- 著者: Isidro Cortés-Ciriano, Jake June-Koo Lee, Ruibin Xi, Dhawal Jain, Youngsook L. Jung, Lixing Yang, Dmitry Gordenin, Leszek J. Klimczak, Cheng-Zhong Zhang, David S. Pellman, PCAWG Structural Variation Working Group, Peter J. Park, PCAWG Consortium
- Corresponding author: Peter J. Park (Department of Biomedical Informatics, Harvard Medical School, Boston, MA, USA)
- 雑誌: Nature Genetics
- 発行年: 2020
- Epub日: 2020-02-05
- Article種別: Original Article
- PMID: 32025003
背景
Chromothripsis (染色体破砕) は、単一の破局的イベントで染色体の特定領域に膨大かつクラスター化した構造変異 (SV) が生じる現象であり、2011年にStephens et al.により初めて報告された。従来、腫瘍形成は漸進的な変異蓄積モデルが主流と考えられていたが、chromothripsisは数回の細胞分裂以内に数百の再編成が蓄積する急速なゲノム進化機構を提示した。この現象は多様な組織起源の原発腫瘍で研究されており、同様の染色体断片のランダムな結合は生殖細胞系列でも観察されている (Kloosterman et al. 2011)。
chromothripsisの発生メカニズムについては、異常な核構造であるマイクロ核内での単一染色分体の断片化とその後の再結合 (Zhang et al. 2015)、およびテロメア危機時の二動原体染色体の断片化 (Maciejowski et al. 2015) などが実験的に示されてきた。初期のSNPアレイベースのコピー数 (CN) オシレーション検出では、その頻度は1.5〜5%と推定されていた (Kim et al. 2013, Cai et al. 2014)。しかし、全ゲノムシーケンス (WGS) ベースの研究では、脂肪肉腫で54% (Behjati et al. 2017)、膵癌で60〜65% (Notta et al. 2016)、食道腺癌で32% (Nones et al. 2014)、黒色腫で38% (Network et al. Cell 2015) といった高頻度が報告され、従来の推定値を大幅に上回る可能性が示唆された。
これらの研究は特定の癌種に限定されており、chromothripsisがこれらの腫瘍の特異な生物学を反映した例外的な現象なのか、あるいはその頻度が一般的に過小評価されているのかは未解明であった。また、pan-cancer規模での正確な頻度、多様な形態、発生機構、および臨床的帰結については、包括的な解析が不足していた。特に、WGSデータを用いた高解像度解析により、より複雑なchromothripsisパターンを検出する能力が向上したため、従来の低解像度データでは見逃されていたイベントの全体像を把握する必要があった。本研究は、この知識のギャップを埋めることを目的としている。
目的
本研究の目的は、PCAWG Consortiumが収集した38癌種2,658症例の全ゲノムシーケンス (WGS) データを用いて、新規開発した検出ツールShatterSeekを適用し、chromothripsisの包括的な解析を行うことである。具体的には、以下の点を明らかにすることを目指した。
- 癌種別頻度と特徴の解明: chromothripsisの癌種別頻度、サイズ、ゲノム分布、および関与する染色体の数を正確に推定すること。これにより、chromothripsisが特定の癌種に偏って発生するのか、あるいは広範な癌種にわたって普遍的な現象であるのかを明らかにする。
- 修復機構シグネチャの同定: chromothripsisイベントに関連するDNA修復機構（非相同末端結合 (NHEJ)、代替的末端結合 (alt-EJ)、マイクロホモロジー媒介性ブレーク誘発複製 (MMBIR) など）のシグネチャを解析すること。これにより、chromothripsisの発生に関わる分子メカニズムの多様性を理解する。
- 発癌遺伝子増幅と腫瘍抑制遺伝子欠失への寄与: chromothripsisが発癌遺伝子の増幅（特にdouble minute形成）および腫瘍抑制遺伝子の欠失にどのように寄与しているかを評価すること。これにより、癌のドライバー変異形成におけるchromothripsisの役割を定量化する。
- 倍数体化およびTP53変異との関連: ゲノムの倍数体化 (aneuploidy) およびTP53遺伝子変異とchromothripsisの発生との関連性、およびそれらのイベントの順序関係を明らかにすること。これにより、これらの主要なゲノム不安定性イベント間の相互作用を解明する。
- 臨床的意義の評価: chromothripsisの存在が患者の予後と相関するかどうかを検討し、臨床的バイオマーカーとしての可能性を探ること。これにより、chromothripsisが診断や治療戦略に与える影響を評価する。
これらの解析を通じて、chromothripsisがヒト癌のゲノム進化において果たす役割をより深く理解し、その臨床的意義を確立することを目指した。
結果
chromothripsis頻度の大幅な上方修正: ShatterSeekを用いた解析により、high-confidence chromothripsisイベントが29% (734/2,543症例) で同定された。low-confidenceコールを含めると、その頻度は40%に増加した。特に、ほぼ二倍体 (diploid) の腫瘍に限定したcanonicalイベントの頻度は、神経膠芽腫で50% (n=68 patients)、肺腺癌で40% (n=100 patients) に達し、従来の推定値 (1.5〜5%) を大幅に上回ることが判明した。これは、WGSデータと高感度なSV検出アルゴリズム、および洗練された基準を用いることで、より正確な推定が可能になったことを示している。
癌種別頻度とゲノム分布の多様性: chromothripsisの頻度は癌種間で著しく異なり、脂肪肉腫では100% (n=12 patients)、骨肉腫では77% (n=26 patients) の症例でhigh-confidence chromothripsisが認められた。黒色腫、神経膠芽腫、肺腺癌でも50%を超える高頻度で検出された (Fig 1c)。対照的に、甲状腺腺癌 (3.3%, n=30 patients)、慢性リンパ性白血病 (1.2%, n=86 patients)、pilocytic astrocytoma (0%, n=78 patients) では低頻度であった。腎細胞癌では染色体3および5に、脂肪肉腫では染色体12にchromothripsisイベントが濃縮される傾向が確認された。
WGSとSNPアレイ間の頻度乖離の原因解明: 従来のSNPアレイベースの推定値との乖離を理解するため、前立腺腺癌109例のデータを用いて詳細な比較を行った。先行研究 (Fraser et al. 2017) ではShatterProofを用いて21%の頻度であったが、本研究のCNおよびSVコールを同じアルゴリズムに適用すると、頻度は45% (n=49 patients) に倍増した。これは、以前のSV検出方法の感度が低かったことが主な原因であることを示唆している。ShatterSeekを適用することで、さらに11例が追加され、合計で55% (60/109 patients) の症例でchromothripsisが検出された。ShatterSeekは、より複雑なCN振動パターンやinterchromosomal SVを組み込むことで感度を向上させ、ブレークポイント相同性に関する追加基準を課すことで特異性を高く維持している。膵癌76例では、ChromALとShatterSeekの間で54%の症例で完全に一致した。
複数染色体の関与とイベントの複雑性: chromothripsisイベントの約40%は単一染色体に限定されていたが、骨肉腫では61%の症例で5つ以上の染色体に波及していた (n=26 patients)。極端な例では、6つの染色体にわたる単一のchromothripsisイベントも検出された (Fig 2b)。これは、マイクロ核内での複数染色体の同時断片化や、非相互転座を経た染色体の断片化に起因する可能性が考えられる。chromothripsisイベントのサイズと複雑性は非常に多様であり、一部の癌種ではブレークポイントの数が2桁も異なることが示された (Supplementary Fig. 1c)。
倍数体化との関連: ロジスティック回帰分析の結果、ploidyが2.5以上の腫瘍では、diploid腫瘍と比較してchromothripsisのオッズが平均1.5倍 (95% CI 1.20-1.85, p<10⁻³) 高いことが示された。イベントの順序を推定可能な194例中、74%で倍数体化の後にchromothripsisが発生しており、倍数体化がchromothripsisの発生を促進する要因である可能性が示唆された。
TP53変異との関連: 不活性化TP53変異を有する腫瘍では38% (n=614 patients) がchromothripsisを示したのに対し、TP53野生型腫瘍では24% (n=1929 patients) であった (Fig 2e)。癌種を補正したロジスティック回帰分析では、TP53変異を有する腫瘍におけるchromothripsisのオッズ比は1.54 (95% CI 1.21-1.95, p<10⁻³) であった。しかし、chromothripsis症例の60%はTP53変異もMDM2増幅も有しておらず、p53非依存的な機構も存在することが示された。
DNA修復機構のシグネチャ: canonical chromothripsisイベントの55%では、非相同末端結合 (NHEJ) または代替的末端結合 (alt-EJ) と一致する修復シグネチャのみが検出された。32%のイベントでは、2つ以上のブレークポイントジャンクションに短いマイクロホモロジー (0〜6 bp) と、影響領域内の遠隔部位にマッピングされる10〜500 bpの短いテンプレート挿入が同時に存在し、マイクロホモロジー媒介性ブレーク誘発複製 (MMBIR) またはalt-EJの関与が示唆された。約5%のcanonicalイベントはLOHを示さず、CNが2〜3の間で振動し、MMBIRによるchromoanasynthesisと判断された (Fig 3)。このタイプのイベントでは、CN 3のセグメントの平均サイズは45 kbであった。
Kataegisとの共存: 黒色腫サンプルを除外した後、chromothripsisを有する734腫瘍のうち28%がchromothripsis領域内に少なくとも5つのAPOBEC誘導変異クラスターを示し、9.3%が20以上の変異からなるkataegisを示した。全体的な共存頻度は高くなかった。脂肪肉腫の高度増幅領域では、VAF 0.01〜0.1のAPOBEC誘導変異が検出され、neochromosomeの後期形成を示唆した (Supplementary Fig. 4e)。
発癌遺伝子増幅への寄与: 15症例 (chromothripsis症例の2%) で、double minuteに特徴的なCN振動 (CN≤4とCN≥10間の振動) が検出され、MDM2 (4例) やCDK4 (4例) などの既知の癌ドライバー遺伝子が含まれていた。オンコジーンを含むfocal amplification (CN≥4かつ<6 Mb) のうち、11.1% (low-confidenceコールを含めると20.5%) がchromothripsis領域にマッピングされた。これにはCCND1 (25 tumors)、CDK4 (25 tumors)、MDM2 (23 tumors)、SETDB1 (23 tumors)、ERBB3 (11 tumors)、ERBB2 (11 tumors)、MYC (10 tumors)、MYCN (5 tumors) などの遺伝子が含まれる (Supplementary Table 2)。
腫瘍抑制遺伝子欠失への寄与: chromothripsisは、腫瘍抑制遺伝子欠失の2.1%およびDNA修復遺伝子欠失の1.9%を媒介していた。これにはMLH1 (301腫瘍中9例)、PTEN (358腫瘍中12例)、BRCA1 (154腫瘍中8例)、BRCA2 (270腫瘍中7例)、APC (201腫瘍中9例)、SMAD4 (403腫瘍中10例)、TP53 (614腫瘍中8例) などが含まれる (Fig 5a)。28例では、chromothripsisと点変異の組み合わせにより両アレルが不活化されていた。胆管癌症例では、MLH1の一方のアレルがchromothripsisにより欠失し、もう一方のアレルがプロモーターの過メチル化によりサイレンシングされ、ミスマッチ修復 (MMR) 欠損表現型を呈していた。
考察/結論
本研究は、PCAWGコンソーシウムの広範なWGSデータ解析を通じて、chromothripsisがヒト癌ゲノム形成において従来推定を大幅に上回る頻度 (29-40%) で生じる普遍的な変異機構であることを明らかにした。ShatterSeekという新規ツールは、多染色体関与、部分的なCN振動、複製関連イベントを含む多様なchromothripsis形態を高感度で捕捉することを可能にし、この現象の異質性をこれまで以上に詳細に解明した。
先行研究との違い: これまでの研究では、chromothripsisの頻度はSNPアレイデータに基づき過小評価されてきたが、本研究はWGSデータと改良されたSV検出アルゴリズムを用いることで、その頻度を大幅に上方修正した。また、TP53変異との関連が強調されてきた先行研究と異なり、本研究ではchromothripsis症例の60%がTP53野生型で発生することを示し、p53非依存的な機構（複製ストレス、テロメア危機、BFBサイクルなど）の重要性を提起した。
新規性: 本研究で初めて、pan-cancer規模でchromothripsisの包括的なスペクトルと癌種別頻度を正確に推定した。また、MMBIRやalt-EJを含む複製関連メカニズムがchromothripsisの形成や修復に大きく関与していることを新規に示唆した。特に、MDM2やCDK4などの発癌遺伝子増幅の11.1%（low-confidence含め20.5%）がchromothripsis領域にマッピングされること、およびMLH1、PTEN、BRCA1/2などの腫瘍抑制遺伝子欠失の2.1%を媒介することを初めて定量的に示した。
臨床応用: 本知見は、chromothripsisが癌の診断、予後予測、および治療戦略に影響を与える「actionable molecular event」となり得ることを示唆する。例えば、MDM2、CDK4、MYC、ERBB2などの発癌オンコジーンのdouble minute形成と増幅を媒介するため、CDK4/6阻害薬やMDM2阻害薬など既存の標的治療に対する奏効予測バイオマーカーとして臨床応用が期待される。また、MLH1、PTEN、BRCA1/2などの腫瘍抑制遺伝子欠失を介して、ミスマッチ修復欠損表現型やPARP阻害薬感受性を決定する可能性があり、これらの治療法選択に役立つ。さらに、Davoli et al. Science 2017が報告したアニュプロイディーと免疫浸潤減少・免疫療法奏効低下の関連性を踏まえると、chromothripsisは免疫療法応答予測因子としても有望である。
残された課題: 今後の検討課題として、短リードWGSの限界による複雑なイベントの不完全な再構成、実験的に誘発される小規模なchromothripsisイベントの検出閾値未満の取りこぼしが挙げられる。また、chromothripsisを標的とした治療戦略（CDK4/6阻害薬、PARP阻害薬、免疫チェックポイント阻害薬との組み合わせ）の臨床試験が必要である。さらに、テロメア危機やマイクロ核形成を阻害する予防的介入戦略の開発、およびリキッドバイオプシーを用いたchromothripsisの早期診断への応用も今後の研究方向性として重要である。
方法
データセット: 本研究では、International Cancer Genome Consortium (ICGC) とThe Cancer Genome Atlas (TCGA) のPan-Cancer Analysis of Whole Genomes (PCAWG) Consortiumが収集した、38癌種2,658症例の腫瘍と対応する正常組織の全ゲノムシーケンス (WGS) データを用いた。品質管理基準を満たした37癌種2,543症例のデータが最終解析に採用された。シーケンスリードはBWA-MEM v.0.7.8-r455を用いてヒトゲノムリファレンス (hs37d5) にアラインメントされ、BioBamBam v.0.0.138で重複リードのマーキングとペアになっていないリードの抽出が行われた。
変異検出: 体細胞SNVおよびindelはPCAWGプロジェクトのコンセンサスコールセットが使用された。SNPはHaplotypeCaller v.3.4-46-gbc0262554を用いて同定され、少なくとも10リードでサポートされるSNPのみが保持された。機能的アノテーションにはANNOVARが用いられ、MetaLRスコアにより有害性が予測された非同義体細胞変異が解析対象となった (Wang et al. NucleicAcidsRes 2010)。APOBEC変異は、既報のプロトコルに従い、wGaからCまたはAへの変化、あるいはtCwからGまたはTへの変化として定義された。構造変異 (SV) およびコピー数 (CN) 変動は、PCAWG Structural Variation Working Groupが開発したパイプラインを用いて、4つのアルゴリズム（DELLY v0.6.6, ACEseq v1.0.189, Platypus v0.7.4, ascatNgs v1.5.2, BRASS v4.012, grass v1.1.6, CaVEMan v1.50, Pindel v1.5.7, ABSOLUTE/JaBbA v1.5, SvABA 2015-05-20, dRanger 2016-03-13, BreakPointer 2015-12-22）を併用し、少なくとも2つのアルゴリズムでコールされたSVが採用された。
ShatterSeekの開発とchromothripsis検出: chromothripsis検出のために、新規ツールShatterSeekが開発された。ShatterSeekは、以下の基準に基づいてchromothripsisイベントを同定する。(1) 2〜3つのCN状態間の振動、(2) インターリーブされた（入れ子型ではなく重複型）ブレークポイントクラスター、(3) SVタイプ（deletion-like, duplication-like, head-to-head, tail-to-tail inversions）の均等な分布、(4) 影響領域におけるブレークポイントのランダムな分布、(5) 複数染色体に関与するinterchromosomal SVによる多染色体chromothripsisの検出。信頼度レベルは、少なくとも7つの隣接セグメントで2状態振動を示すものをhigh-confidence、4〜6セグメントのものをlow-confidenceと定義した。Canonicalイベントは、影響領域の60%以上のCNセグメントが2状態振動を示すものと定義された。
既存手法との比較: ShatterProof (Govind et al. 2014) およびChromAL (Notta et al. 2016) との比較解析により、ShatterSeekの感度と特異性が評価された。この比較では、膵癌76例のデータが用いられ、ChromALとShatterSeekの間で54%の症例で完全に一致することが確認された。
修復機構シグネチャ解析: ブレークポイントの相同性解析により、非相同末端結合 (NHEJ)、代替的末端結合 (alt-EJ)、およびマイクロホモロジー媒介性ブレーク誘発複製 (MMBIR) の関与が評価された。これらの機構のシグネチャは、特定のブレークポイントジャンクションにおけるマイクロホモロジーの長さや、テンプレート挿入の有無によって特徴付けられた。
Kataegisとの共存解析: APOBEC誘導変異クラスター (kataegis) とchromothripsisの共存頻度が解析された。黒色腫サンプルを除外した後の734腫瘍のデータセットが用いられた。
TP53変異・MDM2増幅との関連: ロジスティック回帰を用いて、TP53変異およびMDM2増幅とchromothripsisの発生との関連性が評価され、オッズ比 (OR) が算出された。この統計解析により、TP53変異がchromothripsis発生の独立した予測因子であるかどうかが検討された。
倍数体化との順序関係: CN振動パターンから、倍数体化とchromothripsisの発生順序が推定された。この解析は、194例のcanonical chromothripsisイベントにおいて実施された。
発癌遺伝子増幅および腫瘍抑制遺伝子欠失の同定: CNが4以上かつサイズが6 Mb未満のfocal amplificationを、オンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子との関連で解析した。RNA-seqデータはTopHat2およびSTARを用いてアラインメントされ (Dobin et al. Bioinformatics 2013)、HTseq-countでリードカウントが計算され、UQ-FPKM値に正規化された。オンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子のリストはCOSMICおよびIntOGenデータベースから取得された。