- 著者: Daniel Hirschhorn, Sadna Budhu, Lukas Kraehenbuehl, Mathieu Gigoux, David Schröder, Andrew Chow, Jacob M. Ricca, Billel Gasmi, Olivier De Henau, Levi Mark B. Mangarin, Yanyun Li, Linda Hamadene, Anne-Laure Flamar, Hyejin Choi, Czrina A. Cortez, Cailian Liu, Aliya Holland, Sara Schad, Isabell Schulze, Allison Betof Warner, Travis J. Hollmann, Arshi Arora, Katherine S. Panageas, Gabrielle A. Rizzuto, Rebekka Duhen, Andrew D. Weinberg, Christine N. Spencer, David Ng, Xue-Yan He, Jean Albrengues, David Redmond, Mikala Egeblad, Jedd D. Wolchok, Taha Merghoub
- Corresponding author: Taha Merghoub; Jedd D. Wolchok (Swim Across America and Ludwig Collaborative Laboratory, Immunology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2023
- Epub日: 2023-04-13
- Article種別: Original Article
- PMID: 37001503
背景
がん免疫療法における主要な課題の一つは、腫瘍抗原の不均一性 (heterogeneity) と抗原エスケープである。免疫チェックポイント阻害 (ICB) 療法や養子T細胞療法が一部の患者で奏効を示す一方で、腫瘍は抗原を喪失したクローンを選択的に進化させ、治療抵抗性を獲得することが主要な機序として知られている。抗原陰性バリアントはT細胞受容体 (TCR) を介した認識を完全に回避するため、T細胞中心の免疫療法では原理的に根絶が不可能であるとされてきた。しかし、臨床現場では、抗原的に不均一な腫瘍を持つ一部の患者で完全奏効が観察されることがあり、これはT細胞以外の自然免疫エフェクター細胞の関与を示唆していた。この現象のメカニズムは未解明な点が残されていた。
好中球は、がん生物学において「腫瘍促進的 (pro-tumor)」な骨髄由来抑制細胞 (MDSC) 様の機能と、「抗腫瘍的 (anti-tumor)」な機能の両極性が報告されており、その役割は長らく議論の的であった。例えば、慢性炎症環境における好中球は腫瘍の増殖や転移を促進することが示されており、高い好中球-リンパ球比 (NLR) はICB治療患者において不良な予後と関連することが報告されている (Cassidy et al. 2017)。また、好中球細胞外トラップ (NETosis) の形成が転移を促進し、T細胞からの腫瘍保護に寄与する可能性も指摘されている (Albrengues et al. 2018)。一方で、急性炎症や特定の治療介入の文脈では、好中球が抗腫瘍特性を示すことも報告されている (Mahiddine et al. 2019)。しかし、T細胞免疫療法の文脈における好中球のエフェクター機能、特に抗原エスケープバリアントの排除における役割は、これまで十分に定義されていなかったため、この領域には知識のギャップが残されていた。
先行研究では、サイクロホスファミド (CTX) とメラノーマ抗原Trp1特異的CD4+ T細胞の養子移入、そして抗OX40アゴニスト抗体の組み合わせが、進行したマウスメラノーマ腫瘍を排除し、Trp1を不均一に発現するメラノーマにおいて抗原喪失バリアントクローンも根絶することを示唆していた (Hirschhorn-Cymerman et al. 2012)。この観察は、T細胞が直接認識できない抗原陰性腫瘍細胞の排除に、T細胞以外のメカニズムが関与している可能性を強く示唆するものであった。しかし、その詳細なメカニズム、特に好中球がどのように関与し、抗原エスケープバリアントを排除するのかについては、依然として未解明な点が残されていた。本研究は、この知識ギャップを埋めることを目的としている。
目的
本研究の目的は、抗原的に不均一な腫瘍を排除するT細胞免疫療法のメカニズムを解明することである。特に、抗原陰性エスケープバリアントの排除において、好中球がどのような役割を果たすかを生物学的に詳細に解析する。さらに、この経路がヒトのICB治療を受けたメラノーマ患者コホートにおいても機能しているかを検証することを目指す。具体的には、以下の点を明らかにすることを目的とする。
- メラノーマ特異的CD4+ T細胞療法とOX40共刺激またはCTLA-4阻害の併用が、抗原陰性エスケープバリアントを含む腫瘍を根絶する能力を評価する。
- この腫瘍根絶効果における好中球の必須性をin vivoで検証する。
- 治療によって活性化された好中球が、抗原陰性腫瘍細胞を直接殺傷する能力を持つか、またその殺傷メカニズムを特定する。
- 治療によって誘導される好中球の遺伝子発現プロファイルおよび表面マーカーの変化を、トランスクリプトミクスおよびフローサイトメトリーを用いて詳細に解析し、抗腫瘍性好中球の明確なサブセットを同定する。
- ヒトメラノーマ患者のICB治療前後の生検サンプルにおいて、好中球の活性化と抗腫瘍効果との関連性を検証し、前臨床モデルで得られた知見の臨床的妥当性を評価する。
結果
Triple therapyによる混合腫瘍の完全排除: サイクロホスファミド (CTX) 前処置、Trp1特異的CD4+ T細胞の養子移入、および抗OX40アゴニスト抗体の「triple therapy」は、B16 (Trp1+抗原陽性) とB78H1 (Trp1-抗原陰性) の混合腫瘍を完全に退縮させた (Fig 1E)。単独療法では効果は限定的であった。特に重要な所見は、単一腫瘍モデルでは抗原陽性のB16のみが排除されるのに対し、混合腫瘍モデルでは抗原陰性のB78H1も排除された点である。抗CTLA-4抗体もtriple therapyの一部として有効性を示したが、抗OX40と比較して効果はやや限定的であった (p<0.001)。この結果は、強力な免疫療法が、標的抗原を発現しないがん細胞を含む不均一な腫瘍も排除できることを示唆している。
内因性適応免疫の非必須性: B細胞およびT細胞が欠損しているRAG1 KOマウス (n=9 mice/group) にTrp1 CD4+ T細胞を養子移入し、抗OX40抗体を投与したところ、混合腫瘍は同様に完全に排除された (Fig 2D)。これは、内因性のCD8+ T細胞やB細胞が抗原エスケープバリアントの排除に必須ではなく、移入されたCD4+ T細胞と自然免疫エフェクター細胞のみで十分であることを示している。Trp1 T細胞の腫瘍浸潤は治療早期にピークに達したが、腫瘍の最大退縮とは必ずしも相関しなかった (Fig 2A)。治療開始3日後のTrp1 T細胞枯渇は治療効果を著しく減弱させたが、13日後の枯渇は治療効果に影響を与えなかった (Fig 2C)。これらの結果は、Trp1 T細胞が初期の抗腫瘍免疫応答に必要であるものの、その後の抗原エスケープバリアントの排除には別のメカニズムが関与していることを示唆する。
好中球が重要なエフェクター細胞であること: 抗Ly6G抗体による好中球枯渇は、triple therapyの抗腫瘍効果を完全に消失させ、初期の腫瘍退縮後に再増殖を招いた (Fig 4C, p<0.001)。特にB78H1 (抗原陰性) クローンが優位に再出現した。CXCR2アンタゴニストによる好中球動員阻害も同様に治療効果を抑制した。治療奏効腫瘍の抽出物からは、GM-CSF、IL-3、MIP-1α、MIP-1βなどの自然免疫関連サイトカインが著明に高レベルで検出された (Fig 3A, p<0.05)。組織学的解析では、治療奏効腫瘍においてLy6G+およびCD11b+の好中球浸潤が顕著に増加していることが確認された (Fig 3B, C, p<0.001)。さらに、治療された腫瘍では、ミエロペルオキシダーゼ (MPO) およびシトルリン化ヒストンH3 (CitH3) をマーカーとするNETosisの増加も観察された (Fig 3D)。これらのデータは、T細胞を標的とする免疫療法が好中球を動員し、活性化させることを示している。
好中球による抗原陰性細胞のex vivo殺傷: 治療奏効腫瘍から分離した好中球 (n=4-6 wells/condition) とB78H1細胞を共培養したところ、MHC非依存的な直接細胞傷害性が確認された (Fig 4A)。この殺傷能力は、ナイーブな好中球には見られず、治療によって活性化された状態に依存していた。また、in vitroで活性化されたTrp1 T細胞の培養上清に曝露されたナイーブ好中球も、B78H1細胞の殺傷を促進した (Fig S2C)。これは、T細胞が分泌する因子が好中球を教育し、抗原エスケープバリアントを殺傷する能力を付与することを示唆する。
iNOS (NOS2) 依存的な殺傷メカニズム: 治療奏効腫瘍の好中球において、誘導型一酸化窒素合成酵素 (iNOS; Nos2) の発現が著明に上昇していた。iNOS阻害剤L-NAMEの投与、またはNos2 KO宿主を用いた実験では、ex vivoでの好中球によるB78H1殺傷が部分的に抑制された (Fig 6J, K, p<0.05)。この結果は、iNOSが産生する一酸化窒素 (NO) が、好中球による主要な細胞傷害性メディエーターの一つであることを示唆している。ただし、殺傷の完全な消失ではなかったため、ROSやNETsなど他のメカニズムも寄与する可能性が考えられる。iNOS欠損マウス (iNOS KO) では生存率が大幅に低下した (p < 0.00001)。
抗腫瘍性好中球の明確なシグネチャー: 治療奏効腫瘍からソーティングしたLy6G+好中球のバルクRNA-seq解析により、治療群の好中球が特徴的な転写シグネチャーを獲得していることが示された (Fig 5A)。治療群の好中球は未治療群と比較して約2.5倍の遺伝子発現変化を示し、遺伝子発現プロファイルに明確な差が見られた (log2FC > 2, p < 0.05)。scRNA-seq解析では、治療群の腫瘍から得られた骨髄系細胞において、Ly6G+好中球が優位に濃縮されており、特に抗OX40治療群では「クラスター1」と呼ばれる明確な好中球サブセットが同定された (Fig 5B, D, Fig 6A)。このクラスター1は、Il1b、Osm、Plaur、Socs3、Ccl4などの遺伝子発現が上昇しており、GO (Gene Ontology) 解析では、走化性、好中球殺傷、アポトーシス、NETosisなどの経路が濃縮されていた (Fig 6B, C)。フローサイトメトリー解析でも、抗OX40治療群の腫瘍浸潤好中球は、CD14、CD117、IL1Rβ、CD18、CD40、CD177、SiglecF、CD49d、CD16などの活性化マーカーが高発現し、CD62LやCD206が低発現していることが示された (Fig 6H)。また、PD-L1の発現は低下し、iNOSの発現は上昇していた (Fig 6I)。これらの結果は、triple therapyが機能的に成熟し、抗腫瘍能を持つ好中球サブセットを誘導することを示唆している。
ヒトメラノーマICBコホートでの検証: 抗PD-1/CTLA-4治療奏効患者の治療中生検 (n=14 patients) において、好中球浸潤と活性化マーカー (CD66b, MPO) が有意に増加していることが確認された (Fig 7B)。また、抗OX40治療によって誘導された「クラスター1」の遺伝子シグネチャーは、抗CTLA-4前治療を受けたメラノーマ患者において、良好な予後と関連していた (Fig 7D, p<0.05)。MC38結腸癌マウスモデル (n=5 mice/group) を用いた実験でも、抗OX40単独療法や抗CTLA-4/抗PD-1併用療法の効果は、好中球枯渇によって有意に減弱した (Fig 7A, C)。これらの結果は、マウスモデルで観察されたT細胞と好中球の協調メカニズムが、ヒトのICB治療においても臨床的に関連することを示している。
考察/結論
本研究は、T細胞免疫療法が好中球を自然免疫エフェクターとして「動員」することで、腫瘍の抗原不均一性を克服するという新たなパラダイムを確立した画期的なメカニズム研究である。これは、免疫療法の合理的な設計において「適応免疫と自然免疫の協調」の重要性を決定的に示したものである。
主要な概念的進歩:
- 抗原陰性腫瘍クローンを排除するメカニズムの発見: T細胞による直接認識が不可能なエスケープバリアントを、好中球がiNOSを介して非特異的に殺傷するという、古典的な適応免疫のドグマを拡張する知見である。
- CD4+ T細胞とOX40軸が自然免疫活性化因子として機能: CD4+ T細胞は腫瘍抗原を直接認識するだけでなく、OX40エンゲージメントを介して好中球をリクルートする炎症性微小環境を形成することが示された。
- N1抗腫瘍好中球のin vivoでのエビデンス: Fridlender et al. (2009) のTGF-β依存的なN1/N2好中球の概念を、免疫療法コンテキストで決定的に検証した。
- RAG非依存的な有効性: 内因性T/B細胞が不要で、好中球が抗原エスケープ排除を担うため、リンパ球減少症の患者 (化学療法後、高齢者など) でも養子CD4 T細胞とOX40アゴニストの併用が有効である可能性が示唆される。
先行研究との違い: これまでの研究では、好中球は腫瘍促進的または抗原提示細胞としての役割が主に注目されてきたが、本研究はT細胞免疫療法によって誘導される好中球が、T細胞が認識できない抗原陰性腫瘍細胞を直接殺傷するという、これまで報告されていない新規の抗腫瘍メカニズムを明らかにした点で対照的である。特に、iNOSを介した殺傷メカニズムの同定は新規である。
臨床的含意:
- 抗原不均一性克服の治療戦略: TCR-T、CAR-T、ICBのいずれにおいても抗原喪失による再発が主要な治療失敗要因である。本研究は、好中球活性化を並行して誘導するレジメン (GM-CSF、OX40アゴニスト、CXCR2アゴニストなど) の設計原理を提供する。
- OX40アゴニストの臨床的位置付け強化: 単独でのPhase I試験では中程度の効果であったOX40アゴニスト (BGB-A445, INCAGN01949) が、本研究の知見に基づき、CD4+ T細胞ベースの細胞療法との併用Phase II試験を正当化する。
- 好中球バイオマーカー: ICB治療患者の治療前/治療中における好中球活性化スコアを、治療奏効予測因子として開発する可能性を示唆する。
- 腫瘍抗原陰性転移や微小残存病変への応用: 好中球を介した根絶は、抗原モザイク状態の腫瘍や微小残存病変に対しても機能する可能性がある。
残された課題と今後の方向性: 本研究はB16/B78H1という高度に人工的な混合モデルを使用しており、自然発生腫瘍の不均一性とは動態が異なる可能性がある点がlimitationである。また、CD4+ Trp1 TCR tgの高い前駆細胞頻度は、患者では再現が困難である。iNOS依存的な殺傷が部分的なものであったため、残存する殺傷メカニズム (NET、プロテアーゼ、ADCCなど) の相対的寄与は未解明である。好中球の腫瘍促進性から抗腫瘍性へのスイッチを決定する内在的因子 (GM-CSF濃度、腫瘍のTGF-βレベルなど) も完全には解明されていない。ヒトコホートは観察研究であり、好中球浸潤と臨床的利益の因果関係を確立するには、今後の前向き試験が必要である。
今後の研究の方向性としては、TILベースの細胞療法とOX40アゴニストの併用Phase I-II試験 (転移性メラノーマ、トリプルネガティブ乳がんなど) が挙げられる。また、抗腫瘍性好中球のex vivo増殖プロトコルの開発や、iNOS誘導剤の小分子スクリーニングによる好中球再プログラミングも有望である。ヒト腫瘍微小環境における「抗腫瘍性好中球」の細胞状態バイオマーカーの特定 (空間トランスクリプトミクス、CODEXなど) や、CAR-好中球工学のin vivo有効性検証 (CAR-NKと並行して) も期待される。さらに、ネオアジュバントICBとG-CSF (好中球ブースト) の併用による抗原陰性微小残存病変の根絶試験も検討されるべきである。
方法
本研究は、前臨床マウスモデルを用いたメカニズム解析と、ヒト臨床サンプルを用いたトランスレーショナル検証を組み合わせたデザインで実施された。
試験デザイン: マウスモデルでは、C57BL/6マウスにB16メラノーマ (Trp1+抗原陽性) とB78H1メラノーマ (Trp1-、MHC-I/II-抗原陰性) の1:1混合腫瘍を皮下移植した。介入として、サイクロホスファミド (CTX) 前処置後、Trp1ペプチド特異的CD4+ T細胞 (Trp1 T cells) を養子移入し、さらに抗OX40アゴニスト抗体 (OX86)、または抗CTLA-4抗体 (9H10)、または抗PD-1抗体を投与した。遺伝的ツールとして、RAG1 KOマウス (内因性適応免疫欠損)、MHC class II KOマウス、iNOS (Nos2) KOマウス、PAD4 KOマウス、NE KOマウス、およびC57BL/6 WTマウスを用いた。臨床検体としては、Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) のメラノーマ患者から、ICB (抗PD-1、抗CTLA-4、または併用) 治療前後の生検サンプルおよびアーカイブコホートを使用した。
主要手技:
- 腫瘍負荷評価: 腫瘍サイズはキャリパー測定により経時的に評価した。一部の実験では、ルシフェラーゼ発現Trp1 T細胞を用いた生物発光イメージング (BLI) によりT細胞浸潤を追跡した。腫瘍組織はH&E染色およびTrp1免疫組織化学 (IHC) 染色により、抗原陽性 vs 抗原陰性クローンの比率を定量した。
- 好中球介入: 好中球のin vivoでの役割を評価するため、抗Ly6G抗体 (クローン1A8) による好中球枯渇実験、およびCXCR2アンタゴニスト投与を行った。
- 好中球ex vivo殺傷アッセイ: 治療後の腫瘍からFACSでソーティングしたLy6G+好中球と、B78H1 (抗原陰性) 細胞を共培養し、クローン形成アッセイおよび活性カスパーゼ3/7染色により細胞傷害性を定量した。
- iNOS依存性: iNOSの関与を評価するため、iNOS阻害剤L-NAMEの投与、Nos2 KO宿主の使用、およびLy6G+好中球におけるNos2発現の定量 (RNA-seqおよびIHC) を行った。
- トランスクリプトミクス解析: 腫瘍浸潤好中球のバルクRNA-seqおよびシングルセルRNA-seq (scRNA-seq) を実施し、遺伝子発現プロファイルを比較した。健康ドナーおよび患者血液由来好中球との比較も行った。scRNA-seqデータは、UMAPによる次元削減と非教師ありクラスタリングを用いて解析し、CITE-seqにより表面タンパク質発現も同時に評価した。
- ヒトコホート解析: ICB治療を受けたメラノーマ患者の治療前/治療中/治療後の生検において、好中球浸潤 (CD66b, MPO IHC) と臨床効果との相関を評価した。また、治療奏効予測因子としての好中球関連遺伝子シグネチャーの評価も行った。
エンドポイント: 混合腫瘍の完全退縮率、B78H1 (抗原陰性) クローンの選択的生存、好中球浸潤量、NET (Neutrophil Extracellular Traps) 形成 (H3Cit染色)、好中球の抗腫瘍遺伝子シグネチャー、ICB奏効 vs 非奏効コホートにおける好中球の特徴などが主要な評価項目であった。統計解析には、GraphPad Prism 7を用い、Kaplan-Meier曲線による生存解析、t検定、Mann-Whitney U検定、Fisherの正確確率検定などを用いた。