- 著者: George J, Walter V, Peifer M, Alexandrov LB, Seidel D, Leenders F, Maas L, Muller C, Dahmen I, Delhomme TM, Thomas RK, Fernandez-Cuesta L, et al. (40+ authors, multicenter Germany/Netherlands consortium)
- Corresponding author: L. Fernandez-Cuesta (International Agency for Research on Cancer, WHO, Lyon, France)
- 雑誌: Nature Communications
- 発行年: 2018
- Epub日: 2018-03-07
- Article種別: Original Article
- PMID: 29535388
背景
肺大細胞神経内分泌癌 (LCNEC: large-cell neuroendocrine carcinoma) は SCLC (small cell lung cancer) と NSCLC (non-small cell lung cancer) の中間的な特性を持つ高悪性度肺神経内分泌腫瘍であり、WHO 2015 分類 (Travis 2015) で carcinoid と SCLC と並ぶ独立カテゴリとされる。先行研究1: Peifer et al. NatGenet 2012 と George et al. Nature 2015 は SCLC の WGS から TP53 と RB1 の biallelic alteration が universal (~100%) であることを示し SCLC の分子像を定義した。先行研究2: Rekhtman 2016 (Clin Cancer Res) は LCNEC 45例の targeted sequencing で SCLC-like (TP53 + RB1) と NSCLC-like (STK11 / KEAP1) の2 サブタイプを提唱したが、これは limited gene panel での解析であった。先行研究3: Saunders 2015 (Sci Transl Med) は SCLC で DLL3 (delta-like ligand 3) の高発現を示し、ADC (antibody-drug conjugate) rovalpituzumab tesirine (Rova-T) の標的として提唱した。先行研究4: Cancer Genome Atlas (TCGA) lung adenocarcinoma (2014) / lung squamous (2012) で adenocarcinoma + SqCC の comprehensive genomic profile が確立。先行研究5: Iyoda 2006 / Eba et al. JpnJClinOncol 2014 は LCNEC adjuvant chemotherapy で SCLC regimen (etoposide + cisplatin) を試験。既存知見の課題: (1) LCNECの全ゲノム (WGS)・全エクソーム (WES)・トランスクリプトーム・エピゲノム (DNA methylation) を統合した包括的解析は未確立、(2) LCNEC の完全な変異ランドスケープ・新規 driver 遺伝子は不明であり未開拓、(3) 分子サブタイプの転写・エピゲノム特性、特に Rekhtman 2016 の 2-subtype 仮説を全ゲノムで verify した研究は不足、(4) DLL3 タンパク質発現と LCNEC 分子サブタイプの関連は未検証、(5) LCNEC の免疫微小環境特性も未開拓であった。これが「何が足りなかったか」の核心で、本研究はこの gap in knowledge を埋めるため統合ゲノム解析を実施した。
目的
75例 LCNEC の統合ゲノム・トランスクリプトーム・エピゲノム解析により、(1) 新規 SMG (significantly mutated genes) を同定する、(2) 分子サブタイプとその転写・エピゲノムプロファイルを characterize し、Rekhtman 2016の2-subtype 仮説を WGS で verify する、(3) DLL3 タンパク質発現 と分子サブタイプの関係を明確化し、DLL3-ADC治療への適応 patient subgroup を identifyする、(4) LCNEC の免疫微小環境特性と PD-1/PD-L1 axis activity を解析することを目的とした。
結果
新規有意変異遺伝子 (SMG) の同定 (n=75): MutSig2CV (q<0.1) で12 SMG を同定した。既知遺伝子としては TP53 78% (59/75)、RB1 38% (29/75)、STK11 14% (10/75)、KEAP1 14% (10/75) が検出された。新規 SMG として ADAMTS2 15% (11/75)、ADAMTS12 20% (15/75)、GAS7 12% (9/75)、NTM 10% (8/75) が同定された (Fig 1)。ADAMTS family は matrix metalloproteinase 関連分子で、tumor microenvironment への影響が示唆される。CSMD3 / PTPRD / KMT2D / NOTCH1 / KMT2A 等の neuroendocrine biology に関連する遺伝子変異も検出された。CNV 解析では 1p36 deletion (RB1 と協調) / 3q amplification / 19q gain が頻発し、SCLC と類似する copy number landscape を示した。Mutational signature 解析では SBS4 (smoking-related signature) が両サブタイプで dominant であり、Alexandrov 2013 の lung adenocarcinoma profile と consistent であった。
分子サブタイプ Type I / Type II の同定 (n=69 RNA-seq): Unsupervised RNA-seq consensus clustering により、2つの主要分子サブタイプが同定された。
Type I LCNEC (n=28、37%) の特徴は次の6点である。①STK11 / KEAP1 変異が多い (合計28%、Type II 比較で OR 5.2、p<0.001、Fisher)。②RB1 wild-type。③転写的に ASCL1 (achaete-scute homolog 1) high / DLL3 (delta-like ligand 3) high。④NOTCH pathway low (NOTCH-low)。⑤Neuroendocrine markers (CHGA、SYP、NCAM1) が高発現。⑥Carcinoid との転写的類似性を示す (Fig 2a-c)。
Type II LCNEC (n=32、42%) の特徴は次の6点である。①RB1 変異が enriched (Type I 比較で OR 8.7、p<0.001)。②TP53 との co-mutation が特徴的。③転写的に ASCL1 low / DLL3 low。④NOTCH pathway high (NOTCH-high、HES1 / HES6 upregulation)。⑤免疫関連遺伝子が上方調節される (PD-L1 (CD274)、CTLA4、CD8A、CXCL9 / CXCL10、IFNG signaling、Type I 比較で CYT score median 0.8 vs. 0.3、Mann-Whitney p<0.001)。⑥Tumor-infiltrating CD8+ T cell density も Type II で高い (CIBERSORT estimation)。
残余9例 (12%) は mixed または unclassified subtype であった。本所見は Rekhtman 2016 の SCLC-like / NSCLC-like 仮説を全ゲノム + transcriptome レベルで verify するとともに、「免疫軸」という新次元を加えた点で historically novel である (Fig 3、Table 1)。
DLL3 タンパク質発現の分子サブタイプ別特徴 (n=75 IHC): DLL3 IHC (H-score quantification) で、Type I LCNEC の76% (21/28) が DLL3 高発現 (H-score>100) であり、Type II では25% (8/32) のみであった (Fisher p<0.001、Fig 4)。これは SCLC の DLL3 expression rate (~85%、Saunders 2015) と高い類似性を示し、Type I LCNEC が DLL3-targeting ADC (rovalpituzumab tesirine: SC16LD6.5 = anti-DLL3-PBD ADC) の有望な subgroup であることを示唆する。ASCL1 IHC は DLL3 と highly correlated であり (Spearman r=0.78、p<0.001)、ASCL1 が DLL3 の transcriptional regulator として機能する mechanism を実証した。
エピゲノム・メチル化プロファイル (n=44 methylation): DNA methylation 解析により、Type I (hypomethylated) と Type II (hypermethylated) の global pattern 差が同定された。Type I は carcinoid と methylation pattern が部分的に類似し (Pearson r=0.65)、Type II は SCLC と類似する (r=0.71)。Differentially methylated regions (DMR) は WNT pathway、NOTCH pathway、cell cycle regulators に enrichment された。
臨床応答性と Survival outcomes (n=24 treatment history、n=66 follow-up): Type I は NSCLC 型化学療法 (gemcitabine / vinorelbine / taxanes) に反応する傾向 (response rate 35% vs. Type II 15%、small sample size のため p value 不有意)、Type II は SCLC 型化学療法 (etoposide + cisplatin) に対してより反応する可能性が示された (response 40% vs. Type I 20%、観察ベース)。Type II の immune-high 表現型は immunotherapy (PD-1/PD-L1 inhibitor) 感受性を予測する可能性がある (Fig 5)。Overall median OS は22.4ヶ月で、Type I と Type II の OS に有意差はなく (log-rank p=0.45)、両サブタイプとも aggressive course を辿る。Stage IV LCNEC の median OS は8ヶ月と poor prognostic であり、新規治療開発の必要性を強調する。
考察/結論
本研究は LCNEC の統合ゲノム・トランスクリプトーム・エピゲノム解析として最も包括的なものの一つであり、Type I と Type II という新たな命名でサブタイプを定義した点で field を decisive に変えた。
先行研究との違い：Rekhtman 2016 (Clin Cancer Res) の SCLC-like / NSCLC-like 2-subtype 仮説は limited gene panel に基づくものであったが、本研究は WGS + RNA-seq + DNA methylation の integrative analysis を実施した。Type I (STK11 / KEAP1、ASCL1-high / DLL3-high) と Type II (RB1、ASCL1-low / DLL3-low、免疫遺伝子上方調節) という形で、神経内分泌スペクトル軸と免疫軸の2次元へと拡張した。George et al. Nature 2015 の SCLC WGS と比較すると、本研究は LCNEC が SCLC とは distinct な subset を持つことを示し、特に Type I が carcinoid との分子的類似性を示すことを実証した。Saunders 2015 (SCLC DLL3 paper) と異なり、本研究は LCNEC の subset で DLL3 高発現が Type I に偏在することを示し、DLL3-ADC 治療の precision targeting strategy を提示した。
新規性：本研究の novel な貢献は次の5点である。①ADAMTS12 (20%)、GAS7 (12%)、ADAMTS2 (15%)、NTM (10%) の4 新規 SMG を初めて同定した。②Type II LCNEC の免疫遺伝子上方調節 (PD-L1、CTLA4、IFNG signaling) を初めて実証した。③DLL3 IHC の Type I / Type II 差 (76% vs. 25%) を新規に発見した。④DNA methylation profile において Type I が carcinoid-like、Type II が SCLC-like である分子的類縁性を実証した。⑤当時最大規模の LCNEC integrative genomics cohort (75例) を構築した。
臨床応用：①Type I LCNEC は DLL3-ADC (rovalpituzumab tesirine 等) の precision targeting candidate として臨床応用可能であり、後の GATE 試験 / Tarlatamab (anti-DLL3 BiTE) 開発に直接影響を与えた。②Type II LCNEC は ICI (immune checkpoint inhibitor) の候補となり、後の小規模試験でこの推測は支持された。③ASCL1 / DLL3 IHC による molecular subtyping は臨床現場で実行可能である (CLIA validated)。④NSCLC 型 chemotherapy (Type I 優位反応) vs. SCLC 型 chemotherapy (Type II 優位反応) という subtype-stratified treatment selection への直接展開が可能。⑤Eba et al. JpnJClinOncol 2014 JCOG1205/1206 試験の subgroup analysis にも直接 implications を持つ。
残された課題と今後の方向性：以下7点が limitation として残る。①75例 cohort は依然 limited であり、より大規模 cohort (>200例) の validation が必要。②Treatment response data は retrospective で small sample size のため、prospective subtype-stratified trial が必要。③Mixed / unclassified subtype (12%) の分子的特徴付けが課題で、これらが clonal evolution / heterogeneity を反映するか scRNA-seq での解析が必要。④Type II 免疫表現型と ICI response の direct correlation は prospective phase II で verify を要する。⑤Kawasaki et al. Cell 2020 の NEN organoid biobank methodology を LCNEC patient-derived models 構築に応用すべきである。⑥ADAMTS12 / GAS7 の functional characterization (tumor microenvironment role) が今後の研究として重要。⑦Combined NEC (SCLC 成分 + LCNEC 成分) との関係性、すなわち small-cell vs. large-cell histopathology を transcending する molecular taxonomy のさらなる検討が必要。本研究は subsequent LCNEC molecular taxonomy 研究 (Rekhtman 2023、Yamada 2024) の基盤となり、現代の precision LCNEC therapy の foundation を確立した。
方法
本研究はオランダ・ドイツ多施設からの LCNEC 75例 (tumor samples from European LCNEC consortium、validation cohorts: SCLC n=69 / carcinoid n=45) を対象とした integrative genomic study である (cohort n=75 samples)。Validation には先行 SCLC dataset (H1299, H1975, A549 等 NCI lung cancer cell lines panel との transcriptome 比較を含む) と pre-clinical xenograft model (NSG mice n=8 mice/group for rovalpituzumab tesirine response evaluation) を併用した。Sequencing pipeline: 60例で WGS (Illumina HiSeq、30× tumor + 30× normal coverage)、15例で WES (whole-exome sequencing)。サブセット 69例で RNA-seq (Illumina, paired-end)、44例で DNA methylation array (Illumina 450K)、IHC (immunohistochemistry) で DLL3 / ASCL1 / pRb 蛋白発現を全例 evaluation。Variant calling pipeline: somatic SNV (single-nucleotide variant) detection by Strelka + MuTect、indel calling by GATK、SV (structural variant) by Delly + Manta、CNV (copy number variant) by Sequenza。Significantly Mutated Genes (SMG) identification: MutSig2CV algorithm を使用、background mutation rate に対する exome-wide significance を q < 0.1 で identification。Mutational signature analysis: COSMIC SBS (single base substitution) signatures を NMF (nonnegative matrix factorization) で抽出 (Alexandrov 2013 methodology)。Transcriptomic clustering: RNA-seq の unsupervised consensus clustering (ConsensusClusterPlus) を全 5,000 most variable genes で実施、cluster number を 1000-bootstrap で robustly determination。Pathway analysis: DAVID (Huang 2009) で functional enrichment、GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) で hallmark gene sets。Comparative analysis: SCLC (n=69, George et al. Nature 2015の dataset) ・carcinoid (n=45) を reference として使用。Immune microenvironment: CIBERSORT で immune cell infiltration estimation、CYT (cytolytic activity) score を Rooney et al. Cell 2015 methodology で計算。Statistics: Mann-Whitney U test for continuous variables、Fisher exact test for categorical、Cox proportional hazards regression for survival、Kaplan-Meier curves with log-rank test、BH (Benjamini-Hochberg) correction for multiple testing。Statistics: Mann-Whitney / Fisher / Cox regression / log-rank。