- 著者: Johanna Wagner, Maria Anna Rapsomaniki, Stéphane Chevrier, Tobias Anzeneder, Claus Langwieder, Anne Dykgers, Martin Rees, Annette Ramaswamy, Simone Muenst, Savas D. Soysal, Andrea Jacobs, Jonas Windhager, Karina Silina, Maries van den Broek, Konstantin J. Dedes, María Rodríguez Martínez, Walter P. Weber, Bernd Bodenmiller
- Corresponding author: Bernd Bodenmiller (Institute of Molecular Life Sciences, University of Zurich, Switzerland)
- 雑誌: Cell
- 発行年: 2019
- Epub日: 2019-04-11
- Article種別: Original Article
- PMID: 30982598
背景
乳がんは世界中の女性における主要な癌死因であり、その治療には精密医療アプローチの導入が不可欠である。しかし、乳がんの「腫瘍エコシステム」に関する包括的な理解は依然として不足している。腫瘍エコシステムは、癌細胞、浸潤免疫細胞、間質細胞、その他の細胞型、および非細胞性組織成分から構成され、疾患の進行と治療反応を決定する重要な役割を果たすことが知られている Quail et al. NatMed 2013。癌細胞および腫瘍関連細胞は、遺伝的および非遺伝的要因により表現型および機能的に不均一であり、この不均一性が細胞の増殖、生存、浸潤を可能にし、治療効果の差異の根底にあると考えられている。既存の乳がん分類は、主にER、PR、HER2、Ki-67といった腫瘍細胞のバイオマーカー発現に基づいているが、これらの分類だけでは患者の治療反応の多様性を完全に説明するには不十分である。特に、免疫チェックポイント阻害薬 (ICI) は、メラノーマや肺がん患者と比較して乳がん患者での奏効率が限定的であり、トリプルネガティブ乳がん (TNBC) でのみ一部有効性が示されているに過ぎない。この背景には、腫瘍微小環境の複雑な不均一性が存在すると考えられており、特にPD-L1発現細胞の分布、腫瘍関連マクロファージ (TAM) の極性、T細胞疲弊状態といった複合的な因子が関与していることが示唆されている Wherry et al. NatRevImmunol 2015。
これまでのシングルセルゲノム解析やトランスクリプトーム解析では、腫瘍内ゲノム多様性やクローン組成の腫瘍間差異に関する知見が得られていたが、解析された細胞数や腫瘍数が非常に限られていた Nik-Zainal et al. Cell 2012。また、最近のシングルセルRNAシーケンス研究では、乳がん免疫細胞の表現型多様性やエコシステムの一端が示されたものの、大規模な患者コホートでの包括的なプロテオーム解析は未開拓であった Azizi et al. Cell 2018。既存のバルク解析では捉えきれない腫瘍・免疫細胞の個体差 (tumor individuality) やエコシステムの階層化を、単一細胞レベルで網羅的に可視化し、その臨床的意義を解明することが喫緊の課題として残されている。特に、乳がんの腫瘍細胞と免疫細胞の両者がダイナミックに相互作用する「腫瘍エコシステム」としての単一細胞レベルの包括的プロテオームマップは欠落しており、この知識ギャップを埋めることが、より効果的な患者層別化と治療戦略の開発に不可欠である。この領域における包括的なデータが不足しており、精密医療の進展を妨げているのが現状である。
目的
本研究の目的は、144例のヒト原発性乳がんおよび50例の非腫瘍乳腺組織について、質量サイトメトリー (CyTOF) を用いて73種類のタンパク質マーカーを定量し、乳がんの腫瘍および免疫細胞のシングルセルアトラスを構築することである。具体的には、腫瘍細胞の表現型異常と個体差、ならびに免疫細胞組成の多様性を包括的にマッピングする。さらに、PD-L1陽性腫瘍関連マクロファージ (TAM) や疲弊T細胞の出現パターンと、臨床病理学的因子 (grade、ER/PR/HER2、Ki-67) との関連を定量的に評価する。最終的に、腫瘍エコシステムの特徴に基づいた新たな患者層別化の可能性を探索し、精密医療アプローチにおける患者選択に役立つバイオマーカーの特定を目指す。
結果
単一細胞プロテオームアトラスの構築と品質管理: 本研究では、144例のヒト乳がん組織と50例の非腫瘍組織から、合計約2,600万個の単一細胞プロファイルを取得した。内訳は腫瘍パネルで約1,100万細胞、免疫パネルで約1,500万細胞であった。各症例から平均1〜10万細胞が計測され、腫瘍パネルでは17の細胞サブポピュレーション、免疫パネルでは27の免疫細胞型 (T細胞、B細胞、NK細胞、単球、TAM、樹状細胞、好中球、ILCなど) が同定された。UMAPによる低次元可視化では、ER、PR、HER2、Ki-67といった臨床マーカーの連続的な発現変化が明確に示された (Figure 1B, S1M)。CyTOFによるER+、PR+、HER2+、Ki-67+腫瘍細胞の頻度は、病理組織学的免疫組織化学 (IHC) スコアと良好な相関を示し、データ品質の高さが確認された (Figure S1H-S1L)。
腫瘍細胞の表現型異常と個体差: 腫瘍細胞は、正常上皮細胞と比較して、ERの異所性発現やK5/K7の共発現など、明確な表現型異常を示した。これらの異常は特にグレード3の腫瘍で顕著であった (Figure 4B-4H)。腫瘍個体差は非常に大きく、144例の乳がんのうち大多数 (62/144例、43%) で、個々の症例固有の表現型クラスターが腫瘍細胞全体の50%以上を占める「高い表現型優位性 (high phenotypic dominance)」が観察された。これは、単一症例内では腫瘍細胞がほぼ単一の優位な表現型に収束し、症例間でその優位な表現型が大きく異なることを示唆している (Figure 4N)。表現型異常スコアは、グレードが高い腫瘍、ER陰性腫瘍、および予後不良のサブタイプで有意に高かった (p<0.001)。また、表現型異常は低酸素マーカーCA9および増殖マーカーKi-67の発現と正の相関を示した (Spearman r=0.65, p<0.001) (Figure 4I)。CA9+腫瘍細胞の約25%がEMT (epithelial-mesenchymal transition) 表現型を示し、CA9-腫瘍細胞の4%と比較して有意に高かった。
乳がんの免疫細胞浸潤とサブタイプ依存性: 免疫細胞の解析により、乳がんの免疫微小環境の多様性が明らかになった。T細胞と骨髄系細胞が最も豊富な免疫細胞型であり、NK細胞、B細胞、顆粒球などは少なかった (Figure 2A)。ER陽性Luminal A腫瘍は、非腫瘍組織と同様にリンパ系細胞の浸潤が少ない「免疫cold」な環境を示す一方、TNBC、HER2陽性腫瘍、およびER陽性グレード3腫瘍では、CD8 T細胞、CD4 T細胞、Treg、および骨髄系細胞の浸潤が高頻度であり「免疫hot」な環境であった。CD4+FoxP3+Treg、PD-1+CD8 T細胞、HLA-DR+CD38+活性化T細胞の割合は、高グレード腫瘍で有意に増加した (p<0.01) (Figure 2E, 2H)。PD-1+T細胞は、全腫瘍関連T細胞の最大26.6%を占め、非腫瘍組織では稀であった (Figure S2F)。
T細胞疲弊表現型の同定: CD8 T細胞集団の中に、PD-1+TIM-3+LAG-3+CTLA-4+といった複数のチェックポイント分子を共発現する「最終疲弊 (terminally exhausted) 様」サブセットが同定された。このサブセットは主にグレード3のER陰性腫瘍に富化していた (Figure 2D, 2H)。Treg細胞中のPD-1+CD38+CTLA-4+活性化Tregも同様の分布を示し、腫瘍浸潤CD8 Tem/Teff比が低下する腫瘍ほど、これらの免疫抑制性T細胞集団の比率が上昇する傾向が認められた。PD-1陽性T細胞は、全腫瘍関連T細胞の最大26.6%を占め、非腫瘍組織では稀であった (Figure S2F)。ER陰性腫瘍の半数以上 (6 of 10 tumors) で10%以上のT細胞がPD-1を発現していたのに対し、ER陽性腫瘍では12% (16 of 132 tumors) にとどまった (Figure S2G)。PD-1高発現CTLA-4+CD38+T細胞 (T09, T11, T13) はER陰性腫瘍でより高頻度であった。
PD-L1陽性免疫抑制性TAMの同定: 骨髄系細胞の解析により、M2様表現型を示すCD163+PD-L1+CD206+CD38+のTAMサブタイプ (M01クラスター) が同定された。このTAMは、グレード3のER陰性腫瘍で有意に富化しており (p<0.001)、疲弊T細胞との顕著な共起が観察された (Figure 2N)。重要なことに、PD-L1の発現はほぼ全てTAM上に認められ、腫瘍細胞上のPD-L1発現は比較的低頻度であった。これは、免疫チェックポイント阻害薬の反応性予測において、腫瘍細胞のPD-L1ではなくTAMのPD-L1を評価することの重要性を示唆する (Figure 6F)。80%の腫瘍で、少なくとも10%の骨髄系細胞がPD-L1+であった (Figure S2K)。
エコシステムベースの患者階層化: 腫瘍細胞と免疫細胞の組成パターンに基づいた階層的クラスタリングにより、11のエコシステムグループが同定された (Figure 5A)。Luminal A腫瘍は「免疫sparse・正常類似」のエコシステムに分類される傾向があった。一方、Luminal B/HER2陽性腫瘍は「ミックス」されたエコシステムを示し、グレード3のER陰性腫瘍は「PD-L1+TAM+疲弊T細胞」が優位な免疫抑制性のエコシステムに分類された。このエコシステム分類は、既存のIHC4 (ER/PR/HER2/Ki-67) 分類とは独立した情報を提供し、ICI応答を予測する新たな患者層別化の基盤となり得る可能性が示された。特に、腫瘍エコシステムグループTu2は、高い個体差と表現型異常スコア、より多くの増殖細胞、PD-L1+TAM、およびPD-1+T細胞を有していた (Figure 5C-5G)。Tu2グループの腫瘍は、Tu1およびTu3グループと比較して、個体差スコア、表現型異常スコア、Ki-67+細胞頻度、PD-L1+マクロファージ頻度、PD-1+T細胞頻度がいずれも有意に高かった (p<0.001)。
腫瘍と免疫微小環境の相互関係: 腫瘍細胞と免疫細胞間の関係性を評価するため、全細胞表現型クラスターの頻度についてSpearman相関分析を行った。免疫抑制性の表現型であるTreg (T01)、PD-1高発現CTLA-4+CD38+疲弊T細胞 (T09, T11, T13)、およびPD-L1+TAM (M01, M02, M17) は、L4, L5, L6, B1の上皮細胞クラスターと正の相関を示した (Figure 6B)。これらの免疫抑制パターンは、腫瘍の表現型異常、個体差スコア、低酸素状態、および増殖能と有意に相関していた (Figure 6D, Spearman r=0.65, p<0.001)。また、ER陽性細胞の存在量と免疫抑制性TAMおよびT細胞との間にも相関が認められ、エストロゲンシグナルが腫瘍エコシステムを形成する要因であることが示唆された。免疫細胞クラスターのみを用いた階層的クラスタリングにより、3つの腫瘍免疫グループ (TIG1-TIG3) が同定された。TIG2に分類された腫瘍は、Treg、PD-L1+TAM、およびPD-1高発現CTLA-4+CD38+疲弊T細胞が高い頻度で存在し、免疫抑制的な微小環境を特徴としていた (Figure 6E)。免疫蛍光イメージングにより、TIG2腫瘍ではPD-L1+TAMおよびPD-1+CTLA-4+T細胞が腫瘍間質と腫瘍上皮の両方に局在することが確認された (Figure 6F)。TIG2腫瘍は、TIG1およびTIG3腫瘍と比較して、表現型異常スコアが高く (p<0.001)、個体差スコアも高かった (p<0.001) (Figure 6G, 6H)。TIG2腫瘍の61%でEMT表現型 (Ep01, Ep02, Ep16, Ep23-25, Ep32) が、39%でHLA-DR+表現型 (Ep01, Ep37, Ep38) が認められた (Figure 6I)。
考察/結論
本研究は、質量サイトメトリーを用いた大規模な単一細胞プロテオーム解析により、144例の乳がん組織から2,600万個の細胞を解析し、ヒト乳がんの腫瘍および免疫エコシステムの包括的なアトラスを構築した。このアトラスは、乳腺上皮細胞および免疫細胞の広範な表現型多様性、腫瘍細胞の表現型異常、および腫瘍個体差を明らかにし、ホモタイプおよびヘテロタイプな腫瘍-免疫細胞間の関係性を強調することで、エコシステムベースの患者分類を可能にした。
先行研究との違い: これまでのシングルセルRNAシーケンス研究が少数の腫瘍に限定されていたのに対し、本研究は大規模な患者コホート (n=144) を対象とし、タンパク質レベルでの直接的な表現型評価を可能にした点で、これまでの研究とは対照的である。特に、腫瘍細胞の表現型異常と個体差を定量化する新たな計算スコアを導入し、腫瘍エコシステムの不均一性をより詳細に評価できた点は新規性が高い。
新規性: 本研究で初めて、乳がんの腫瘍細胞が非常に高い個体差を示し、単一腫瘍内では特定の表現型が優位となる「表現型優位性」を持つことを明らかにした。また、PD-L1の発現が腫瘍細胞ではなく、主に腫瘍関連マクロファージ (TAM) 上に存在するという重要な知見は、ICI治療におけるPD-L1バイオマーカー評価の戦略に新たな視点を提供する。さらに、疲弊T細胞とPD-L1陽性TAMがグレード3のER陰性腫瘍で共起し、免疫抑制的な微小環境を形成していることを示し、これがICI奏効候補群を定義し得るという臨床的意義の大きい発見である。
臨床応用: 本研究で確立されたエコシステムベースの患者分類は、特にトリプルネガティブ乳がん (TNBC) における免疫療法患者選択のバイオマーカーとして有望である。また、TAM上のPD-L1をターゲットとした抗PD-L1療法の患者層別化戦略にも応用可能である。ER陽性乳がん患者の一部 (Luminal B腫瘍の18%) でもER陰性腫瘍と同様の強いT細胞疲弊パターンが認められたことから、これらの患者も抗PD-1/PD-L1療法から利益を得る可能性がある。これらの知見は、乳がんの精密医療アプローチにおける患者選択と治療戦略の設計に貢献し、臨床現場での応用が期待される。
残された課題: 今後の検討課題として、本研究が横断的データであるため、治療反応や長期的な予後との直接的な関連を検証する必要がある。また、質量サイトメトリーでは空間情報を欠くため、後続のImaging Mass Cytometry研究 (Angelo et al., 2014; Giesen et al., 2014) などにより、細胞の空間的配置と相互作用を詳細に解析することが求められる。さらに、同定されたTAMや疲弊T細胞の機能的検証 (例: TAMのT細胞抑制能、疲弊T細胞の可塑性) が必要である。今後は、本アトラスをリファレンスとしてICI治療コホートで再解析することで、エコシステム分類の予測的価値を実証することが期待される。本研究のlimitationとして、抗体選択による表現型解析のバイアスや、組織解離による細胞表面分子の変化の可能性が挙げられる。
方法
検体と測定: スイス・バーゼル大学病院、チューリッヒ大学病院、およびドイツのPATH (Patients’ Tumor Bank of Hope) バイオバンクから、144例の原発性乳がん組織と50例の非腫瘍乳腺組織 (46例は腫瘍隣接組織、4例は乳房形成術検体) を前向きに収集した。組織は自動システムを用いて単一細胞懸濁液に調製された。これらの細胞と7種類の乳がん細胞株 (MCF-10A, MDA-MB-134-VI, MDA-MB-231, MDA-MB-453, SK-BR-3, ZR-75-1, Fibroblasts) は、質量タグバーコーディング (Zunder et al., 2015) を用いてプールされ、73種類の抗体で染色後、質量サイトメトリー (CyTOF) で同時に解析された。抗体パネルは、免疫細胞に特化した35マーカーの「免疫パネル」 (CD45, CD3, CD4, CD8, CD20, CD56, CD68, CD14, CD15, FoxP3, PD-1, PD-L1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, CD40, CD11c, HLA-DRなど) と、腫瘍細胞に特化した38マーカーの「腫瘍パネル」 (K5, K7, K8-18, E-cadherin, vimentin, ER, PR, HER2, Ki-67, p-S6, cleaved caspase 3など) から構成された。
データ品質管理と前処理: 質量サイトメトリーデータは、Cytobankの.fcsファイル連結ツールで連結され、Normalizerツール (Finck et al., 2013) で正規化された。その後、CATALYST (R/Bioconductorパッケージ) を用いてデバーコードされ、シングルステインポリスチレンビーズを用いてチャネルクロストーク補正が行われた。ガドリニウムベースの造影剤を受けた患者の検体については、ガドリニウム陽性細胞がデータ解析から除外された。バッチ効果の評価には、主成分分析に基づくアプローチが用いられ、オペレーター、バーコーディングプレート、病院、サンプル受領日、輸送時間などの交絡因子によるバッチ効果は検出されなかった (Figure S1F, S1G)。
解析パイプライン: データの次元削減と可視化にはt-SNEアルゴリズム (Van Der Maaten and Hinton, 2008) が使用された。細胞型の定義には、PhenoGraphクラスタリングアルゴリズム (Levine et al., 2015) が適用され、高次元の単一細胞データが42の細胞クラスター (免疫パネル) および45の上皮細胞クラスター (腫瘍パネル) に分割された。これらのクラスターはマーカー発現プロファイルに基づいて細胞型に割り当てられた。
個別腫瘍メトリックの定量: 腫瘍細胞の不均一性を定量化するため、3つの計算スコアが導入された。(1) 表現型異常 (phenotypic abnormality): 非腫瘍上皮細胞の多次元シングルセルデータで訓練されたオートエンコーダー (Goodfellow et al., 2016) を用いて、個々の腫瘍細胞が非腫瘍細胞からどの程度逸脱しているかを平均二乗誤差 (MSE) で定量化した。(2) 腫瘍個体差 (tumor individuality): グラフベースのアプローチを用いて、あるサンプルの細胞が同じサンプルの細胞とどれだけ類似しているか (スコアが1に近い) または他のサンプルの細胞とどれだけ類似しているか (スコアが0に近い) を定量化した。(3) 腫瘍多様性 (tumor richness): 各サンプルにおける各上皮細胞クラスターの頻度を算出し、1%を超えるクラスターの数として定義した。
エコシステム解析と患者階層化: 全上皮細胞、T細胞、および骨髄系細胞クラスターの各サンプルにおける頻度を用いて、階層的クラスタリングにより患者をグループ化した。さらに、ランダムフォレスト分類器を用いて、特定のグループを他のサンプルから区別するクラスターおよびクラスターの組み合わせを特定した。腫瘍細胞と腫瘍宿主細胞間のホモタイプおよびヘテロタイプな関係を系統的に解明するため、全細胞表現型クラスターの頻度についてペアワイズのSpearman相関分析を実施した。
統計解析: 腫瘍組織と非腫瘍対照の比較には、Fisherの正確確率検定またはWilcoxon順位和検定が使用された。エコシステムと臨床パラメータの関連には、カイ二乗検定またはMann-Whitney U検定が使用された。統計的有意性はp<0.05と定義された。