- 著者: Zhan Yao, Rona Yaeger, Vanessa S. Rodrik-Outmezguine, Anthony Tao, Neilawattie M. Torres, Matthew T. Chang, Matthias Drosten, Huiyong Zhao, Fabiola Cecchi, Todd Hembrough, Judith Michels, Hervé Baumert, Linde Miles, Naomi M. Campbell, Elisa de Stanchina, David B. Solit, Mariano Barbacid, Barry S. Taylor, Neal Rosen
- Corresponding author: Neal Rosen (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York)
- 雑誌: Nature
- 発行年: 2017
- Epub日: 2017-08-10
- Article種別: Original Article
- PMID: 28783719
背景
ヒト癌において約200種のBRAF変異アレルが同定されており、その中でもV600E変異は最もよく知られた活性型モノマー変異であり、vemurafenibやdabrafenibといったRAF阻害薬に感受性を示すことが報告されている。しかし、非V600 BRAF変異、例えばK601E、L597V、G469Aなどの活性化ダイマー型変異や、G466V/E、D594N/G、G596Rなどのキナーゼ活性が野生型以下である「低活性/キナーゼ不活性」変異が、非小細胞肺癌（NSCLC）、大腸癌、メラノーマで高頻度に検出されることが先行研究で示されていた (Wan et al. 2004)。Maraisらの研究 (Garnett et al. 2005) は、BRAFキナーゼ不活性変異が逆説的にCRAFを活性化することを示唆していたが、これらのキナーゼ機能不全BRAF変異がどのようにERKシグナル伝達を駆動するのか、どのような共存する遺伝子異常を必要とするのか、そしてどの治療標的が有効であるのかについては、依然として未解明な点が多かった。特に、これらの低活性BRAF変異がRAS依存性を示すのか、またそのRAS活性化の源が何であるのかは、治療戦略を確立する上で重要な課題として残されていた。
Yao et al. (2015) は、BRAF変異を機能に基づいてクラス1（活性型モノマー）とクラス2（構成的ダイマー）に分類する枠組みを既に提唱していたが、キナーゼ活性が低下または欠損したBRAF変異の特性については、そのシグナル伝達機構、RAS依存性、および治療感受性に関してさらなる詳細な解析が不足していた。これらの変異は、V600Eのようなクラス1変異やK601Eのようなクラス2変異とは異なるシグナル伝達経路を介してERK経路を活性化する可能性が示唆されていたが、その具体的なメカニズムは確立されていなかった。また、これらの変異を有する腫瘍が、ERK依存性フィードバック阻害に対してどのように応答するのか、そしてその応答がRAS活性化にどのように影響するのかについても、詳細な解析が求められていた。Heidorn et al. (2010) は、キナーゼ不活性BRAF変異とRAS変異が協調して腫瘍増殖を促進することを示していたが、その詳細な分子メカニズムや治療的脆弱性についてはさらなる解明が必要であった。
本研究は、これらのキナーゼ機能不全BRAF変異が、既知のクラス1およびクラス2とは異なる第3の機能的クラス（クラス3）を構成するという仮説に基づき、その分子メカニズムと治療的脆弱性を明らかにすることを目的とした。特に、クラス3 BRAF変異がRAS-GTPと強く結合し、野生型CRAFの活性化を促進することでERKシグナル伝達を増幅するというモデルを提唱し、そのRAS依存性を実験的に検証する必要があった。さらに、これらの変異を有する腫瘍におけるRAS活性化の源が、腫瘍の種類（メラノーマ、NSCLC、大腸癌）によって異なる可能性があり、それに応じた治療戦略の確立が切望されていた。特に、RTKシグナルがRAS活性化を駆動する腫瘍において、RTK阻害薬が有効な治療選択肢となるかどうかの検証は、臨床応用への重要なステップであった。これらの課題を解決することで、BRAF変異を有する腫瘍に対するより個別化された治療戦略を開発するための知識ギャップを埋めることが期待された。
目的
本研究の目的は、(1) キナーゼ活性が低下または欠損したBRAF変異が、クラス1およびクラス2とは異なる第3のシグナル伝達機構（クラス3）を介してERK経路を活性化することを実証することである。具体的には、これらの変異がRAS-GTPとの結合を増強し、野生型CRAFの活性化を促進するメカニズムを分子レベルで解明する。 (2) クラス3 BRAF変異によるERKシグナル伝達がRAS依存性であることを、RAS-less細胞を用いた実験および血清飢餓・EGF刺激応答の解析を通じて確認する。 (3) クラス3 BRAF変異を有する腫瘍において、RAS活性化の源が腫瘍の種類によって異なることを解析する。特に、メラノーマにおけるRAS/NF1変異の共存と、NSCLCおよび大腸癌における受容体型チロシンキナーゼ（RTK）シグナル伝達の関与を明らかにする。 (4) RTK阻害薬が、RTKシグナルによってRASが活性化されるクラス3 BRAF変異腫瘍に対して治療効果を示すことを、前臨床モデル（細胞株および患者由来異種移植モデル（PDX））を用いて検証し、新たな治療戦略の可能性を提示する。
結果
クラス3 BRAFの定義とキナーゼ活性プロファイル: D594G/N、G466V/E、G596Rなどのキナーゼ機能不全またはキナーゼ不活性BRAF変異体は、in vitroキナーゼ活性が野生型BRAFよりも低いか、ほぼ消失していることが示された (Extended Data Fig. 1a, c)。これらの変異体を単独で発現させると、リン酸化MEK（p-MEK）およびサイクリンD1の上昇は、クラス1（V600E）やクラス2（K601E）変異体と比較して弱かった (Fig. 1a)。しかし、RAS-GTPおよびリン酸化CRAF（p-CRAF）は抑制されず、むしろ亢進している傾向が観察された。これは、これらの変異体がERKシグナル伝達を活性化するものの、その強度がRASを抑制するのに十分なフィードバック阻害を誘導しないためと考えられた。本研究では、これらの特性を持つBRAF変異をクラス3と定義した。
RAS依存性: HRAS/NRAS/KRAS三重ノックアウト「RAS-less」MEF細胞を用いた実験では、BRAF V600E、K601E、NRAS Q61KはMEK/ERK活性化をレスキューできたが、野生型BRAF、G466V/E、D594N/G BRAFはレスキューできなかった (Fig. 1d)。解析した31種のBRAF変異アレル中、16種のキナーゼ機能不全/キナーゼ不活性変異体は全てRAS依存性であると判定された (Table 1)。NIH3T3細胞において、血清飢餓によるMEK/ERK活性低下とEGF刺激による活性化という応答性は、野生型BRAFとクラス3 BRAF変異体（G466V/E、D594N/G）で維持されていたが、RAS非依存性のクラス1/2変異体では失われていた (Extended Data Fig. 1e)。これは、クラス3 BRAF変異がERKシグナル伝達を駆動するためには、上流のRAS活性化が必須であることを強く示唆する。
RAS-GTPと野生型CRAFへの結合増強: 共免疫沈降実験により、クラス3 BRAF変異体（D594G、G466V/E）は、野生型BRAFよりもRAS-GTPに対して高い親和性で結合し、野生型CRAFとヘテロダイマーを形成することが示された (Fig. 2a, Extended Data Fig. 2b)。この結合増強が、CRAFのRAS媒介性活性化を増幅し、結果としてMEK/ERKシグナル伝達全体を増強するメカニズムであることが示唆された。BRAFのR509H変異による二量体形成の阻害は、クラス3 BRAF変異によるp-MEKおよびp-ERKの誘導をほぼ完全に消失させたが、二量体非依存性のBRAF(V600E)には影響しなかった (Fig. 2b)。
ERKフィードバック解除による増幅: ERK阻害薬SCH772984（500 nM）を用いてERK媒介性ネガティブフィードバックを解除すると、RAS依存性BRAF（野生型およびクラス3）細胞ではRAS-GTPとp-MEKの両方が上昇した (Extended Data Fig. 1f)。しかし、RAS非依存性クラス1/2細胞ではRAS-GTPのみが上昇し、p-MEKは上昇しなかった。この結果は、クラス3 BRAFがERK出力を増強するためにはRAS活性の維持が必須であるものの、ERKフィードバックがRASを抑制することで自己制限的になることを示している。
共存遺伝子異常の癌種特異性: 24,000例の腫瘍コホート解析により、メラノーマではクラス3 BRAF変異がほぼ100%の症例でNF1欠失/変異またはRAS（NRAS/HRAS）変異と共存していることが明らかになった (Fig. 1e)。これは、RAS活性を維持するための遺伝学的補償が必要であることを示唆する。一方、NSCLCと大腸癌では、クラス3 BRAF変異とRAS/NF1異常の共存は稀であった (Fig. 1e, Extended Data Fig. 1h)。これらの腫瘍では、RTKシグナル伝達（EGFR、MET、FGFRなど）がRAS活性化の主要な源であると推測された (Extended Data Fig. 1i)。実際、クラス3 BRAF変異はNSCLCにおけるBRAF変異の最頻クラスであった (Extended Data Fig. 1g)。Network et al. Cell 2015でも、メラノーマにおけるBRAF変異の多様性が報告されている。
RTK阻害による治療効果（NSCLC/大腸癌）: H1666細胞（BRAF G466V NSCLC）は、EGFR阻害薬erlotinibによりERKシグナル伝達の抑制とアポトーシスの増加を示し、in vivo PDXモデルでは腫瘍縮小効果が観察された。KMS-11細胞（BRAF G466V）ではFGFR阻害薬が同様の効果を示した。大腸癌のクラス3 BRAFモデルでも、抗EGFR抗体（cetuximab/panitumumab）が有効性を示した (Fig. 4a, b, c, Extended Data Fig. 1j, k, n, o)。例えば、BRAF G466V変異を有する転移性大腸癌患者のPDXモデル（n=10 mice）では、cetuximab治療により腫瘍が完全に退縮した (Fig. 4b)。一方、BRAF G466EとHRAS Q61K変異を併せ持つメラノーマ細胞株SK-MEL-208では、RTK阻害は無効であり、MEK阻害が治療選択肢となることが示唆された (Extended Data Fig. 1j, k)。腎臓の集合管癌患者由来のPDXモデル（BRAF G466A変異, n=5 mice）では、METおよびEGFRの発現とリン酸化が高レベルで検出され、MET阻害薬INC280によりRAS活性化とERKシグナル伝達が抑制され、in vivoで腫瘍退縮が観察された (Fig. 4d, Extended Data Fig. 4b, c, d, e, f)。INC280とtrametinibの併用により、腫瘍は完全に退縮した (Fig. 4d)。
クラス3 BRAFのBRAF阻害薬不応性、MEK阻害薬の有効性: dabrafenibやvemurafenibといったRAF阻害薬はモノマー選択的であり、クラス2およびクラス3のBRAFダイマーを効果的に阻害できないため、クラス3 BRAF腫瘍には無効であった (Fig. 3b, c, Table 1)。例えば、H1666細胞（BRAF G466V）のvemurafenibに対するIC50は250 nM以上であり、感受性を示さなかった (Fig. 3b)。しかし、MEK阻害薬（trametinibなど）はクラス3 BRAF変異腫瘍の増殖を効果的に抑制した (Fig. 3a, Extended Data Fig. 3a, b)。H1666細胞のtrametinibに対するIC50は1.9 nMであった (Fig. 3a)。これらの結果から、クラス3 BRAF変異腫瘍に対しては、RTK阻害薬によるRAS活性化の阻害、またはMEK阻害薬が有効な治療戦略となることが示された。
考察/結論
本研究は、BRAF変異をその機能的メカニズムに基づいて3つの明確なクラスに分類した、BRAF生物学における画期的な研究である。これまでの研究では、BRAF変異は主にV600Eのような活性型変異に焦点が当てられていたが、本論文はキナーゼ活性が低下または欠損したBRAF変異（クラス3）の独自のシグナル伝達機構と治療的脆弱性を初めて詳細に解明した。
先行研究との違い: これまでの研究では、低活性BRAF変異がRAS非依存的にMEKリン酸化を触媒するという報告もあったが (Garnett et al. 2005)、本研究はクラス3 BRAF変異がRAS依存的にERKシグナル伝達を活性化することを明確に示した点で、先行研究と対照的な結果を提示した。また、クラス3 BRAF変異がRAS-GTPとより強く結合し、野生型CRAFとのヘテロダイマー形成を促進することでERKシグナルを増幅するというメカニズムは、これまで報告されていなかった新規の知見である。
新規性: 本研究で初めて、BRAF変異を以下の3つの機能的クラスに体系的に分類した。
- クラス1: 活性型モノマー（V600E、V600Kなど）。RAS非依存性であり、vemurafenibやdabrafenibなどのモノマー選択的RAF阻害薬に感受性を示す。
- クラス2: 構成的ダイマー（K601E、L597V、融合遺伝子など）。RAS非依存性であり、モノマー選択的RAF阻害薬には不応性を示すが、ダイマー活性型RAF阻害薬（LY3009120、belvarafenibなど）またはMEK阻害薬が必要となる。
- クラス3: キナーゼ機能不全/キナーゼ不活性（G466V/E、D594N/G、G596Rなど）。RAS依存性であり、BRAF阻害薬は無効である。RAS活性化の源を遮断する治療戦略（癌種特異的にRTK阻害薬またはMEK阻害薬）が有効である。 この分類は、BRAF変異の多様性を理解し、個別化医療を推進する上で極めて新規かつ重要な枠組みを提供する。
臨床応用: 本研究の知見は、BRAF変異を有する癌患者の治療戦略に大きな臨床的含意を持つ。
- NSCLC: BRAF非V600変異患者（クラス3が最多）において、EGFR-TKIやMEK阻害薬単独または併用療法の合理的な根拠を提供する。
- 大腸癌: クラス3 BRAF変異を有する患者に対する抗EGFR抗体（cetuximab/panitumumab）の反応性を予測する上で有用である。
- メラノーマ: クラス3 BRAF変異とNRAS/NF1共変異を有する患者に対しては、MEK阻害薬（trametinib/cobimetinib）が有効な治療選択肢となる。
- 分子診断の重要性: BRAF変異が報告された際に、「非V600」と一括するのではなく、クラス2とクラス3を区別する分子診断の重要性が強調される。これにより、患者ごとに最適な治療法を選択することが可能となる。
- 新規RAF阻害薬開発: 後続のpan-RAF阻害薬（belvarafenib、naporafenib、lifirafenib）の開発と、本研究で確立されたクラス分類との整合性が示唆される。
残された課題: 今後の検討課題として、以下の点が挙げられる。
- lifirafenibやnaporafenibなどのクラス2/3対応pan-RAF阻害薬の臨床効果の検証。
- RTK阻害薬とMEK阻害薬の併用療法の最適化と毒性管理。
- クラス3 BRAF変異に加えて、ERBBやFGFR融合遺伝子など、さらなる次層ドライバー変異の存在検証。
- クラス3 BRAF変異体に特異的なRAS-GAP（NF1）回復薬やSOS1/SHP2阻害薬の有効性の評価。
- BRAF同時遺伝子異常（増幅、融合）がクラス分類に与える影響の解明。 本論文以降、「BRAF変異＝V600Eと同等扱い」という単純化は淘汰され、クラスを考慮した精密医療がNSCLC、大腸癌、メラノーマにおいて標準化されつつある。
方法
本研究では、BRAF変異の機能的分類と治療感受性を評価するため、多岐にわたる実験手法が用いられた。
BRAF変異アレルと細胞株の評価: 16種のキナーゼ機能不全/キナーゼ不活性変異を含む31種のBRAF変異アレルを、HEK293細胞、NIH3T3細胞、およびHRAS/NRAS/KRAS三重ノックアウト「RAS-less」マウス胚線維芽細胞（MEF）に発現させた。これらの細胞において、RAS-GTPレベル、リン酸化MEK（p-MEK）、リン酸化ERK（p-ERK）、およびサイクリンD1の発現を測定し、ERKシグナル伝達の活性化と細胞増殖への影響を評価した。特に、RAS-less MEF細胞では、BRAF変異によるMEK/ERK活性化のRAS依存性を確認した。NIH3T3細胞では、血清飢餓によるRAS活性低下とEGF刺激によるRAS活性化に対する応答性を、野生型BRAF、クラス1、クラス2、クラス3 BRAF変異体間で比較した。
遺伝子ノックダウンとレスキュー実験: SK-MEL-208細胞（BRAF G466E/HRAS Q61Kメラノーマ）およびH1666細胞（BRAF G466V NSCLC）において、shRNAを用いてBRAFをノックダウンし、ERK活性化と細胞増殖への影響を評価した。その後、低活性BRAF変異体を導入するレスキュー実験を行い、ERKシグナル伝達と細胞増殖の回復を確認した。
タンパク質間相互作用の解析: 共免疫沈降法を用いて、クラス3 BRAF変異体（D594G、G466V/E）とRAS-GTPの結合親和性、および野生型CRAFとのヘテロダイマー形成を評価した。これにより、クラス3 BRAF変異がCRAFのRAS媒介性活性化を増幅するメカニズムを解析した。
ERKフィードバック阻害の評価: ERK阻害薬SCH772984を用いてERK媒介性ネガティブフィードバックを解除し、RAS-GTPおよびp-MEKレベルの変化をクラス1、クラス2、クラス3 BRAF変異細胞で比較した。これにより、クラス3 BRAF変異がERK出力増強にRAS活性の維持が必須であること、およびERKフィードバックがRASを抑制することで自己制限的になることを検証した。
共存遺伝子異常の解析: Memorial Sloan Kettering Cancer Center（MSKCC）のMSK-IMPACTデータおよびcBioPortalから得られた24,000例のヒト腫瘍のシーケンスデータを解析した。BRAF変異のクラスと、NF1、KRAS、NRAS、HRAS変異の共存パターンを癌種（メラノーマ、NSCLC、大腸癌）別に分析し、クラス3 BRAF変異腫瘍におけるRAS活性化の遺伝学的背景を明らかにした。このデータ収集と解析には、Cheng et al. JMolDiagn 2015で報告されたMSK-IMPACTアッセイが用いられた。
RTK阻害薬の治療効果検証: NSCLCおよび大腸癌の患者由来異種移植モデル（PDX）および細胞株異種移植モデルを用いて、EGFR、MET、FGFRなどのRTK阻害薬がクラス3 BRAF変異腫瘍に対して示す治療効果を検証した。具体的には、H1666細胞（BRAF G466V NSCLC）に対するEGFR阻害薬erlotinibの効果、KMS-11細胞（BRAF G466V）に対するFGFR阻害薬の効果、および大腸癌クラス3 BRAFモデルに対する抗EGFR抗体（cetuximab/panitumumab）の有効性を評価した。また、メラノーマのクラス3 BRAF + NRAS変異モデルにおけるRTK阻害薬とMEK阻害薬の効果も比較した。
統計解析: 結果は平均値 ± 標準偏差（mean ± s.d.）で示された。細胞実験は少なくとも3回繰り返された。細胞増殖アッセイにおけるIC50値はGraphPad Prism 6を用いて計算された。共存遺伝子異常の頻度比較には対応のあるt検定が用いられた。PDX研究では、腫瘍サイズ測定により薬物応答をモニターし、群間比較には対応のないt検定が用いられた。