- 著者: Filippo Veglia, Ayumi Hashimoto, Harsh Dweep, Emilio Sanseviero, Alessandra De Leo, Evgenii Tcyganov, Andrew Kossenkov, Charles Mulligan, Brian Nam, Gregory Masters, et al.
- Corresponding author: Dmitry I. Gabrilovich (AstraZeneca, Gaithersburg, MD, USA)
- 雑誌: Journal of Experimental Medicine
- 発行年: 2021
- Epub日: 2021-06-04
- Article種別: Original Article
- PMID: 33566112
背景
多形核骨髄由来抑制細胞 (PMN-MDSC) は、T細胞抑制機能を持つ主要な免疫抑制細胞集団として、癌の進行において重要な役割を果たすことが広く認識されている。しかし、長年にわたり、古典的好中球 (classical PMN) とPMN-MDSCを明確に区別する分子マーカーが不在であるという課題が存在した。担癌マウスにおいて、全てのPMNをPMN-MDSCと見なす慣行があったが、抗腫瘍活性を持つPMNと腫瘍促進性のPMN-MDSCが共存し、それぞれが異なる機能を持つ可能性は未解明であった。ヒトにおいては、LOX-1がPMN-MDSCの候補マーカーとしてCondamine et al. SciImmunol 2016によって報告されたものの、その特異性は不完全であり、選択的な治療標的化を可能にする分子基盤が不足していた。このため、PMN-MDSCを標的とする治療戦略の開発は困難であった。
先行研究では、PMNが癌の腫瘍微小環境 (TME) の重要な構成要素であり、機能的に多様であることが示されている (Coffelt et al. 2016)。PMNは抗腫瘍活性を持つ可能性も示唆されているが (Fridlender et al. CancerCell 2009)、多くのエビデンスは、癌におけるPMNの存在が予後不良と関連することを示している (Zhou et al. 2018)。これらの免疫抑制活性は、病理学的に活性化されたPMN集団であるPMN-MDSCに起因すると考えられている (Condamine et al. 2015b)。PMN-MDSCはTリンパ球、Bリンパ球、NK細胞の機能を抑制し、非免疫学的メカニズムを介して腫瘍の進行と転移を促進する。しかし、抗腫瘍活性を持つPMNと腫瘍促進活性を持つPMN-MDSCを同じ宿主内でどのように区別するか、またこれらの細胞集団間の関係性は不明であった。
近年、単一細胞RNAシーケンス (scRNA-seq) を用いた研究により、担癌マウス由来のPMNが対照マウスのPMNとは異なる遺伝子シグネチャーを示すこと、およびMDSCの状態がマウスとヒト間で概ね保存されていることが報告されている (Alshetaiwi et al. 2020)。しかし、これらの研究はPMNのレパートリー全体を捉えるには不十分であり、特に腫瘍組織におけるPMNプロファイルの同定には限界があった。PMNの低い転写活性が、重要な情報の欠如に寄与している可能性も指摘されていた。これらの限界を克服し、癌におけるPMNの不均一性を包括的に理解するためには、より詳細な解析が必要とされていた。
目的
本研究の目的は、担癌マウスおよび癌患者における多形核好中球 (PMN) の不均一性を、単一細胞RNAシーケンス (scRNA-seq)、質量分析 (CyTOF)、フローサイトメトリー、および機能アッセイを統合したマルチプラットフォーム解析により包括的に特徴付けることである。これにより、PMN-MDSCに特異的な分子マーカーを同定し、古典的好中球とPMN-MDSCの共存関係およびそれぞれの機能的特性を解明する。
具体的には、以下の点を目的とした。
- 担癌マウスの脾臓および腫瘍組織において、PMNの異なるサブタイプをscRNA-seqにより同定し、その分布と遺伝子発現プロファイルを解析する。特に、PMN1 (古典的PMN)、PMN2 (PMN-MDSC)、およびPMN3 (活性化PMN-MDSC)の3つのPMN集団の特性を明らかにする。
- 同定されたPMNサブタイプの中から、PMN-MDSCに特異的な表面マーカーを探索し、特にCD14の発現パターンとT細胞抑制機能との関連を詳細に評価する。
- 腫瘍微小環境 (TME) におけるPMN-MDSCの活性化経路と、その免疫抑制機能に寄与する分子メカニズムを明らかにする。
- ヒト癌患者の末梢血および腫瘍組織におけるPMNの不均一性をCyTOFおよびscRNA-seqにより解析し、マウスで得られた知見のヒトへの翻訳可能性を検証する。
- 腫瘍PMN-MDSCの遺伝子シグネチャーと、大規模なヒト癌データセット (Moffitt肺癌データセット、TCGA) における臨床予後との関連を評価し、PMN-MDSCが予後予測バイオマーカーとしての可能性を持つか検証する。
これらの目的を達成することで、PMN-MDSCが古典的好中球とは異なる独自の細胞集団であることを確立し、選択的な治療標的化のための分子基盤を提供することを目指す。
結果
担癌マウスにおけるPMNの3つのクラスター同定と組織特異的分布: scRNA-seq解析により、担癌マウスのPMNはPMN1 (古典的PMN)、PMN2 (PMN-MDSC)、PMN3 (活性化PMN-MDSC) の3つの主要なクラスターに分離された。正常脾臓のPMNはPMN1が94.51%、PMN2が5.49%を占め、PMN3はわずか0.04%であった (n=3 mice)。一方、LLCおよびEL4担癌マウスの脾臓では、PMN1が約30%に減少し、PMN2が約40%、PMN3が約20-30%へとシフトした。特に、腫瘍組織ではPMN3が主要なクラスターとなり、PMN1は30%未満であった。これは、腫瘍微小環境 (TME) においてPMN3が選択的に蓄積することを示している (Figure 1C)。擬似時間解析では、PMN1細胞がPMN2またはPMN3に異なる経路で分化する可能性が示唆され、PMN2がPMN3への過渡的な状態ではないことが示された (Figure 2)。
CD14をPMN-MDSCの特異的マーカーとして同定: scRNA-seqデータから、CD14がPMN3で最も高く発現し、次いでPMN2、PMN1の順に発現が低いことが明らかになった。フローサイトメトリーとFlowSOM解析を組み合わせることで、腫瘍非保有マウスの脾臓PMNは主に1つのクラスターからなるのに対し、担癌マウスの脾臓PMNは2つのクラスター、腫瘍PMNは3つのクラスターを持つことが確認された (Figure 3A)。CD14の発現パターンは、これらのPMN集団を明確に区別するマーカーとして機能した。正常脾臓PMNの95%以上がCD14陰性であったのに対し、LLCおよびEL4担癌マウスの脾臓では、腫瘍注入後4週間でCD14中間発現 (CD14int) PMNが約40%に増加した (n=5-8 mice)。腫瘍組織では、CD14intおよびCD14高発現 (CD14high) PMNが優勢な集団となり、全PMNの75%以上を占め、CD14high細胞は30%以上であった (Figure 3D)。GL261FL脳腫瘍モデルでも同様の傾向が観察され、CD14がTME誘導性のPMN-MDSC特異的マーカーとして機能することが確立された (Figure 3E, p<0.0001)。
T細胞抑制能のCD14発現依存性: 抗原特異的CD8+ T細胞増殖抑制アッセイにより、CD14発現レベルとPMNの免疫抑制機能との間に段階的な相関が認められた。CD14陰性PMNは20%未満の抑制能しか示さず、CD14int PMNは50-60%の抑制、CD14high PMNは75-85%の強力な抑制活性を示した (Figure 6C, p<0.0001)。腫瘍PMNは脾臓PMNよりも細胞あたりの抑制能が有意に高く (1:1比で脾臓PMNが55%に対し腫瘍PMNが80%, n=8 mice)、特に腫瘍内のPMN3が最も強力な免疫抑制細胞であることが示された (Figure 6A)。これは、CD14高発現細胞がPMN-MDSCの免疫抑制活性の主要な寄与者であることを強く示唆している。
免疫抑制遺伝子シグネチャーと活性化経路: PMN3/CD14high細胞では、Arg1、Nos2、Ptgs2 (COX2)、S100a8/A9、Slc27a2 (FATP2)、Cd274 (PD-L1) など、古典的なMDSCシグネチャー遺伝子の発現が著しく上昇していた (Figure 5A-C)。例えば、Arg1の発現は脾臓PMNと比較して腫瘍PMNで顕著に高く、特にCD14high腫瘍PMNで最も高かった (p<0.0001)。Nos2の発現はCD14high腫瘍PMNに排他的に関連していた (p<0.0001)。IPA解析では、PMN3クラスターにおいてIL-6、HMGB1、TNFR1、IL-1、TLRシグナル伝達、一酸化窒素 (NO) および活性酸素種 (ROS) 産生、低酸素関連遺伝子経路が豊富に存在することが示され、これらの細胞が活性化状態にあることが確認された (Figure S1)。in vitro実験では、腫瘍由来のexplant supernatant (TES)、GM-CSF、および低酸素条件がPMNのCD14発現を誘導し、TMEにおけるCD14誘導メカニズムを裏付けた (Figure 6F, n=6 replicates)。GM-CSF中和抗体はGM-CSFによるCD14high PMNの蓄積効果を完全に阻害し、TESによる効果も部分的に減少させた (Figure 6G, n=4 replicates)。S100A9過剰発現マウスでは、CD14high PMNの割合が有意に増加し、S100A9がCD14発現の調節に寄与する可能性が示唆された (Figure 6H, n=3 mice, p<0.0001)。
ヒトPMNの2つのクラスターと臨床予後予測: ヒト癌患者の腫瘍PMNの遺伝子発現プロファイル (GEP) は、末梢血PMNと比較して1,400以上の遺伝子で差次発現を示し、非常に特徴的であった (Figure 7A)。この腫瘍PMN-MDSC遺伝子シグネチャーは、Moffitt肺癌データセットでHR 1.54 (p=8.6e-56)、TCGAデータセットでHR 1.7 (p=1.7e-29) と、強力な予後不良予測能と関連することが示された (Figure 7E)。T細胞浸潤腫瘍 (通常は良好な予後と関連) においても、PMN-MDSCシグネチャーが高発現の患者は、予後が著しく短縮された (Figure 7F)。一方、LOX-1に基づく古典的PMNシグネチャーは、MoffittでHR 1.17、TCGAでHR 1.55と、PMN-MDSCシグネチャーよりも弱い相関であった (Figure 7G)。
CyTOF解析により、ヒト癌患者の腫瘍組織では、古典的PMNに類似するPMN1と、PMN-MDSCに典型的な表現型を持つPMN2の2つの明確なPMN集団が同定された (Figure 9A, B, n=4 patients)。腫瘍PMNの約70%がPMN2集団であった (Figure 9C)。末梢血では、癌患者のPMNはPMN1とPMN2がほぼ同等に存在したが (Figure 9F)、健常ドナーの末梢血PMNは80%以上がPMN1集団であった (Figure 9G, n=4 donors)。しかし、マウスPMNとは異なり、ヒトPMNではCD14の検出可能な発現は観察されなかった。
考察/結論
本研究は、多形核好中球 (PMN) が癌において機能的に不均一な集団であり、特にPMN-MDSCが古典的好中球とは独立した独自の腫瘍微小環境 (TME) 誘導性の細胞集団であることを、単一細胞レベルの分解能で初めて確立した画期的な論文である。担癌マウスにおいて、CD14がPMN-MDSCの選択的マーカーとして機能することを同定したことは、PMN-MDSC研究における長年のギャップを埋める重要な知見である。
先行研究との違い: これまでの研究では、PMN-MDSCと古典的好中球の明確な区別が困難であったが、本研究はscRNA-seq、CyTOF、機能解析を統合することで、これら2つの細胞集団が異なる遺伝子発現プロファイルと機能を持つことを明確に示した。特に、マウスにおいてCD14がPMN-MDSCの特異的マーカーとして機能するという発見は、Condamine et al. SciImmunol 2016がヒトPMN-MDSCのマーカーとしてLOX-1を報告したこととは対照的であり、種差の存在を示唆する。
新規性: 本研究で初めて、担癌マウスにおいてPMN1 (古典的PMN)、PMN2 (PMN-MDSC)、PMN3 (活性化PMN-MDSC) の3つのPMNクラスターを同定し、特にPMN3がTMEで早期から優勢であり、強力なT細胞抑制活性を持つことを明らかにした。CD14の発現がこれらのPMN集団を区別するマーカーとして機能すること、およびCD14高発現PMNが最も強力な免疫抑制能を持つことを示した点は新規である。また、腫瘍由来の因子 (GM-CSF、低酸素など) がPMNのCD14発現を誘導し、PMN-MDSCへの分化を促進するメカニズムをin vitroで確認したこともこれまで報告されていない重要な発見である。
臨床応用: 腫瘍PMN-MDSCの遺伝子シグネチャーが、MoffittおよびTCGAの大規模データセットにおいて、HR 1.54 (p=8.6e-56) およびHR 1.7 (p=1.7e-29) と、強力な予後不良予測能を持つことは、本知見の臨床的意義を強く示唆する。Ayers et al. JClinInvest 2017のような通常は良好な予後を示す患者群においても、PMN-MDSCシグネチャーが高発現の場合には予後が著しく短縮されることから、PMN-MDSCシグネチャーが免疫チェックポイント阻害剤 (ICI) 治療の反応予測バイオマーカーとして臨床応用される可能性を秘めている。FATP2阻害薬、ARG1阻害薬、iNOS阻害薬などによるPMN-MDSCの選択的標的化や、CXCR2阻害薬とICIの併用療法における精密化など、精密免疫腫瘍学への道を開くものである。
残された課題: 本研究の限界として、マウスPMNで同定されたCD14がヒトPMNでは明確に検出されなかった点が挙げられる。これは、マウスで得られた知見のヒトへのtranslationalな適用における課題を示している。また、ヒト癌患者のサンプル数が6例と小規模であり、他癌種や大規模コホートでのさらなる検証が必要である。PMN3の分化起源がPMN1からの移行なのか、あるいは独立した供給源から生じるのかについては、詳細な系統追跡研究が今後の検討課題である。さらに、PMN-MDSCの治療反応性 (ICI、化学療法など) との関連を前向きに評価することも、今後の研究方向性として重要である。
方法
試験デザイン: 本研究は、担癌マウスにおけるPMNの単一細胞レベルでの包括的解析と、ヒト癌患者におけるその知見の検証を目的としたマルチプラットフォーム解析である。
サンプル: マウス実験では、腫瘍非保有マウスの脾臓 (n=3 mice)、Lewis lung carcinoma (LLC) 担癌マウスの脾臓 (n=3 mice) および腫瘍組織 (n=4 mice)、EL4リンパ腫担癌マウス、GL261FL (glioma 261 expressing luciferase) 脳腫瘍担癌マウス、KPC膵癌モデルマウスを用いた。ヒトサンプルとしては、非小細胞肺癌患者6例の末梢血および腫瘍組織、ならびに健常ドナーの末梢血を用いた。さらに、大規模なバルクRNAシーケンスデータセットとして、Moffitt肺癌データセットおよびThe Cancer Genome Atlas (TCGA) データセットを解析に利用した。
scRNA-seq: マウスPMNのscRNA-seqでは、CD45+ Ly6G+ Ly6C(low) 細胞をソーティングし、10x Genomics Chromiumプラットフォームを用いてライブラリを調製した。合計66,854個の細胞を解析対象とし、各細胞で最低400遺伝子、各遺伝子で最低1カウントの発現があるものを採用した。生カウントデータはscranおよびscaterパッケージを用いて細胞特異的バイアスを補正し、Stuart et al. Cell 2019を用いてバッチ補正、クラスタリング、マーカー遺伝子同定を行った。Unbiased, graph-based clusteringにより、PMN1、PMN2、PMN3の3つの主要なPMNクラスターを同定した。ヒトPMNのscRNA-seqでは、健常ドナーおよび癌患者の末梢血からCD45+ CD14- CD15+ CD66b+ PMNをソーティングし、同様に10x Genomicsプラットフォームで解析した。
擬似時間解析: Monocle3 (v3.0.2.0) を用いて、PMN1、PMN2、PMN3の3つのPMN集団の擬似時間経路を推定した。PMN1細胞を初期段階として設定し、PMN1からPMN2およびPMN3への可能な移行方向を反映する擬似時間を解析した。
フローサイトメトリーおよびFlowSOM: マウスPMNの表現型解析には、LY6G (lymphocyte antigen 6 complex locus G)、LY6C、CD11B、CD45、SIGLEC-F、CD177、iNOS、S100A9、sXBPS1、CD36、CD14、TREM1、CD49dを含む蛍光抗体パネルを用いた。FlowSOMアルゴリズムを適用し、高次元単一細胞データの処理と解析により、特定のマーカー組み合わせを持つ新規サブポピュレーションを同定した。
質量分析 (CyTOF): ヒトPMNの不均一性を評価するため、CyTOFを用いた。CD15およびCD66bマーカーでPMNをゲーティングし、CD11b、CD33、Arg1、Nos2、S100A9、Lox1、pSTAT3、p38、pSTAT1を含む抗体カクテルで多次元表現型解析を行った。
機能解析: T細胞抑制アッセイでは、PMN-MDSC (CD45+ CD11b+ Ly6G+ Ly6C(low) CD14-/int/high) を、Pmel Tgマウス由来の脾細胞と抗原特異的CD8+ T細胞増殖抑制アッセイで共培養した。増殖は[3H]チミジン取り込みまたはCellTrace希釈法で測定した。
in vitro PMN分化誘導: 骨髄由来PMNを、腫瘍摘出上清 (TES)、GM-CSF、または低酸素 (0.5% O2) 条件下で24時間培養し、CD14発現誘導を評価した。GM-CSF中和抗体を用いた実験も実施した。
遺伝子発現解析: 定量リアルタイムPCR (qPCR) を用いて、Arg1、Nos2、Ptgs2、Slc27a2などの免疫抑制関連遺伝子の発現を測定した。バルクRNAシーケンスデータは、Langmead et al. NatMethods 2012でアラインメントし、Li et al. BMCBioinformatics 2011でリードカウントを推定した。Love et al. GenomeBiol 2014を用いて差次発現遺伝子を同定し、FDR <5%を統計的有意性の閾値とした。Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ソフトウェアを用いて、差次発現遺伝子の経路解析および上流レギュレーター解析を行った。
臨床予後解析: Moffitt肺癌データセットおよびTCGAデータセットを用いて、腫瘍PMN-MDSC遺伝子シグネチャーと患者の全生存期間との関連を評価した。ハザード比 (HR) およびp値を算出し、T細胞浸潤腫瘍の遺伝子発現プロファイルを持つ患者群における予後予測能も解析した。統計解析には、二群間の比較にはStudent’s t検定、多群間の比較には一元配置分散分析 (ANOVA) を多重比較補正 (Kruskal-WallisまたはTukey検定) とともに用いた。