- 著者: Daniela Cerezo-Wallis, Andrea Rubio-Ponce, Mathis Richter, Emanuele Pitino, Immanuel Kwok, Giovanni Marteletto, Ana Cristina Guanolema-Coba, Changming Shih, Run-Kai Huang, Ana Moraga, Natalia Borbaran Bravo, Samuel Doré, Sergio Callejas, David G. Aragonés, Daniel Jiménez-Carretero, Daniel Martin, Samuel Ovadia, Tommaso Vicanolo, Georgiana Crainiciuc, Jon Sicilia, Tong Deng, Anjelica Martin, Jing Zhang, Maria Isabel Cuartero, Diego Moncada Giraldo, Alicia Garcia-Culebras, Alejandra Aroca-Crevillen, Sandra Martín-Salamanca, Carlos Torroja, Max Ruiz, Irene Ruano, Melissa S. F. Ng, Jian Hou, You Wang, Ming Zhang, Jun Pu, Ana Herruzo, David Chang van Oordt, Seokyoon Chang, Alexander E. Downie, Fei Chen, Andrea L. Graham, William C. Gause, Pierre O. Fiset, Jonathan D. Spicer, Holger Heyn, Maria A. Zuriaga, Juan A. Bernal, Irina A. Udalova, Maria A. Moro, Katrien de Bock, Ana Dopazo, Jose J. Fuster, Fátima Sánchez-Cabo, Juan C. Nieto, Gabriel F. Calvo, Julia Skokowa, Oliver Soehnlein, Daniela F. Quail, Logan A. Walsh, Lai Guan Ng, Andrés Hidalgo, Iván Ballesteros
- Corresponding author: Lai Guan Ng (Shanghai Immune Therapy Institute, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Affiliated Renji Hospital, Shanghai, China; School of Medicine, Westlake University, Hangzhou, China), Andrés Hidalgo (Vascular Biology and Therapeutics Program and Department of Immunobiology, Yale University, New Haven, CT, USA; Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III, Madrid, Spain), Iván Ballesteros (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III, Madrid, Spain; Department of Neuroscience and Biomedical Sciences, Universidad Carlos III de Madrid, Madrid, Spain)
- 雑誌: Nature
- 発行年: 2026
- Epub日: 2025-06-18
- Article種別: Original Article
- PMID: 41339555
背景
好中球は全白血球の最大集団を構成する自然免疫の主役であり、過去10年間の研究でその転写的多様性が多数報告されてきたが、好中球コンパートメントの大局的アーキテクチャ、すなわち状態の数、相互関係、および制御メカニズムは未解明のままであった。先行研究では、骨髄、脾臓、血液、炎症組織からの好中球の直線的軌道が報告され、疾患による顆粒球産生の能動的再プログラミングが示唆されていた Ng et al. NatRevImmunol 2019。また、別の先行研究では、定常状態および感染症における好中球の単一細胞トランスクリプトームプロファイリングが行われ、好中球の不均一性が示されていた Xie et al. NatImmunol 2020。さらに、腫瘍微小環境における好中球の運命決定因子に関する既報も存在した Ballesteros et al. Cell 2020。
しかし、これらのプロファイルが好中球の転写的多様性全体を網羅している可能性は低く、包括的な参照地図が不足していた。哺乳類組織に存在する、あるいは侵入する微小環境、感染因子、悪性細胞の多様性、好中球の転写可塑性、および健常状態や疾患状態において既に特定されている多数の機能状態を考慮すると、好中球が獲得しうる実際の状態数や、それらが互いにどのように関連しているかという根本的な疑問に対する理解が不足していた。具体的には、疾患によって再プログラミングされる特定の分化段階、そして生体組織における好中球の多様性を指示するシグナル伝達および転写プログラムに関する知識ギャップが残されていた。例えば、TGFβ (transforming growth factor-beta)、IFNβ (interferon-beta)、GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) といった主要サイトカインが好中球の機能的多様化を独立に制御するかどうか、転写因子である JUNB (JunB proto-oncogene) が腫瘍微小環境での好中球機能を決定するかどうかも不明であった。また、血中好中球が全身疾患状態の「液体生検」的指標となりうるかも未検討であった。好中球の短い寿命と技術的扱いにくさが、状態横断的な機能分類を妨げてきたという背景もある。これらの知識ギャップが、好中球の機能分類、生理学的関連性、および臨床的価値の理解を阻害していた。本研究は、好中球コンパートメントの全体的なアーキテクチャを理解することが、これらの未解明な点に洞察を与え、この膨大な数の細胞を治療的味方へと転換させることを促進すると仮定した。
目的
本研究の目的は、多様な疾患条件にわたる好中球の単一細胞RNAシーケンス (scRNA-seq) データを統合してグローバルマップ「NeuMap」を構築し、好中球コンパートメントの機能的アーキテクチャ (機能ハブ、軌道、転写因子、サイトカイン制御) を体系的に解明することである。具体的には、好中球が獲得しうる転写および機能状態の数を特定し、これらの表現型状態が互いにどのように関連しているかを明らかにする。また、TGFβ、IFNβ、GM-CSFといった主要サイトカインが好中球の異なる軌道を独立して駆動するかどうかを検証し、転写因子JUNBが血管新生および免疫抑制状態を制御する役割を評価する。さらに、血中好中球のプロファイリングによって宿主の病態生理学的状態を推測できる「診断バーコード」の概念を実証し、好中球生物学の探索と活用への新たな枠組みを確立することを目指す。
結果
NeuMap：47条件・129,829細胞から構築した7機能ハブの好中球参照地図: 47の疾患・処置条件から収集した129,829個のマウス好中球を統合解析したNeuMapは、単一の連続したトポロジー構造を示し、7つの機能ハブとして構成された (Fig. 1)。これらのハブは、(1) PreNeu-like (Ki67+ Ltf+、増殖・顆粒合成)、(2) 未熟ハブ (Mmp8+ Cebpe+)、(3) 免疫沈黙ハブ (Cd52+、低mRNA含量、血中優勢)、(4) IFN応答ハブ (Ifit1+ Cd274+、抗ウイルス)、(5) IS-I (immunosuppression I) ハブ (Cd14+ Ptgs2+、腸・肝・肺の定常状態)、(6) IS-II (immunosuppression II) ハブ (Vegfa+ Cd274+、腫瘍環境優勢)、(7) 抗原提示ハブ (H2+ Cd74+、MHC-II発現) であった。各ハブは性別、飼育環境、遺伝的背景 (Balb/c)、Tet2変異クローン造血でも保存されており、健常状態の好中球がNeuMapの骨格を形成し、炎症・腫瘍条件がその末梢に拡張する構造が示された。Cd14+ Ptgs2+ IS-Iハブの好中球は腸、肝、肺に優勢で、HCC (hepatocellular carcinoma)、肺がんではIS-IとIS-IIが優勢であった。免疫沈黙ハブは健常血液中に最も豊富であり、IS-IIは健常組織ではほぼ欠如していた。ヒト好中球scRNA-seq (6条件) では6ハブが同定され、特にヒトハブ6がマウスIS-IIと抗原提示ハブの特徴を合わせ持ち、ヒト肺・腫瘍組織で濃縮されていた。
TGFβ・IFNβ・GM-CSFが独立した機能的軌道を制御する三軌道モデル: 86種サイトカインのin silicoスクリーニングと骨髄好中球の直接刺激実験から、TGFβが成熟 (CD101hi LY6Ghi) 軌道、IFNβが炎症/感染 (PD-L1hi CD14low CX3CR1hi) 軌道、GM-CSFががん関連 (CD101low PD-L1hi CD14hi dcTRAIL-R1hi MHC-II+) 軌道にそれぞれ独立してドライブすることが確認された (Fig. 4)。Tgfbr△Nマウスでは骨髄での成熟遅延、Ifnar△Nマウスでは血中IFN応答ハブの消失、Csf2r△N担がんマウスではIS-IIハブへのシフト消失が確認され (各群 n=3 mice、one-way ANOVA with Dunnett’s test)、三種類のサイトカインがin vivoでもNeuMapの対応する軌道を独立に制御することが証明された。骨髄好中球での21マーカーパネル機能評価では、TGFβが遊走・免疫抑制を中程度に増強し、IFNβが遊走を抑制しつつ食作用とNETs (neutrophil extracellular traps) 形成を活性化 (抗微生物プログラム)、GM-CSFが遊走抑制と食作用・免疫抑制・血管新生を増強することが定量化された。また、GM-CSF・APRILがIS-IIハブに、IL-1β・IL-1α・TNFがIS-I/IS-II中間領域に好中球を誘導し (in silicoスクリーニング、p=0.0042、p=0.0404)、血管新生はGM-CSFおよびIL-1β処置で約2-3倍増加することがMatrigel assayで示された。
JUNBがIS-I/IS-IIハブを制御し腫瘍血管新生・増殖を調節: Dogma-seq (scATAC+scRNA同時解析) のゲノムワイドモチーフ解析でIS-IハブにAP-1/SMAD/NF-κBモチーフが濃縮されることが示され、JUNBがIS-I/IS-IIハブの特徴的遺伝子座に結合することが確認された (Fig. 2)。Junb△N (好中球特異的KO、MRP8Cre; Junbfl/fl) マウスでは、肺・肝好中球のNeuMap上でのIS-I/IS-IIハブへのシフトが著明に低下した。Junb△Nマウスではin vitroでのT細胞抑制能とin vivo Matrigel血管新生能が消失した。皮下LLC担がんJunb△Nマウスでは腫瘍内CD14、Sca1、PD-L1発現が低下し、内皮細胞増殖の抑制とT細胞浸潤の増加を伴い、腫瘍増殖が有意に抑制された。後肢虚血モデルでは14-18日間の血流回復がJunb△Nマウスで有意に障害され (n=7-9 mice/群、two-way ANOVA with Tukey correction)、AP-1が組織再生的好中球機能の制御因子であることが複数モデルで確認された。iLy6G-tdTomato時間標識実験 (24h→36h→72h追跡) では、健常マウスではday 3にIFN応答ハブ方向が優先され、腫瘍マウスではIS-I→IS-IIへの軌道が認められ、炎症マウスでは免疫沈黙ハブへの移行が優先されることが示された (Fig. 3)。HOXB8 CRISPR実験では、Cebpb/Rfx2/Runx1が成熟・極性化に、Irf5が感染/炎症表現型に、Relbががん/免疫抑制表現型 (GM-CSF応答) に必要であることが同定された。
血中好中球バーコードで18条件が識別可能: 18疾患・生理条件の血中好中球のscRNA-seqを実施し、完全なNeuMapへの投影によって血中好中球のみのUMAPと比較して各条件の転写的分離が著明に向上することが確認された (Fig. 5)。NeuMapの10の「診断領域」上でのBhattacharyya指数を組み合わせた「バーコード」分析により、若齢vs老齢マウス、妊娠マウス、Apoe-/-アテローム硬化モデル、早期がんマウスの識別が可能であった。がん種間でもIS-I/IS-IIハブ比率が異なり、肝臓炎症の活動期vs寛解期の識別も可能であった。
ヒト好中球との種間保存性: ヒト好中球10組織のscRNA-seqでは6つのヒトハブ (H1-H6) が同定され、マウスの7ハブとの対応関係が示された。ヒト肺腺がん12検体の空間トランスクリプトミクス (FFPE切片) では腫瘍境界部でIS-II・抗原提示ハブ好中球が濃縮し、隣接健常組織ではIS-Iハブが優勢であるという空間的分布パターンが確認された (n=8 patients、Kruskal-Wallis p<0.001 全ハブ) (Fig. 5)。ヒトCD34+前駆細胞由来好中球のIFNβ・GM-CSF刺激でもマウスと強く一致した応答が確認された。ヒト肺腺がん空間データの近傍解析では、各ハブの好中球が異なる細胞系列 (T細胞、マクロファージ、線維芽細胞) と関連していることが示された。
考察/結論
本研究は、好中球コンパートメントが7つの機能ハブとして構成される体系的アーキテクチャを初めて提示した。この「有限の転写状態の集合体」という概念は、多様な組織・疾患において報告されてきた好中球の多彩な表現型が本質的には7つのハブに収束することを意味し、見かけ上の多様性と機能的収斂という重要な洞察を与える。NeuMapの連続したトポロジー構造 (明確な分枝や孤立クラスターを持たない単一の連続構造) は、好中球の短い寿命と骨髄からの絶え間ない補充を反映しており、ほとんどの転写プログラムが造血プログラムから持続的にアクセス可能であることを示唆する。
先行研究との違い: 従来の好中球研究は、TGFβによるN1→N2的二極化に焦点を当てていたが Fridlender et al. CancerCell 2009、本研究はその枠組みを7ハブへと大幅に拡張し、各ハブが臨床的に識別可能な機能的アイデンティティを持つことを示した。このトポロジー構造は、好中球が特定の組織環境に同調して機能的に再プログラミングされるという従来の直線的モデルと対照的であり、より動的で多方向への分化能を維持していることを示している。
新規性: 本研究で初めて、TGFβ、IFNβ、GM-CSFが独立した軌道を制御するという三軌道モデルを新規に同定した。これは、好中球の機能的多様化を駆動する主要なシグナル伝達経路を明らかにするものであり、これまで報告されていない知見である。また、転写因子JUNBがIS-I/IS-IIハブを制御し、腫瘍血管新生と増殖を調節するというメカニズムも新規に実証された。さらに、血中好中球プロファイルから18種類の病態生理学的状態を識別できる「診断バーコード」の概念も本研究で初めて提示された。
臨床応用: TGFβ、IFNβ、GM-CSFが独立した軌道を制御するという三軌道モデルは、治療標的の精密な選択に直接的な指針を与える。例えば、腫瘍免疫抑制環境ではGM-CSF→Csf2r→IS-IIハブの遮断がより有効であり、ウイルス感染後の好中球関連病態ではIFNβ/Ifnar経路が主要標的となる可能性が示唆される。JUNBによるIS-I/IS-IIハブの制御は、特定の転写因子を標的とした好中球再プログラミングの概念実証を与えるものであり、IS-II好中球のVEGFA産生が腫瘍血管新生の主要ドライバーであること、JUNBノックアウトで腫瘍増殖が抑制されることは、好中球のIS-IIハブ誘導を選択的に遮断することが抗腫瘍戦略として臨床応用可能である可能性を示す。血中好中球バーコードによる18条件の識別は、液体生検の新たな戦略として重要であり、特にがん種間での血中好中球ハブ比率の差異は、既存のcfDNA・CTCとは独立したバイオマーカーとなりうる可能性を示す。
残された課題: 今後の検討課題として、アレルギー、自己免疫、粘膜炎症、老化など未カバーの疾患条件のNeuMapへの統合が残されている。また、IS-I/IS-IIハブの細胞内詳細機能機序 (IS-Iはどの免疫抑制分子を主に使うか)、マウス-ヒト対応ハブ間のシグナル経路の差異解明、およびNeuMapを活用したヒト臨床検体での前向きバイオマーカー研究の実施などが残されている。本研究は、分析された病態生理学的条件の数が比較的少ないというlimitationがある。さらに、ここで探索されていない他のシグナル (サイトカイン、ケモカイン、シグナル伝達脂質、代謝物、機械的刺激など) や他の転写調節因子も好中球の特異化に寄与している可能性が高い。
方法
C57BL/6Jマウスの骨髄および13臓器から、47の疾患・処置条件 (感染、炎症、がん、遺伝子改変マウスなど) にわたるCD11b+ LY6G+ (lymphocyte antigen 6 complex locus G6D) 細胞および系統陰性細胞を収集し、BD Rhapsodyプラットフォームを用いて129,829細胞のscRNA-seqを実施した。このデータを用いてNeuMap参照地図を構築した。NeuMapの構築には、Seuratパッケージ (v.4.0.5) を用いたデータ統合と次元削減技術が用いられた Hao et al. Cell 2021。グラフベースクラスタリングと機能シグネチャスコアリングにより、7つの機能ハブを定義した。
サイトカインの好中球誘導能を評価するため、86種類のサイトカインで処理されたリンパ節白血球データセットのin silicoスクリーニングを実施した。その後、骨髄好中球を8種類のサイトカイン (TGFβ、IFNβ、GM-CSF、IL-1α/β、TNF、IFNγなど) で24時間または48時間処理し、21マーカーのカスタムパネルを用いたフローサイトメトリーで5つの表現型状態に分類した。これらの表現型変化がNeuMap上の転写状態と一致するかは、scRNA-seqとNeuMapへの投影によって検証された。
転写因子JUNBの役割を検証するため、好中球特異的Junb条件付きノックアウトマウス (MRP8Cre; Junbfl/fl: Junb△N、ここでMRP8Creはmyeloid-related protein 8-Creを示す) を作製し、肺および肝好中球のNeuMap上の分布変化、in vitroでのT細胞抑制能、in vivoでのMatrigel血管新生能、および皮下LLC (Lewis lung carcinoma) 担癌モデルにおける腫瘍増殖への影響を評価した。後肢虚血モデルも用い、JUNB欠損マウスにおける血流回復の障害をLDPI (laser Doppler perfusion imaging) で評価した (n=7-9 mice/群、統計解析には two-way ANOVA with Tukey correction を使用)。
サイトカイン受容体のin vivoでの役割を確認するため、Tgfbr△N、Ifnar△N、Csf2r△Nマウスの骨髄、血液、LLC腫瘍からの好中球のscRNA-seqを実施し、NeuMap上の分布変化を解析した (各群 n=3 mice、統計解析には one-way ANOVA with Dunnett’s test を使用)。
好中球の動態を追跡するため、iLy6G-tdTomatoマウスを用いて骨髄好中球を時間的に標識し、24、36、72時間後の末梢組織における軌道トラッキングを実施した。RNA速度解析 (RNA velocity analysis) を用いて、健常、がん、炎症条件下での好中球の転写軌道を推測した LaManno et al. Nature 2018。
ヒト好中球との種間保存性を検証するため、10組織、6疾患条件からのヒト好中球scRNA-seqデータ (健常者、大腸がん、全身性エリテマトーデス患者検体) を解析した。さらに、12検体のヒト肺腺がん組織の空間トランスクリプトミクス (FFPE切片) を実施し、NeuMapハブと腫瘍微小解剖学的位置の関係を解析した (n=8 patients、統計解析には Kruskal-Wallis p<0.001 を使用)。
血中好中球による疾患状態推定の可能性を評価するため、18の疾患・生理条件 (若齢、老齢、妊娠、アテローム硬化、感染、複数がん種、肝臓炎症など) の血中好中球のscRNA-seqを実施した。これらの好中球をNeuMapに投影し、NeuMap上の10の「診断領域」におけるBhattacharyya指数を用いて「診断バーコード」を生成し、各条件の識別能を評価した。