- 著者: The Cancer Genome Atlas Network
- Corresponding author: Ian R. Watson / Jeffrey E. Gershenwald / Lynda Chin (MD Anderson Cancer Center)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2015
- Epub日: 2015-06-18
- Article種別: Original Article
- PMID: 26091043
背景
皮膚メラノーマは、早期に診断され外科的に切除されれば治癒の可能性があるが、地域転移や遠隔転移を伴う症例の予後は依然として不良である。歴史的に、遠隔転移を有する患者の生存率は低く、従来の化学療法に対する反応も稀であった。近年、BRAF V600変異（全メラノーマの 35%–50%）およびNRAS Q61変異（10%–25%）を標的としたMAPK (mitogen-activated protein kinase) 経路阻害薬であるvemurafenib、dabrafenib、trametinibなどがFDA (Food and Drug Administration) の承認を得て、劇的な腫瘍退縮が報告されるようになった。
次世代シーケンシング (NGS) を用いた研究により、BRAFやNRAS以外の追加的な遺伝子異常が報告され（TCGA et al. Nature 2012、Topalian et al. NEnglJMed 2012、Lawrence et al. Nature 2013）、メラノーマの生物学的異質性への理解は深まった。しかし、大規模コホートにおいてDNA、RNA、タンパク質レベルの多プラットフォーム統合解析を実施した研究は未だ存在せず、遺伝子異常の網羅的なカタログ化と、その潜在的な生物学的および臨床的意義の記述は不十分であった。既存の研究は、単一のハイスループットプラットフォームを用いた大規模サンプルセットの解析か、あるいは少数のサンプルに対する多プラットフォーム解析のいずれかに限定されており、臨床病理学的に詳細な注釈が付与された大規模コホートにおける統合データの解析という knowledge gap が残されていた。特に、免疫チェックポイント阻害薬などの免疫療法における最近の進歩に関連して、予後と治療反応性に影響を与えるゲノムおよびトランスクリプトームに基づく分類フレームワークの確立が課題となっていた。このような情報の不足を解消するため、The Cancer Genome Atlas (TCGA) プログラムは、皮膚メラノーマに対する最大規模の包括的分子解析を実施し、体細胞異常のカタログ作成とその臨床的意義の解明を目的とした。
目的
本研究の目的は、331例の原発性および転移性皮膚メラノーマを対象に、DNA、RNA、タンパク質レベルでの網羅的な分子プロファイリングを実施し、体細胞異常の包括的なカタログを作成することである。具体的には、最も頻繁に認められる有意に変異している遺伝子 (SMG: Significantly Mutated Genes) のパターンに基づき、BRAF変異型、RAS変異型、NF1 (neurofibromin 1) 変異型、およびTriple-WT (Triple wild-type) の4つのサブタイプからなるゲノム分類フレームワークを確立する。この分類フレームワークを用いて、各サブタイプにおけるシグナル伝達経路の活性化状態やコピー数変化の差異を明らかにし、治療標的の選択に寄与する分子基盤を同定する。さらに、転写産物レベルでのサブクラス分類を行い、特に免疫遺伝子発現、病理学的なリンパ球浸潤、およびT細胞マーカーであるLCK (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase) タンパク質発現が、患者の生存期間の改善とどのように関連するかを多次元解析により検証し、個別化医療および免疫療法の適応判断に資する知見を得ることを目指す。
結果
超高頻度の変異ランドスケープとUVシグネチャ: WES (Whole-Exome Sequencing) 解析により、318 patients から合計 228,987 個の体細胞変異（SNVおよびindels）が同定された。平均変異率は 16.8 mutations/Mb であり、これは当時TCGAで解析された全癌種の中で最高値であった (Lawrence et al. Nature 2013)。紫外線 (UV) 照射に特徴的なDNA損傷シグネチャの解析では、ジピリミジン部位における C>T 転換が中央値 77.7% (IQR 69.4%–82.6%)、CC>TT 二塩基変異が中央値 3.9% (IQR 2.0%–5.7%) を占めていた (Fig S1A)。UVシグネチャ（C>T転換 >60% または CC>TT変異 >5%）の保有率は、原発腫瘍の 76% (44/58 samples) および転移腫瘍の 84% (221/262 samples) で認められた。MutSig および InVEx アルゴリズムにより、42個の有意に変異している遺伝子 (SMG: Q < 0.1) が同定され、既知の BRAF, NRAS, CDKN2A, TP53, PTEN に加え、RAC1 (6.9%)、IDH1 (6.2%)、MAP2K1、PPP6C、ARID2、NF1、RB1、および新規候補として DDX3X が同定された (Fig 1A)。
4つのゲノムサブタイプ分類フレームワークの確立: WES データを有する 318 cases を対象に、主要なドライバー変異に基づくゲノム分類を実施した (Fig 1A)。BRAF サブタイプ (52%, n=166) では、V600E (n=124)、V600K (n=18)、V600R (n=3)、K601変異 (n=5) が認められた。RAS サブタイプ (28%, n=88) は主に NRAS 変異（Q61R n=35, Q61K n=28, Q61L n=11, Q61H n=4, G12/13変異 n=7）であり、HRAS (n=4) および KRAS (n=3) の hot-spot 変異も含まれていた。NF1 サブタイプ (14%, n=28) では、変異の 50% 以上が機能喪失型 (LoF) であり (InVEx LoF analysis: p=1.8e-11, Q=9.1e-12)、変異率は 39 mutations/Mb と全サブタイプ中で最高値を示した。Triple-WT サブタイプ (14%, n=46) は BRAF/RAS/NF1 のいずれの hot-spot 変異も持たない群であり、UVシグネチャ保有率は 30% (14/46 samples) と有意に低かった (p=1e-15)。Triple-WT では 4q12 焦点増幅に KIT オンコジーンが有意に濃縮されており (Fig 2A)、複雑な構造再編成が 38% (45/117 samples) に認められた。
サブタイプ間におけるシグナル伝達経路の活性化差異: RPPA (Reverse-Phase Protein Array) 解析（n=202 samples）により、各サブタイプのタンパク質発現・リン酸化状態を比較した。phospho-MEK1/2 (S217/S221) は BRAF および RAS 変異サブタイプで有意に上昇していた (Fig 3A)。一方で、下流の phospho-ERK1/2 (T202/Y204) は RAS 変異サブタイプにおいて最高値を示した (Fig 3B)。KIT タンパク発現量は Triple-WT サブタイプで最高であり (Fig 3C)、NF1 変異サブタイプでは CRAF 発現量が最高であった (Fig 3D)。また、Triple-WT では抗アポトーシスタンパク質 BCL-2 が最高値を示し (Fig 3E)、BRAF サブタイプではインスリンシグナル制御因子 IGFBP2 が最高発現を示した (Fig 3F)。これらのタンパク質発現の差異は、各サブタイプが異なるシグナル伝達経路の依存性を有することを a 2-fold 以上の差を伴って示唆している。
転写産物サブクラスと免疫浸潤の予後的意義: mRNA 発現データ (n=329 samples) の非教師ありクラスタリングにより、3つの転写産物サブクラスを同定した (Fig 5A)。Immune subclass (n=168, 51%) は T細胞、B細胞、NK細胞マーカーおよび免疫チェックポイント分子関連遺伝子が高発現しており、地域転移メラノーマにおいて post-accession survival が他 2 クラスターより有意に良好であった (log-rank p=0.003) (Fig 5B)。Keratin subclass (n=102, 31%) はケラチンや上皮関連遺伝子が高発現し、地域転移例では予後が有意に不良であった (log-rank p=0.0007)。MITF-low subclass (n=59, 18%) は MITF 標的遺伝子が低発現であった。病理学的リンパ球浸潤スコア (LScore) が高い症例は生存期間が有意に良好であり (log-rank p < 0.001) (Fig 5D)、免疫遺伝子発現高値、高 LScore、高 LCK タンパク質発現の三重一致群は、極めて良好な予後を示した (log-rank p=8.0e-6)。
コピー数変化とシグナル経路の統合解析: GISTIC2 解析により、RAS-MAPK-AKT 経路が全体の 91% の症例で遺伝子変化を被っていることが判明した (Fig 4A)。PTEN の変異・欠失は BRAF 変異サブタイプで高頻度であったが、AKT3 の増幅および mRNA 高発現は RAS、NF1、Triple-WT サブタイプで有意に濃縮されていた (p < 0.05) (Fig 4B)。TERT プロモーター変異 (C228T および C250T) は 115 samples の解析で、それぞれ 23.5% (27/115) および 40.9% (47/115) に認められた。これらの変異は BRAF (75.0%, 39/52)、RAS (71.9%, 23/32)、NF1 (83.3%, 10/12) サブタイプで高頻度であったが、Triple-WT では 6.7% (1/15) に留まり、有意な差が認められた (p=8e-5)。
免疫浸潤と LCK 発現による予後予測モデル: 地域転移メラノーマ患者において、LScore と LCK タンパク質発現を組み合わせた二変数モデルを検証した。高 LScore かつ高 LCK 発現を示す群は、低 LScore かつ低 LCK 発現を示す群と比較して、生存期間が有意に改善していた (log-rank p=7.9e-5, HR=5.5) (Fig S6D)。多変量 Cox 比例ハザード回帰分析 (Multivariable Cox proportional hazard regression) により、LScore と LCK 発現はそれぞれ独立した予測値を持つことが示された (Fig S6E)。また、Immune サブクラスでは PD-1 および PD-L1 の発現が、他の 2 つのクラスターと比較して有意に高かった (ANOVA p < 10^-3) (Fig S6F)。
考察/結論
本研究は、皮膚メラノーマの最大規模の統合多プラットフォーム解析を通じて、BRAF、RAS、NF1、Triple-WT の 4 つのゲノムサブタイプからなる分類フレームワークを確立した。
先行研究との違い: 従来のメラノーマ研究は、BRAF や NRAS といった単一のドライバー遺伝子変異に焦点が当てられることが多かったが、本研究は多次元的なゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームデータを統合し、包括的なサブタイプ分類を定義した点でこれまでと異なる。特に、Triple-WT サブタイプにおいて KIT 変異や 4q12 焦点増幅、および複雑な構造再編成が有意に濃縮されていることは、単一遺伝子解析では見落とされていた重要な生物学的特徴である。
新規性: 本研究で初めて、NF1 変異サブタイプが他のサブタイプと比較して 2 倍以上の極めて高い変異率 (39 mutations/Mb) を持つことを新規に同定した。また、Triple-WT サブタイプにおいて UV シグネチャの保有率が著しく低いこと (30%) や、複雑な構造再編成が有意に濃縮されていること (38%) を示した。これは、Triple-WT サブタイプが UV 以外の異なる変異プロセスによって駆動されている可能性を示唆する新規の発見である。さらに、病理学的な LScore と LCK タンパク質発現を組み合わせた二変数モデルが、単一の指標よりも強力な予後予測因子となることを実証した。
臨床応用: 本分類は、個別化された治療戦略の選択に直結する臨床的意義を持つ。具体的には、(1) BRAF 野生型かつ NF1 変異を有するメラノーマへの MEK/ERK 阻害薬の適用、(2) NF1 変異と ARID2 変異の高い共存頻度 (38.7%) に基づくクロマチン修飾因子を標的とした合成致死アプローチ、(3) RAS 変異サブタイプと PPP6C 変異の共存に基づく Aurora kinase 阻害薬との組み合わせ、(4) Triple-WT サブタイプにおける KIT 変異・増幅に対する imatinib や dasatinib の適用、(5) BRAF 変異型における PD-L1 (CD274) 焦点増幅をバイオマーカーとした PD-1/PD-L1 阻害薬の適応判断などが考えられる。
残された課題: 今後の検討課題として、同定された新規 SMG (例: DDX3X, MRPS31, RPS27) の機能的役割と発がんへの寄与を詳細に解析する必要がある。また、Triple-WT サブタイプにおける複雑な構造再編成がどのように悪性表現型を駆動するのか、その詳細なメカニズムの解明が求められる。Limitation として、本研究のデータは免疫サブタイプが免疫療法に反応する集団であることを直接的に証明するものではないため、実際の免疫チェックポイント阻害薬に対する治療反応性と、同定した免疫シグネチャとの相関を大規模な臨床試験で検証することが今後の重要な方向性である。
方法
331 人の患者から得られた 333 検体 (原発 67 例, 転移 266 例 [うちリンパ節転移 160 例, 皮膚/軟部組織転移 52 例, 遠隔転移 35 例]) を対象に、以下の 6 種類の分子解析を実施した。
- WES (Whole-Exome Sequencing): 320 samples で実施され、平均 exon coverage は 87 倍であった。これにより、アレル頻度 0.3 の SNV (一塩基バリアント) を検出力 80% で検出可能とした (Carter et al. NatBiotechnol 2012)。
- SNP 6.0 array: 333 samples で DNA コピー数プロファイリングを実施した。
- mRNA-seq: 331 samples で mRNA シーケンスを実施した。
- miRNA-seq: 323 samples で miRNA シーケンスを実施した。
- DNA メチル化プロファイリング: 333 samples で実施した。
- RPPA (Reverse-Phase Protein Array): 202 samples で 181 種類の癌関連タンパク質およびリン酸化タンパク質の発現プロファイリングを実施した。
全 6 プラットフォームの完全データが利用可能なコアセットは 199 samples であった。サブセットとして、TERT (telomerase reverse transcriptase) プロモーター変異 (115 samples, PCR-Sanger 法)、深部 WGS (Whole-Genome Sequencing)、low-pass WGS も実施された。有意変異遺伝子 (SMG) の同定には、MutSig と InVEx の 2 つのアルゴリズムを使用し (Q < 0.1)、455 個の SNV について 277 samples で 96% の独立バリデーションを実施した。転写産物クラスタリングは、上位 1,500 個の可変遺伝子による consensus hierarchical clustering (329 samples) を用いた。多次元統合には iCluster アルゴリズムを使用した。
統計解析および検証: 生存解析には log-rank 検定および Cox regression モデルが用いられた。タンパク質発現レベルの比較には、ノンパラメトリック検定である Mann-Whitney U test および Kruskal-Wallis 検定が用いられ、多重比較には Kruskal Nemenyi 事後検定が適用された。コピー数変化の解析には GISTIC2.0 が用いられた。また、2群間の比較において Fisher’s exact test が適用された。本研究では、特定の細胞株 (例: A549, H1299) やマウス系統 (例: C57BL/6J, BALB/c) を用いた直接的な in vitro/in vivo 実験は実施されていないが、公的データベースの統合解析により、各ゲノムサブタイプにおける生物学的特徴を多角的にプロファイリングした。