してLYVE-1+細胞数を有意に抑制した (Fig 7f,g)。NGFR阻害薬THX-B処置 (2.5 mg/kg 腹腔内投与、週2回) により、B16-F1R2担癌マウスのLN転移個数およびLN転移率が有意に減少した (Fig 8g-i)。in vitroチューブ形成アッセイでは、NGFR、MEK、NFκBの各阻害がsEV誘導リンパ管新生を阻害した (Fig 7d,e)。sEVはリガンド (pro-NGF, BDNF) 非存在下でも同等の効果を示し、NGFR活性化がリガンド非依存的メカニズムであることを確認した。
ヒト患者コホートにおける臨床的相関: コホート1 (n=44 patients) の解析では、NGFRのIHCスコアはLN転移巣で原発皮膚病変よりも有意に高値であった (Wilcoxon検定 p=0.0008) (Fig 8j)。コホート2 (n=25 patientsのペア解析) では、NGFR+MITF+腫瘍細胞の頻度がLN転移巣で原発巣よりも有意に増加した (paired Wilcoxon検定 p<0.0001) (Fig 8k)。さらに、LN生検におけるNGFR+MITF+細胞数が75個を超える患者群は、75個未満の群と比較して全生存期間が有意に短縮した (ログランク検定 p<0.05, n=13 patients for <75 cells, n=12 patients for >75 cells) (Fig 8l)。The Cancer Genome Atlas (TCGA) のデータ解析でも、NGFR mRNAは転移巣で原発巣よりも有意に高発現していることが示された。これらの結果は、NGFRがヒトメラノーマのLN転移において重要な役割を果たし、患者の予後と相関することを示唆している。
考察/結論
本研究は、転移性メラノーマ由来小型細胞外小胞 (sEV) が神経成長因子受容体 (NGFR) を介してリンパ管内皮細胞 (LEC) に作用し、リンパ管新生とリンパ節 (LN) 転移前ニッチ (PMN) 形成を促進する新規メカニズムを明らかにした。
先行研究との違い: これまでの研究では、メラノーマ由来EVがLN免疫細胞、特に被膜下マクロファージやB細胞に取り込まれることが示されていたが Ballesteros et al. Cell 2020、それは転移カスケードの後期段階であった。本研究のデータは、LECがLNにおいて腫瘍由来sEVに最初に遭遇する細胞タイプであり、マクロファージもsEVを取り込むものの、その速度と程度はLECに劣ることを示している。このことは、LNにおける腫瘍由来sEVの取り込みに複数の段階を含む階層が存在する可能性を示唆しており、これまでの報告とは異なる知見である。また、インテグリンがsEVの臓器指向性ホーミングに関与することが示されていたが Hoshino et al. Nature 2015、本研究では高転移性メラノーマ由来sEVにおいてインテグリンプロファイルに大きな差がないことを示し、sEVの生体物理学的特性と表面タンパク質の組み合わせがsEVの拡散、ホーミング、LECによる取り込みに影響を与えるという、より包括的な仮説を支持する。
新規性: 本研究で初めて、NGFRが高転移性メラノーマ由来sEVに豊富に搭載され、LECに水平転送されるだけでなく、LECにおいてde novoのNGFR mRNA発現を強力に誘導することを新規に同定した。さらに、sEV中のNGFRがリガンド非依存的にLECのERKおよびNFκB経路を活性化し、ICAM-1発現とVEGFR3リン酸化を誘導することで、リンパ管新生と腫瘍細胞接着を促進するというメカニズムを明らかにした。このNGFRを介したシグナル伝達は、これまでの神経系モデルにおけるNGFRの分泌に関する報告とは異なり、腫瘍転移の文脈で初めて記述された。
臨床応用: 本研究の知見は、メラノーマのLN転移におけるNGFRの臨床的意義を強く示唆する。ヒトLN転移巣におけるNGFR高発現は原発腫瘍と比較して有意に高く、NGFR陽性転移性メラノーマ細胞の頻度が患者の全生存期間短縮と相関することは、NGFRが早期メラノーマ転移の重要なバイオマーカーとなり得ることを示している。NGFR阻害剤THX-Bによる治療が前臨床モデルでLN転移を減少させ、生存を延長したことは、NGFRを標的とした治療戦略が臨床応用につながる可能性を示唆する。液性生検におけるsEV NGFRレベルの測定が患者の予後予測に有用であるかどうかの検証は、臨床現場での応用にとって重要なステップとなるだろう。
残された課題: 今後の検討課題として、NGFRを発現するsEVの不均一な集団における機能的差異や、NGFR以外のsEVカーゴがLN転移に与える影響について、さらなる解析が必要である。また、NGFRの活性化がリガンド非依存的であるという本研究の知見は、NGFRの細胞内シグナル伝達メカニズムのより詳細な解明を必要とする。さらに、CD169+マクロファージがLECの基礎的な増殖を抑制し、sEVとLECの相互作用を制限する可能性が示唆されたが、このメカニズムの全容解明も今後の研究課題である。ヒト患者コホートの規模を拡大し、NGFR発現と予後の相関を検証することも、臨床的有用性を確立するために不可欠である。
方法
sEVの産生・精製と特性評価: 低転移性 (B16-F1)、高転移性 (B16-F10)、およびLN転移性 (B16-F1R2) マウスメラノーマ細胞株、ならびに正常メラノサイト (melan-a) から、超遠心法 (100,000 g) によりsEVを精製した。sEVの純度は、エクソソームマーカー (ALIX, CD81, CD9) の陽性発現と、小胞体 (CALNEXIN) およびゴルジ体 (GM130) マーカーの陰性発現により確認した。ナノ粒子トラッキング解析 (NTA)、電子顕微鏡、およびヨージキサノール密度勾配超遠心法を用いてsEVのサイズ、形態、純度を特性評価した。
sEVのin vivo分布追跡: NIR815蛍光標識sEV (5 μg) をC57BL/6Jマウスの足底内注射し、IVIS Spectrumイメージングシステムを用いて1〜48時間および3週間にわたり膝窩、腸骨、鼠径LNへの分布を追跡した (n=4 LN/群)。Prox1-GFPマウスの耳介内注射により、リンパ管内部のsEV局在を可視化した。フローサイトメトリーにより、sEVを取り込む細胞集団 (LEC: CD45-CD31+podoplanin+, マクロファージ: CD45+CD11b+CD169+F4/80+) を同定した。
LECのRNAシーケンス・プロテオミクス統合解析: ヒトLEC (hLEC) を高転移性ヒトメラノーマSK-MEL-147由来sEVまたは条件培地 (CM) で48時間処理し、RNAシーケンスを実施した (FDR<0.05で447遺伝子が上方制御、318遺伝子が下方制御)。得られたデータは、SK-MEL-147由来sEVのプロテオーム解析データ (LTQ Orbitrap Velos, MaxQuant) と統合解析し、1,311のRNA-タンパク質ペアを評価した。
シグナル伝達経路解析: NFκB経路の活性化はp65の核移行 (共焦点顕微鏡、ハイコンテントスクリーニング) により評価した。ERK1/2のリン酸化はウェスタンブロット (WB) およびハイコンテントスクリーニングにより、ICAM-1の発現はqPCR、WB、免疫組織化学 (IHC) により、VEGFR3のリン酸化はWBにより評価した。
NGFRノックアウト/ノックダウンモデルと薬理学的阻害: CRISPR-Cas9技術を用いて、B16-F1R2細胞のNgfr遺伝子ノックアウト (KO) 細胞およびSK-MEL-147細胞のNGFR shRNAノックダウン細胞を作製した。NGFR枯渇がsEV産生量、タンパク質量、およびLECによるsEV取り込みに影響しないことを確認した。NGFR阻害薬THX-B (15 μM)、MEK阻害薬PD0325901 (1 μM)、およびNFκB阻害薬JSH-23 (5 μM) を用いて、薬理学的阻害効果を評価した。
マウスin vivo実験: sEVによるLN教育後、B16-F1-mCherry腫瘍細胞を接種し、実験的転移モデルまたは自発転移モデルでLN転移を評価した。Matrigelプラグアッセイによりin vivoでのリンパ管新生を評価し、Vegfr3-EGFP-Lucリンパレポーターマウスを用いてリンパ管新生を定量した。LECの増殖はKi67/PROX-1免疫蛍光染色で評価した。THX-B (2.5 mg/kg 腹腔内投与、週2回) 処置により、薬理学的NGFR阻害の治療効果を検証した。
ヒト患者コホート解析: 2つの独立したヒトメラノーマ患者コホートを解析した。コホート1 (Stage III/IV 44例) では、原発皮膚病変とLN転移巣におけるNGFRのIHC Hスコアを比較した。コホート2 (Stage II/III 25例、スイス・ポーランドの組織ペア) では、原発巣とLN転移巣におけるNGFR+MITF+ (メラノーママーカー) 細胞の頻度をペア比較し、患者の全生存期間との相関を解析した。統計解析にはGraphPad Prismソフトウェアv.9.1.0を用い、Studentのt検定、一元配置分散分析 (ANOVA)、二元配置分散分析、または非パラメトリック検定を適用した。